本发明属于生物材料领域，具体地涉及用于细胞培养的微载体。
背景技术：
：：1、自组装肽水凝胶作为一种三维支架材料，具有良好的生物相容性及功能多样性，在3d细胞培养、药物传递、药物筛选与评价、组织工程等生物医学领域被广泛应用。其中刺激响应型多肽因其凝胶化过程可调控而备受关注。但是，自组装肽的凝胶化往往依赖于温度(cn 202010572759.2)、ph的变化(如us 201/03262451a1中所述肽水凝胶随ph变化而改变、cn201680012178.5中所述肽水凝胶需在ph＜3.5时应用)、增加或减少特定的光照(cn201680061179.9中肽的凝胶化依赖于光活化)、引入金属盐离子(us 2011/0165200a1提出了包括max1的一系列肽，能与钙离子配位凝胶化；cn 202110863352.x中用于皮肤修复的肽水凝胶需要特定钠离子浓度)或某种外源性物质(cn201810783581.9中涉及一种肽复合水凝胶，凝胶化过程需要引入磷酸钙)等。这种严格的凝胶化条件伴随更复杂的使用流程，并带来额外的风险。将上述水凝胶用于生物实验时，非生理条件的温度和ph值对细胞活性造成不可忽视的威胁；光响应凝胶化的实现依托复杂昂贵的外设装置；较高的金属盐离子浓度影响细胞微环境的渗透压；外源性物质可能引起免疫反应，产生一定的安全风险。而现有的能够对内源性物质响应实现凝胶化的肽种类较少，且多限定为单一的内源物质(如cn201380063880.0涉及肽-白蛋白水凝胶)，适用范围有一定的限制。2、微载体在动物细胞培养中的使用始于20世纪60年代，目前市场上已有十几种商业产品可供选择，微载体由于其多孔结构，比表面积大，在同体积条件下可以提供远高于二维培养体系的表面积用于细胞粘附和生长。例如，在培养过程中，通过向培养体系中补充加入微载体，细胞可以自发从培养体系中已有的微载体迁移到新加入的微载体上，采用简单操作即可实现细胞的快速增殖，因而在体外大规模细胞培养中具有很大的潜力。3、微载体培养细胞分为静态培养和动态培养2种模式，其中动态培养占据较多的市场，动态培养适用于体外细胞培养的大规模扩增；而静态培养适用于小型试验，以其操作简单便捷的优点适用于诸多方案的试验中。对于静态培养而言，由于环境是静态的，微载体会全部沉淀在细胞培养孔板或反应器底端，微载体的沉积会导致细胞培养过程中营养物质分布不均，细胞代谢产物堆积，并且影响细胞生长代谢过程中的气体交换，最终导致细胞凋亡。静态培养培养时间一般2-3天，不适用于长时间培养。相比静态培养来说，动态培养会解决以上存在的细胞营养物质分布，细胞代谢废物，气体交换等问题，动态培养是动态的，适用于细胞长期培养，如8-10天，但是，需要与之配套的设备如生物反应器辅助进行，操作比较复杂，生产成本较高，而且，整个细胞培养周期内需要搅拌，搅拌速度需要根据细胞种类合理调控，并且，搅拌的存在对细胞对微载体的附着产生一定的影响，剪切力的存在可能会使体系中存在一部分游离的单个细胞，这样会对后续的细胞增殖产生影响。4、因此，开发出能够将上述静态培养和动态培养相结合的微载体，从而将静态培养和动态培养的优点相组合，并且无需添加其他的引发物质在生理条件下，或者细胞培养环境及人体中广泛存在物质条件下，无需额外的磁场、温度、ph值、光和机械力等物理或生化刺激，即可使用的微载体将具有十分重要并且广泛的应用前景。技术实现思路1、本发明提供了一种自组装肽/微载体的复合应用，所述微载体用生物支架材料支撑，无需搅拌等复杂的配套设备，实现了微载体的均匀分散和悬浮状态，能更好地帮助细胞粘附和促进细胞增殖，而且，在整个细胞培养周期内微载体始终保持悬浮均匀分散的状态。所述用生物支架材料支撑的微载体能够将静态培养和动态培养的优点相结合，成功的解决了微载体静态培养和动态培养细胞存在的一些问题。而且，所述生物支架材料无需额外的磁场、温度、ph值、光和机械力等物理或生化刺激，在生理条件下，或者细胞培养环境及人体中广泛存在物质条件下即可实现对微载体的支撑。2、第一方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含微载体和自组装肽。3、所述自组装肽包含疏水结构域和亲水结构域，所述亲水结构域包含至少两个连续的能够形成β-转角的β-转角区。4、在一些实施方案中，所述至少一个β-转角区在末端包含或连接一个或多个酸性氨基酸，优选包含或连接一个酸性氨基酸。5、在一些实施方案中，至少一个β-转角区在末端包含酸性氨基酸。