本发明属于生物医药，涉及一种信号传感器cd24表达量的测量方法，具体涉及细胞样品中cd24的mrm测定方法。
背景技术：
1、现有技术公开了信号传感器cd24(signal transducer cd24，cd24)是由cd24基因编码的蛋白，全长80个氨基酸，属膜蛋白，是一种人类细胞表面蛋白质，它参与了多种细胞的信号传导和分化作用。cd24检测的意义主要体现在以下几个方面：癌症筛查：cd24在某些类型的肿瘤细胞上高表达，因此cd24检测可以作为一种肿瘤标志物进行癌症筛查。例如，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等恶性肿瘤中，cd24的高表达与肿瘤的发生、发展和预后有密切关系。免疫治疗：免疫细胞通过识别和攻击表达cd24的癌细胞来起到抗肿瘤作用。因此，cd24检测可以帮助医生确定免疫治疗的适应症和治疗方案。生殖医学：cd24在成熟卵母细胞表面的表达与其受精能力密切相关。因此，cd24检测可以作为卵子质量评估的一种手段，在人工授精和体外受精等生殖技术中发挥重要作用。总之，cd24检测在临床医学中有着广泛的应用前景，所以检测cd24蛋白有着重要的意义。
2、目前市场上使用了各种方法来测量其表达量，包括western blot、elisa等方法。这些方法具有一定的优点和缺点，例如：westernblot需要特异性抗体，能够检测小样品，但灵敏度和准确度有限。elisa灵敏度高且可高通量测量，但仅限于检测单一分子且对样品质量要求较高。现有smrm质谱技术常规参数设置一般为去簇电压设为80，q1/q3四级杆设为unit，喷雾电压5500v，帘气35psi，鞘气40psi，辅助加热气40psi，辅助加热气温度500℃，cad:medium，smrm参数target cycle time:0.3s，碰撞能量28。如果直接使用此参数检出限无法达到检测的需求。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种信号传感器cd24(signal transducer cd24，cd24)表达量的mrm靶向测量方法，具体涉及生物样品中cd24的质谱多反应监测模式(mrm)测定方法。本发明所述方法适用于药物处理前后生物样品中cd24蛋白的绝对含量测定。在具体实施方案中，本发明可用于细胞中辅助生长激素过量/缺乏性疾病相关蛋白的绝对含量测定。
2、本发明选择使用smrm质谱技术来测量cd24表达量。相对于市场现有的方法，smrm质谱技术有以下优势：高度特异性：通过多重反应监测(mrm)模式，可减少非特异性信号的影响，提高检测结果的准确性。可靠性高：由于smrm技术可同时检测靶蛋白标志性肽段的多个碎片离子，因此其结果更可靠。高通量：样品处理简便，大大提高了实验效率。本发明通过优化去簇电压、喷雾电压、帘气、鞘气、辅助加热气、辅助加热气温度、smrm参数targetcycle time、碰撞能量使得检出限降低，达到检测的需求。
3、本发明提供了一种生物样品中信号传感器cd24表达量的测量方法，该方法是基于对cd24的标志性肽段的质谱靶向定量检测。本发明的针对cd24的mrm检测不仅可应用于细胞样品中cd24的定量检测，也可应用于其他临床以及科研模型样本例如组织样品、细胞样品中cd24蛋白的定量检测。
4、本发明提供了一种cd24表达量的测量方法，通过检测cd24的标志性肽段(单一物种内具有唯一性的肽段，具有唯一性)的含量来代表cd24蛋白的表达量；所述的cd24的标志性肽段的序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seq id no.1)。
5、具体地，本发明的测量方法包括以下步骤：(1)细胞样品蛋白质的前处理，具体程序包括细胞样品的收集，蛋白的提取，蛋白的还原烷基化与酶解；(2)质谱的mrm方法开发，具体包括cd24蛋白标志性肽段的设计包括符合胰蛋白酶酶切规律、不含蛋氨酸以及不含漏切位点的肽段，同位素内标肽的合成，监测母子离子对的筛选以及lc-ms/ms(liquidchromatography-tandem mass spectrometry)条件的优化；(3)细胞样本中cd24的mrm检测与数据分析。
