本申请涉及微生物培养的，特别是涉及一种氘代菌株的驯化方法。
背景技术：
1、微生物驯化是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法。通常的手段是利用摇瓶培养方式对微生物进行多次传代，在微生物传代过程中增加其生长压力，通常是某些化学因子，最终得到能够耐受高生长压力的菌种。
2、3-酮脂酰-acp还原酶(fabg)是细菌脂肪酸合成途径ii的关键酶，由于该途径的系列酶高度保守，因此是抗菌药物设计的理想靶点。氘代fabg即将该蛋白酶上的c-h替换为c-d，基于氘动力学同位素效应起到增强其在结构生物学研究中的表征信号的作用。因此，通过微生物驯化方法选育出氘代菌株，并成果合成氘代fabg，将为细菌脂肪酸代谢研究、抗菌药物设计研制提供一定的研究基础。
3、氘代菌株的驯化通常是将待筛菌株依次接种于水的氘代率逐级递增的培养基中进行摇瓶培养。但是，这种驯化方法得到的氘代菌株只能耐受只有水被氘代的重水环境，而不能耐受水、无机盐和葡萄糖均被氘代的全氘代环境，并且在人工驯化过程中非常容易染菌。
技术实现思路
1、基于此，有必要提供一种耐重水菌种的筛选方法，以克服传统的菌种驯化方式得到的氘代菌株只能耐受只有水被氘代的重水环境，而不能耐受水、无机盐和葡萄糖均被氘代的全氘代环境，并且在人工驯化过程中非常容易染菌的问题。
2、本申请的上述目的是通过如下技术方案进行实现的：
3、本申请第一方面，提供一种氘代菌株的驯化方法，包括以下步骤：
4、对大肠杆菌工程菌株进行活化和扩大培养，得到第一菌液；
5、将所述第一菌液依次接种于微液滴微生物培养系统的第一驯化培养基和第二驯化培养基进行适应性进化培养，得到所述氘代菌株；
6、其中，所述第一驯化培养基为lb培养基，所述第二驯化培养基包括m9培养基或改良m9培养基；
7、所述第二驯化培养基中的水、无机盐和葡萄糖的氘代率不低于所述第一驯化培养基中的水的氘代率。
8、在其中一个实施例中，所述第一驯化培养基中的水的氘代率为0％～60％，所述第二驯化培养基中的水、无机盐和葡萄糖的氘代率为60％～100％。
9、在其中一个实施例中，所述改良m9培养基含有如下浓度的组分：
10、
11、在其中一个实施例中，对大肠杆菌工程菌株进行活化和扩大培养，还包括以下步骤：
12、将所述大肠杆菌工程菌株接种于第一lb培养基中进行活化，制备种子液；
13、将所述种子液接种于所述第一lb培养基中进行摇瓶培养，制备第一菌液；
14、其中，所述第一菌液的od600为0.5～1.5；
15、所述第一lb培养基中的水的氘代率为0％。
16、在其中一个实施例中，将所述第一菌液依次接种于微液滴微生物培养系统的第一驯化培养基和第二驯化培养基进行适应性进化培养，包括以下步骤：
17、将所述第一菌液接种于所述第一驯化培养基进行第一适应性进化培养，得到进化菌株；
18、对所述进化菌株进行扩大培养，得到第三菌液；
19、将所述第三菌液接种于所述第二驯化培养基进行第二适应性进化培养，得到所述氘代菌株。
20、在其中一个实施例中，将所述第一菌液接种于所述第一驯化培养基进行第一适应性进化培养，包括以下步骤：
21、将所述第一菌液、所述第一lb培养基以及第二lb培养基分别置于所述微液滴微生物培养系统的进样瓶中；
22、在所述微液滴微生物培养系统中设置氘代率呈梯度递增的多个所述第一驯化培养基，并使所述微液滴微生物培养系统运行第一适应性进化培养；
23、在所述第一适应性进化培养中，实时监测微液滴中的菌液的od600以形成第一生长曲线图，并根据所述第一生长曲线图筛选出所述进化菌株；
24、其中，所述第二lb培养基中的水的氘代率为100％。
25、在其中一个实施例中，对所述进化菌株进行扩大培养，包括以下步骤：
26、将所述进化菌株依次接种于第三lb培养基和第一m9培养基中进行摇瓶培养，得到所述第三菌液；
27、其中，所述第三菌液的od600为0.5～1.5；
28、所述第三lb培养基中的水的氘代率为60％；