6、在一些实施方案中，所述β-转角区包含由3-6个氨基酸形成的β-转角基序，所述β-转角基序具有如下结构：7、x1x2x3，x1x2x3x4，x1x2x3x4x5，或x1x2x3x4x5x6，8、其中，x1，x2，x3，x4，x5，x6为氨基酸残基，各β-转角基序中x1，x2，x3，x4，x5，x6分别彼此相同或不同。9、在一些实施方案中，所述β-转角基序包含一个羟脯氨酸(o)，优选地，所述x2为羟脯氨酸(o)。10、在一些实施方案中，所述亲水结构域包含2-8个β-转角区。11、在一些实施方案中，所述亲水结构域包含2，3，4，5，6，7或8个β-转角区。12、优选地，所述亲水结构域包含2-6个β-转角区。更优选地，所述亲水结构域包含2-4个β-转角区。13、优选地，所述亲水结构域包含2或3个β-转角区。14、在一些实施方案中，所述至少一个β-转角区中的β-转角基序包含或连接一个酸性氨基酸。15、在一些实施方案中，所述至少一个β-转角区中的β-转角基序包含或连接一个谷氨酸(e)，缬氨酸(v)，亮氨酸(l)，异亮氨酸(i)，天冬氨酸(d)或赖氨酸(k)。16、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，所述的β-转角区末端包含酸性氨基酸e。17、在一些实施方案中，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，其中一个β-转角区末端包含酸性氨基酸e，另一个β-转角区末端包含氨基酸v或者k。18、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，所述的β-转角区末端包含酸性氨基酸d。19、在一些实施方案中，所述亲水结构域中包含两个β-转角区，其中一个β-转角区末端包含酸性氨基酸d，另一个β-转角区末端包含氨基酸v。20、在一些实施方案中，所述亲水结构域中包含至少一个x2为羟脯氨酸o的β-转角基序，或者所述亲水结构域中包含至少一个x2为脯氨酸p的β-转角基序。21、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含至少一个x2为o的β-转角基序。22、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含至少一个x1为g的β-转角基序。23、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含一个x2为o的β-转角基序，以及一个x2为p的β-转角基序。24、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含至少一个x2为p的β-转角基序。25、在一些实施方案，所述亲水结构域中包含两个x2为p的β-转角基序。26、在一些实施方案中，所述x1，x3和x4中的一个或多个为甘氨酸(g)，和/或所述x3和x4中的一个或两个为丙氨酸(a)。27、在一些实施方案中，所述β-转角基序包括选自如下的氨基酸序列：28、gpgg(seq id no.:33)，gpga(seq id no.:34)，gpag(seq id no.:35)，gpg，gpaa(seq id no.:36)，gpggg(seq id no.:37)，gogg(seq id no.:38)，goga(seq id no.:39)，goag(seq id no.:40)，gogga(seq id no.:41)，goaa(seq id no.:42)，gog，或gogv(seqid no.:43)。29、优选地，所述β-转角基序具有选自如下的氨基酸序列：30、gpage(seq id no.:44)，gpgge(seq id no.:45)，gogae(seq id no.:46)，goggae(seq id no.:47)，goge(seq id no.:48)，gogge(seq id no.:49)，gpgad(seq id no.:50)，goggd(seq id no.:51)，gpggv(seq id no.:52)，goggv(seq id no.:53)，gpggk(seqid no.:54)，goggk(seq id no.:55)，gpgae(seq id no.:56)，gogad(seq id no.:57)，gpaad(seq id no.:58)，goaae(seq id no.:59)，gpggd(seq id no.:60)，gpgggv(seq idno.:61)，gpgv(seq id no.:62)，goggi(seq id no.:63)或gogvi(seq id no.:64)。