6、本发明中使用的所述的测量方法包括使用质谱测定，获得人细胞中最低检出限为1ng/ml。
7、本发明中可选用的质谱为三重四级杆质谱(sciex triple quadtm 6500+)。
8、其中，使用的质谱模式为动态多反应监测模式(mrm)。
9、所述质谱模式中，所述动态多反应监测模式(mrm)是指通过确定保留时间后，质谱自动的将相应的驻留时间给到相应的离子对使得响应值提高，同时可以确保在预计的循环时间内。
10、进一步地，所述cd24的标志性肽段是序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seq id no.1)的轻标内标肽。
11、所述的轻标内标肽是重组cd24蛋白经还原烷基化后胰蛋白酶酶切产物中序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seq id no.1)的肽段。
12、所述的标志性肽段中，序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seq id no.1)的肽段的分子量为2929.3，标志性肽段中序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seqid no.1)的肽段在离子源中主要呈现三价态。
13、所述的序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seq id no.1)标志性肽段三价肽质荷比为977.8。
14、本发明通过质谱方法测定来自细胞样品中蛋白质消化物的cd24的肽段片段的含量；所述的表达量是指样品之间的相对含量或者绝对含量。
15、所述的蛋白质消化物包括蛋白酶消化物或者胰蛋白酶消化物。
16、其中，用于检测cd24表达量的生物样品包括但不限于(对照或者药物处理后)细胞样品、细胞样品、组织样品、细胞样品、尿液样品等，还包括可适用于本发明测量的其他样品。
17、本发明中的测量方法通过mrm检测样品中cd24的标志性肽段的mrm特征峰面积，对比两者峰面积的比例，即可计算出样品中cd24的相对含量。具体地，取相同总蛋白量的样品a和样品b同步进行实验与质谱分析，通过测得各自的cd24的mrm特征峰面积为area_a和area_b，则cd24在样品a和样品b中的相对含量即为area_a/area_b。通过对比已知浓度的重组cd24蛋白比例做线性方程，带入比例即可测出样品中cd24的绝对含量。具体地，取总蛋白含量为100μg的样品c进行实验与质谱分析，通过测得的cd24的mrm特征峰面积为area_c，带入标准曲线线性方程，得到cd24的浓度为con_c(ng/ml)，经过所有前处理环节后的最终体积为v(μl)，则最终可得到cd24的含量数值为(con_c×v×10-3)ng/100μg蛋白。
18、对cd24的标志性肽段的mrm检测，特征峰面积计算是通过检测标志性肽段母离子与其产生的子离子碎片组成的母子离子对组合实现的；其中，质谱分析测得的定量子离子的峰面积即可视为特征肽段的峰面积。
19、标志性肽段的母子离子对组合为：
20、977.8/944.5；
21、所述的质谱采用的模式是动态多反应监测模式(mrm)。
22、其中，所述cd24的mrm靶向质谱检测的优化后的参数为：去簇电压设为40，q1/q3四级杆设为unit，喷雾电压5500v，帘气35p.s.i，鞘气：55psi，辅助加热气55psi，辅助加热气温度：550℃，cad：medium。在一具体实施方案中，质谱检测参数见表1。
23、本发明方法为非诊断目的，可应用于辅助生长激素过量/缺乏性疾病细胞/血液/组织/尿液/细胞等生物样品中的cd24蛋白的定量用以cd24靶向药的药效评估和疾病诊断、检测、病程监测以及预后评估的辅助参考。