29、所述第一m9培养基为m9培养基或改良m9培养基，且所述第一m9培养基中的水、无机盐和葡萄糖的氘代率为60％。
30、在其中一个实施例中，将所述第三菌液接种于所述第二驯化培养基进行第二适应性进化培养，包括以下步骤：
31、将所述第三菌液、所述第一m9培养基以及第二m9培养基分别置于所述微液滴微生物培养系统的进样瓶中；
32、在所述微液滴微生物培养系统中设置氘代率呈梯度递增的多个所述第二驯化培养基，并使所述微液滴微生物培养系统所述第二适应性进化培养；
33、在所述第二适应性进化培养中，实时监测微液滴中的菌液的od600以形成第二生长曲线图，并根据所述第二生长曲线图筛选出所述氘代菌株；
34、其中，所述第二m9培养基为m9培养基或改良m9培养基，且所述第二m9培养基中的水、无机盐和葡萄糖的氘代率为100％。
35、在其中一个实施例中，在筛选出所述氘代菌株之后，还包括以下步骤：
36、将所述氘代菌株接种于所述第二m9培养基中进行多次摇瓶培养，制备第四菌液，且所述第四菌液的od600为0.6～0.8；
37、在其中一个实施例中，所述大肠杆菌工程菌株能表达3-酮脂酰acp还原酶。
38、本申请至少具有以下有益效果：
39、本申请利用微液滴微生物培养系统(mmc)进行氘代菌株的驯化，mmc可在几百个微升级别的平行液滴中进行全自动、高通量的微生物适应性进化培养，准确性高，可重复性好，并有效防止其他微生物的污染，以及防止人工驯化时菌株暴露于空气中发生氢氘交换而导致氘化不完全的问题。lb培养基和m9培养基适合大肠杆菌工程菌种的培养；其中，第一驯化培养基选用lb培养基，其成分复杂，营养丰富，仅有水被氘代，有利于待筛菌株快速生长，并完成对氘代环境的初步适应性生长；第二驯化培养基选用m9培养基或改良m9培养基，其成分简单，所有组分均可选用氘代试剂，氘代率较高，促使完成初步适应性生长的待筛菌株能够逐步适应高氘代率的氘代环境，从而实现菌株的全氘化。本申请采用mmc来进行大肠杆菌工程菌种的适应性进化培养，并根据菌株在不同氘代率的培养环境中的生长特性来选用合适的培养基，从而驯化得到可耐受全氘代环境的氘代菌株。
1.一种氘代菌株的驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，所述第一驯化培养基中的水的氘代率为0％～60％，所述第二驯化培养基中的水、无机盐和葡萄糖的氘代率为60％～100％。
3.如权利要求2所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，所述改良m9培养基含有如下浓度的组分：
4.如权利要求1～3任一项所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，对大肠杆菌工程菌株进行活化和扩大培养，还包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，将所述第一菌液依次接种于微液滴微生物培养系统的第一驯化培养基和第二驯化培养基进行适应性进化培养，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，将所述第一菌液接种于所述第一驯化培养基进行第一适应性进化培养，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，对所述进化菌株进行扩大培养，包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，将所述第三菌液接种于所述第二驯化培养基进行第二适应性进化培养，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，在筛选出所述氘代菌株之后，还包括以下步骤：
10.如权利要求1～3任一项所述的氘代菌株的驯化方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株能表达3-酮脂酰acp还原酶。