在一些实施方案中，所述x1和x4形成氢键。31、在一些实施方案中，所述亲水结构域包含2，3，4，5，6，7或8个β转角基序，优选地，所述亲水结构域包含2或3个β转角基序。32、在一些实施方案中，所述β转角基序具有选自如下的氨基酸序列：gogg(seq idno.:38)，gpgg(seq id no.:33)，goga(seq id no.:39)，goag(seq id no.:40)，gpga(seqid no.:34)或gpag(seq id no.:35)。33、所述亲水结构域中至少有一个β转角基序包括一个丙氨酸，从而提高所述自组装肽的机械性能。34、在一些实施方案中，所述亲水结构域的c末端可以用选自如下的试剂或基团进行修饰：羧酸、硫醇、酮酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐、亚硫磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙烯基砜、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。35、所述亲水结构域的氨基酸序列相较于疏水结构域的氨基酸序列亲水。36、在一些实施方案中，所述疏水结构域包含3-10个疏水性氨基酸。优选地，所述疏水结构域包含3-7个疏水性氨基酸，优选地，所述疏水结构域包含3-5个疏水性氨基酸。更优选地，所述疏水结构域包含5个疏水性氨基酸。37、优选地，所述疏水性氨基酸选自异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、苯丙氨酸(f)和丙氨酸(a)中的一种或者多种。38、在一些实施方案中，所述疏水性氨基酸选自i、v、l、f中的一种或者多种。39、在一些实施方案中，所述疏水结构域的n末端用选自如下的试剂或基团进行修饰：乙酰、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。40、在一些实施方案中，所述疏水结构域具有选自如下的氨基酸序列：41、llll(seq id no.:65)，fiiii(seq id no.:66)，iiiii(seq id no.:67)，iiii(seq id no.:68)，ilili(seq id no.:69)，flflf(seq id no.:70)，ivivi(seq id no.:71)，vlfiiv(seq id no.:72)，vliii(seq id no.:73)，ivalf(seq id no.:74)，lfivl(seqid no.:75)，fiaiv(seq id no.:76)，fiiiv(seq id no.:77)，ac-vlfiiv(seq id no.:78)，ac-ivivi(seq id no.:79)，ac-iiiii(seq id no.:80)，iiiiii(seq id no.:81)，flivi(seq id no.:82)，fliia(seq id no.:83)，fifif(seq id no.:84)，ififi(seq idno.:85)，iaili(seq id no.:86)或lllll(seq id no.:87)。42、所述疏水结构域的氨基酸序列相较于亲水结构域的氨基酸序列疏水。43、在一些实施方案中，所述自组装肽还包括连接域，在疏水结构域与亲水结构域之间提供间隔区。44、在一些实施方案中，所述连接域包含2-8个氨基酸残基，优选4-5个氨基酸残基。45、在一些实施方案中，所述连接域包含小侧链氨基酸、侧链带有羟基的氨基酸和/或远离疏水区域的疏水氨基酸。46、在一些实施方案中，所述侧链较小的氨基酸选自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)和丝氨酸(s)。47、在一些实施方案中，所述侧链带有羟基的氨基酸选自丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和羟脯氨酸(o)，48、在一些实施方案中，所述远离疏水结构域的疏水氨基酸选自i、v、l、f和a，所述疏水氨基酸i、v、f、l、a可以互换。49、在一些实施方案中，所述连接域具有选自如下的氨基酸序列：50、gsii(seq id no.:88)，gpogi(seq id no.:89)，gpogv(seq id no.:90)，gsgii(seq id no.:91)，gsvi(seq id no.:92)，goii(seq id no.:93)，gpogl(seq id no.:94)，ogii(seq id no.:95)或gtvi(seq id no.:96)，其中，s、t、o能彼此互换。51、更优选地，所述连接域具有选自如下的氨基酸序列：52、gsii(seq id no.:88)，gtii(seq id no.:97)，gtvi(seq id no.:96)，govi(seqid no.:98)，gsvi(seq id no.:92)，gsvl(seq id no.:99)，gsgii(seq id no.:91)，gsgvi(seq id no.:100)，goii(seq id no.:87)，ogii(seq id no.:87)，gogvi(seq id no.:101)或gogii(seq id no.:102)。53、在一些实施方案中，所述疏水结构域与所述连接域之间还包含一个或者多个g，用于增强所述自组装肽的柔软性和灵活度。54、在一些实施方案中，所述自组装肽的长度为15-50个氨基酸，优选为15-25个氨基酸。55、在一些实施方案中，所述自组装肽包含2，3，4，5，6，7或8个β转角，优选地，所述自组装肽包含2或3个β转角。56、在一些实施方案中，所述自组装肽具有选自如下seq id nos:1-7和seq id nos:9-32的氨基酸序列：57、iiiiigsiigpggdgpggv(seq id no.:1)；58、iiiiigsiigpggegpggv(seq id no.:2)；59、iiiiigsiigoggegpggv(seq id no.:3)；60、iiiigsiigoggegpggv(seq id no.4)；61、iiiiigsiigoggegpgggv(seq id no.5)；62、iiiiigsiigoggegpgv(seq id no.6)；63、iiiiigsiigogaegpggv(seq id no.7)；64、iiiiigsiigoggvgpggv(seq id no.9)；65、iiiiiigsiigogaegpggvgpggv(seq id no.:10)；66、flivigsiigogaegpggv(seq id no.:11)；67、fliiagsiigpggdgoggv(seq id no.:12)；68、iiiiigogiigpggegpgge(seq id no.:13)；69、fififgtvigpggegoggv(seq id no.:14)；70、ififigtvigpggegoggk(seq id no.:15)；71、iailigtvigpggegogge(seq id no.:16)；72、ivivigsiigpggdgpggv(seq id no.:17)；73、ivivigsiigoggdgpggv(seq id no.:18)；74、ivivigsiigpggegoggv(seq id no.:19)；75、flivigogiigoggegpgge(seq id no.:20)；76、ivivigogiigoggdgoggv(seq id no.:21)；77、ivivigsgiigpggegpggv(seq id no.:22)；78、fiiivgsiigpggegpggv(seq id no.:23)；79、fiiivgsiigpggegpgge(seq id no.:24)；80、iiiiigogiigoggegpggv(seq id no.:25)；81、ac-iiiiigsiigpggegoggv(seq id no.:26)；82、flivigsiigogaegpggv(seq id no.:27)；83、flivigsiigogaegoggv(seq id no.:28)；84、lllllgsvlgpagegpage(seq id no.:29)；85、lllllgphypglgpagegpage(seq id no.:30)；86、lllllgphypgvgpagegpage(seq id no.:31)；87、lllllgphypgigpagegpage(seq id no.:32)。88、具有上述结构的本发明的自组装肽可以由引发剂引发而形成三维网状支架材料。89、所述三维网状支架材料具有纳米结构。90、在一些实施方案中，所述微载体为微球或微载片。91、在一些实施方案中，所述微载体为大孔明胶微载体、甲基丙烯酸明胶微载体、海带多糖微载体、羧基甜菜碱微载体、异丙基丙烯酰胺微载体、聚乙烯醇/纤维素微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖、骨胶原微载体、壳聚糖微载体、几丁质微载体、聚苯乙烯微载体、phema微载体、聚氨酯泡沫微载体、聚乳酸微载体、聚丙交酯微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体，例如3d tabletrixtm微载片，cytodex1，cytodex2，cytodex3，cytopore和cytoline。92、在一些实施方案中，所述微载体的粒径为50-500μm，优选为100-200μm。93、在一些实施方案中，所述组合物为冻干粉的形式。在进行细胞培养前，通过将自组装肽配制成溶液，然后添加到微载体细胞培养体系中，可以实现由自组装肽自组装形成的三维网状支架材料支撑微载体从而进行细胞培养。94、在一些实施方案中，所述组合物为溶液的形式，不同浓度的微载体含量，可以选择与之相对应的最低支架材料浓度，较高的支架材料浓度可以支撑起更多的微载体。95、在一些实施方案中，根据细胞生长在微载体上的合适细胞密度选择微载体浓度，例如，为0.05-1.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，培养体系中支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。96、在一些实施方案中，所述组合物还包含正电荷源物质作为引发剂。97、所述正电荷源物质包括带有正电基团、或正电离子的物质。98、在一些实施方案中，所述正电荷源物质为中性条件下氢键受体数小于氢键供体数的生物大分子、药物，功能分子，或金属离子、氨基酸等小分子，或包含上述物质中的一种或多种的混合物。99、在一些实施方案中，所述生物大分子包括但不限于有机酸、蛋白质、多糖及其衍生物，所述有机酸包括但不限于乳酸、单宁酸、柠檬酸等。100、在一些实施方案中，所述蛋白质选自中性生理条件下能够提供氢离子的蛋白质。101、优选地，所述蛋白质独立地选自等电点(pi)值低于7.0(优选3.4-6.05)的蛋白质。102、在一些实施方案中，所述蛋白质包括但不限于纤维蛋白原、球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。103、在一些实施方案中，所述多糖及其衍生物包括但不限于几丁质、壳聚糖等。104、在一些实施方案中，所述的药物包括但不限于抗生素、多巴胺等；优选地，所述抗生素包括但不限于卡那霉素、庆大霉素等。105、在一些实施方案中，所述的功能分子包括但不限于抗氧化剂、细胞增殖促进成分等；106、在一些实施方案中，所述的抗氧化剂包括但不限于烟酰胺等维生素等。107、在一些实施方案中，所述细胞增殖促进成分包括但不限于精胺、亚精胺等。108、在一些实施方案中，所述金属离子包括但不限于钾、钙、镁离子等。109、在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限于氨基酸或其聚合物，如：赖氨酸、精氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸等。110、在一些实施方案中，所述正电荷源物质为尿素或烟酰胺单核苷酸。111、在一些实施方案中，所述正电荷源物质为血清、血浆、动植物组织液等或包含上述正电荷源物质的混合液。112、在采用所述组合物进行的细胞培养体系中，细胞贴附在微载体上，微载体在体系中被自组装肽自组装形成的支架材料支撑起来，虽然是静态培养，但是与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，分布均匀且保持静止状态。113、与静态培养相比较，解决了静态培养过程细胞营养成分分布不均和细胞代谢产物堆积的问题，微载体均匀分布使细胞分布更加均匀，实现了更好的细胞生长增殖效果；与动态培养相比，摒弃了繁琐的搅拌过程，不再受相关设备的禁锢，在静态培养条件下既可实现悬浮三维培养的效果。114、第二方面，本发明提供了生物反应体系，所述生物反应体系中包含微载体和自组装肽自组装形成的三维网状支架材料，所述微载体由所述三维支架材料支撑。115、在一些实施方案中，所述微载体为微球或微载片。116、在一些实施方案中，所述微载体为大孔明胶微载体、甲基丙烯酸明胶微载体、海带多糖微载体、羧基甜菜碱微载体、异丙基丙烯酰胺微载体、聚乙烯醇/纤维素微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖、骨胶原微载体、壳聚糖微载体、几丁质微载体、聚苯乙烯微载体、phema微载体、聚氨酯泡沫微载体、聚乳酸微载体、聚丙交酯微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体，例如3d tabletrixtm微载片，cytodex1，cytodex2，cytodex3，cytopore和cytoline。117、在一些实施方案中，所述微载体的粒径为50-500μm，优选为100-200μm。118、在进行细胞培养前，通过将自组装肽配制成溶液，然后添加到微载体细胞培养体系中，可以实现由自组装肽自组装形成的三维网状支架材料支撑微载体从而进行细胞培养。119、在一些实施方案中，所述生物反应器中的培养体系为溶液的形式，不同浓度的微载体含量，可以选择与之相对应的最低支架材料浓度，较高的支架材料浓度可以支撑起更多的微载体。120、在一些实施方案中，根据细胞生长在微载体上的合适细胞密度选择微载体浓度，例如，为0.05-1.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，培养体系中支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。121、在一些实施方案中，所述生物反应器还包含正电荷源物质作为引发剂。122、所述正电荷源物质包括带有正电基团、或正电离子的物质。123、在一些实施方案中，所述正电荷源物质为中性条件下氢键受体数小于氢键供体数的生物大分子、药物，功能分子，或金属离子、氨基酸等小分子，或包含上述物质中的一种或多种的混合物。124、在一些实施方案中，所述生物大分子包括但不限于有机酸、蛋白质、多糖及其衍生物，所述有机酸包括但不限于乳酸、单宁酸、柠檬酸等。125、在一些实施方案中，所述蛋白质选自中性生理条件下能够提供氢离子的蛋白质。126、优选地，所述蛋白质独立地选自等电点(pi)值低于7.0(优选3.4-6.05)的蛋白质。127、在一些实施方案中，所述蛋白质包括但不限于纤维蛋白原、球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白等。128、在一些实施方案中，所述多糖及其衍生物包括但不限于几丁质、壳聚糖等。129、在一些实施方案中，所述的药物包括但不限于抗生素、多巴胺等；优选地，所述抗生素包括但不限于卡那霉素、庆大霉素等。130、在一些实施方案中，所述的功能分子包括但不限于抗氧化剂、细胞增殖促进成分等；131、在一些实施方案中，所述的抗氧化剂包括但不限于烟酰胺等维生素等。132、在一些实施方案中，所述细胞增殖促进成分包括但不限于精胺、亚精胺等。133、在一些实施方案中，所述金属离子包括但不限于钾、钙、镁离子等。134、在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限于氨基酸或其聚合物，如：赖氨酸、精氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸等。135、在一些实施方案中，所述正电荷源物质为尿素或烟酰胺单核苷酸。136、在一些实施方案中，所述正电荷源物质为血清、血浆、动植物组织液等或包含上述正电荷源物质的混合液。137、在采用所述生物反应器进行的细胞培养体系中，细胞贴附在微载体上，微载体在体系中被自组装肽自组装形成的支架材料支撑起来，虽然是静态培养，但是与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，分布均匀且保持静止状态。138、与静态培养相比较，解决了静态培养过程细胞营养成分分布不均和细胞代谢产物堆积的问题，微载体均匀分布使细胞分布更加均匀，实现了更好的细胞生长增殖效果；与动态培养相比，摒弃了繁琐的搅拌过程，不再受相关设备的禁锢，在静态培养条件下既可实现悬浮三维培养的效果。139、在本发明的生物反应器中，细胞贴附在微载体上，微载体在体系中被自组装肽自组装形成的支架材料支撑起来，虽然是静态培养，但是与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，分布均匀且保持静止状态。140、与静态培养相比较，解决了静态培养过程细胞营养成分分布不均和细胞代谢产物堆积的问题，微载体均匀分布使细胞分布更加均匀，实现了更好的细胞生长增殖效果；与动态培养相比，摒弃了繁琐的搅拌过程，不再受相关设备的禁锢，在静态培养条件下既可实现悬浮三维培养的效果。141、本发明的生物反应体系能够提供新型的微载体培养细胞模式，即微载体通过三维网状支架材料支撑起来，实现微载体的均匀分散和悬浮状态，进而更好的帮助细胞粘附和促进细胞增殖，并且在整个细胞培养周期内始终保持微载体悬浮均匀分散的状态，不聚集不沉淀。该模式结合了静态培养和动态培养的优点，将静态培养和动态培养这两种模式整合成一种新的模式，成功解决了微载体培养细胞存在的一些问题。本发明将这种新的模式与静态培养及动态培养这三种不同的实验方案进行细胞培养实验，进行比较，从而验证了该新模式的可行性和优势。该模式下细胞粘附在微载体上，微载体在体系中被三维网状支架材料支撑起来，与动态培养类似，微载体悬浮在体系中，不聚集、不沉淀，分布均匀且保持静止状态。142、在一些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。143、在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于vero细胞，cho细胞，干细胞，bhk细胞，sp2/0细胞，mdck，pk15，marc-145，hek293细胞，st细胞，癌细胞，猪肌肉卫星细胞。144、在一些实施方案中，所述干细胞为胚胎干细胞，脐带血干细胞，间充质干细胞，或诱导多能干细胞(ips)，所述间充质干细胞例如为脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，皮肤间充质干细胞等。145、第三方面，本发明提供了培养细胞的方法，所述方法包括利用第一方面的组合物或第二方面的生物反应体系培养细胞的步骤。146、在一些实施方案中，所述方法包括利用微载体培养细胞的步骤，所述微载体是用第一方面中的自组装肽自组装形成的三维支架材料支撑的微载体。147、在一些实施方案中，所述微载体为微球或微载片。148、在一些实施方案中，所述微载体为大孔明胶微载体、甲基丙烯酸明胶微载体、海带多糖微载体、羧基甜菜碱微载体、异丙基丙烯酰胺微载体、聚乙烯醇/纤维素微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇微载体、d,l-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖、骨胶原微载体、壳聚糖微载体、几丁质微载体、聚苯乙烯微载体、phema微载体、聚氨酯泡沫微载体、聚乳酸微载体、聚丙交酯微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体，例如3d tabletrixtm微载片，cytodex1，cytodex2，cytodex3，cytopore和cytoline。149、在一些实施方案中，所述微载体的粒径为50-500μm，优选为100-200μm。150、在进行细胞培养前，通过将自组装肽配制成溶液，然后添加到微载体细胞培养体系中，可以实现由自组装肽自组装形成的三维网状支架材料支撑微载体从而进行细胞培养。151、在一些实施方案中，包含所述微载体的培养体系为溶液的形式，不同浓度的微载体含量，可以选择与之相对应的最低支架材料浓度，较高的支架材料浓度可以支撑起更多的微载体。152、在一些实施方案中，根据细胞生长在微载体上的合适细胞密度选择微载体浓度，例如，为0.05-1.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，培养体系中支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。153、第四方面，本发明提供了第一方面的组合物，第二方面的生物反应体系或第三方面的方法在细胞培养中的应用。154、在一些实施方案中，所述细胞培养为二维培养或三维培养。155、本发明在无需搅拌的静态条件下达到了微载体分散均匀和悬浮培养的效果，细胞粘附在微载体上，从而实现了细胞三维培养的目的，且细胞分布均匀，营养物质分布均匀，可以满足细胞生长需求，细胞代谢良好，细胞粘附和增殖效果良好，收获的细胞活性良好，细胞换液和细胞收获方式简单；整个过程无需搅拌，操作简单，无需与之配套的生物反应器辅助进行，使用方便。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.包含自组装肽和微载体的组合物，所述自组装肽包含疏水结构域和亲水结构域，所述亲水结构域包含至少两个连续的β-转角区。
2.根据权利要求1的组合物，所述至少一个β-转角区在末端包含或连接一个或多个酸性氨基酸，优选包含或连接一个酸性氨基酸。
3.根据权利要求1的组合物，所述每个β-转角区包含由3-6个氨基酸形成的β-转角基序，所述β-转角基序具有如下结构：
4.根据权利要求3的组合物，所述β-转角基序包含一个羟脯氨酸(o)。
5.根据权利要求1的组合物，所述亲水结构域包含2-8个β-转角区。
6.根据权利要求3的组合物，所述至少一个β-转角区中的β-转角基序在末端包含或连接一个选自谷氨酸(e)，缬氨酸(v)，亮氨酸(l)，异亮氨酸(i)，天冬氨酸(d)和赖氨酸(k)的氨基酸。
7.根据权利要求3的组合物，所述亲水结构域中包含至少一个x2为羟脯氨酸o的β-转角基序，或者所述亲水结构域中包含至少一个x2为脯氨酸p的β-转角基序。
8.根据权利要求3的组合物，所述x1，x3和x4中的一个或多个为甘氨酸(g)，和/或所述x3和x4中的一个或两个为丙氨酸(a)。
9.根据权利要求1的组合物，所述β-转角基序包括选自如下的氨基酸序列：
10.根据权利要求1的组合物，所述亲水结构域的c末端用选自如下的试剂或基团进行修饰：羧酸、硫醇、酮酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐、亚硫磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙烯基砜、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。
11.根据权利要求1的组合物，所述疏水结构域包含3-10个疏水性氨基酸，
12.根据权利要求1的组合物，所述疏水结构域的n末端用选自如下的试剂或基团进行修饰：乙酰、醇、醛、胺、亚胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、酯、硫酯、芳基和/或硅烷修饰。
13.根据权利要求1的组合物，所述疏水结构域包含：
14.根据权利要求1的组合物，其还包括连接域，所述连接域包含2-8个氨基酸残基，优选4-5个氨基酸残基；并且
15.根据权利要求1的组合物，所述自组装肽具有选自seq id nos:1-7和seq id nos:9-32的氨基酸序列。
16.根据权利要求1的组合物，所述微载体选自大孔明胶微载体，甲基丙烯酸明胶微载体，海带多糖微载体，羧基甜菜碱微载体，异丙基丙烯酰胺微载体，聚乙烯醇/纤维素微载体，d,l-乳酸-共-乙二醇微载体，d,l-乳酸-共-乙二醇微载体，d,l-乳酸-共-乙二醇微载体，d,l-乳酸-共-乙二醇/壳聚糖微载体，骨胶原微载体，壳聚糖微载体，几丁质微载体，聚苯乙烯微载体，phema微载体，聚氨酯泡沫微载体，聚乳酸微载体，聚丙交酯微载体，藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体。
17.根据权利要求1所述的组合物，所述微载体的粒径为50-500μm，优选100-200μm。
18.根据权利要求1所述的组合物，还包含正电荷源物质作为引发剂，所述正电荷源物质为生物大分子，药物，功能分子，金属离子、氨基酸，或包含上述物质中的一种或多种内源或外源的混合物，
19.根据权利要求1的组合物，所述自组装多肽和所述微载体以粉末的形式置于同一容器中；或，所述自组装肽和所述微载体以粉末的形式分别置于不同的容器中；或，所述自组装肽以溶液的形式置于一个容器，所述微载体以粉末的形成置于另一个容器中；或，所述自组装肽以粉末的形式置于一个容器，所述微载体以溶液的形成置于另一个容器中；或所述自组装肽和所述微载体以溶液的形式置于同一个容器中。
20.细胞培养体系，所述细胞培养体系中包含权利要求1-19任一项中的微载体和自组装肽自组装形成的三维网状支架材料，所述微载体由所述三维支架材料支撑。
21.根据权利要求20的细胞培养体系，所述微载体浓度为0.05-10.0wt％，支架材料浓度为0.025-1.0wt％，支架材料和微载体的质量比为1-20:1-20。
22.根据权利要求21所述的细胞培养体系，还包含正电荷源物质作为引发剂，所述正电荷源物质为生物大分子，药物，功能分子，金属离子、氨基酸，或包含上述物质中的一种或多种内源或外源的混合物，
23.细胞培养的方法，所述方法包括利用权利要求1-19任一项的组合物或权利要求20-22任一项的细胞培养体系培养细胞的步骤。
24.权利要求1-19任一项的组合物，权利要求20-22任一项的细胞培养方法或权利要求23的细胞培养方法在细胞培养及储存中的应用。
技术总结本发明涉及自组装肽，由所述自组装肽与微载体所构成的组合在细胞培养中的应用。
技术研发人员：梁俊,郝花影
受保护的技术使用者：矩阵（天津）生物科技有限公司
技术研发日：技术公布日：2024/6/26