24、在本发明的一个实施例中，本发明首先根据cd24的蛋白质序列，依据符合胰蛋白酶酶切规律、不含蛋氨酸以及不含漏切位点的肽段的具体标准筛选出两条cd24的标志性肽段。
25、其中，具体如下：优先使用重组蛋白进行还原烷基化酶解,使用高分辨质谱上机得到dda数据，数据经过搜库软件搜库的到蛋白的序列覆盖度，同时从中挑出漏切率低、信号高，尽可能满足不含蛋氨酸、胰蛋白酶理论漏切位点的肽段。
26、本发明对cd24的mrm检测依赖于串联质谱分析技术。通过串联质谱，靶向检测cd24的标志性肽段以标志性肽段碎裂产生的离子碎片。通过检测标志性肽段与二级质谱中的碎片离子的母子离子对组合(transition)，实现对cd24的mrm定量检测。
27、cd24的绝对定量通过mrm实现。首先需要制作一条标准曲线。配制不同浓度比例的重组cd24蛋白样品，然后对样品对进行mrm测试，根据轻标肽特征峰面积与浓度比率的线性关系，得到标准曲线，然后对待检测样品进行mrm检测。根据样本中cd24的标志肽的mrm特征峰面积与标准曲线，计算得出待检测样本中cd24的标志肽的浓度，进而得知cd24的浓度。
28、不同样本中cd24的相对定量通过mrm实现。首先，将各个样本依次进行mrm质谱检测，定向检测选定的标志性肽段以及标志性肽段碎裂产生的离子碎片的质谱信号强度。然后将每个待检测样品中cd24内源标志性肽段的mrm特征峰面积性比较，得到不同样本中cd24内源标志性肽段的mrm特征峰面积与掺入的内标肽的mrm特征峰面积的比值，通过这个比值实现不同样本中cd24含量的相对定量。
29、本发明提供了上述测是方法的应用，包括但不限于用于cd24的检测，用于疾病诊断、病程监测或者预后评估的的参考辅助。例如，所述的应用是作为辅助生长激素过量/缺乏性疾病诊断，病程检测，预后的辅助参考指标的非诊断目的的检测之应用。
30、本发明所述的测定测量基于对cd24的标志性肽段的靶向检测，可进行标志性肽段/cd24的绝对定量以及cd24在不同样本中的相对定量。本发明通过mrm的方法检测病患细胞样品中cd24的含量，可辅助辅助生长激素过量/缺乏性疾病的发生，并可辅助生长激素过量/缺乏性疾病进程的监测以及治疗后的预后评估。本发明方法可用于检测细胞样品中的cd24含量，也可用于检测其他临床样本例如组织样品、细胞样品、尿液样品中的cd24含量；进而对辅助生长激素过量/缺乏性疾病的诊断，病程检测，预后评价中的辅助参考。
31、本发明优点包括但不限于：选择的肽段具有代表性，可应用型。本发明结合mrm定量方法技术体系的目标肽段选择的一般理论判据与实际样本检测到的可选用cd24酶解肽段，最终确定目标样本中cd24的mrm靶向定量的标志性肽段序列为setttgtssdssqstsnsglapnptdattk(seq id no.1)。
32、本发明方法是专门针对(细胞样品)中cd24的进行mrm靶向检测的，质谱参数见表1。lc-ms/ms的色谱，质谱等一系列参数的优化都是基于能更精准的检测细胞样品中cd24的含量。目前开发的细胞样品蛋白的mrm检测方法是为了实现快速检测目标蛋白的绝对/相对含量，其色谱，质谱参数的优化设置需要兼顾检测时间与检测限；本发明的方法中，优化的lc-ms/ms的色谱，质谱等一系列参数能更精准的进行(目标样本)cd24的靶向定量图2。
33、表1：cd24蛋白定量肽段及其质谱参数
34、
35、本发明还提供了一种测量用试剂盒/试剂/产品，其用于对信号传感器cd24表达量的mrm靶向测量方法；所述测量用试剂盒/试剂/产品包括但不限于如seq id no.1所述的setttgtssdssqstsnsglapnptdattk的轻标内标肽；进一步还包括蛋白裂解液、还原试剂、烷基化试剂、蛋白内切酶、酶缓冲液等。
36、本发明还提供了基于信号传感器cd24表达量mrm靶向测量的药物药效评价方法，所述方法包括如上所述的信号传感器cd24表达量的mrm靶向测量方法。
37、本发明还公开了所述测量方法、所述评价方法、所述测量用试剂盒/试剂/产品在制备用于信号传感器cd24表达量的检测、疾病诊断、病程监测或预后评估的产品/制品中的应用。本发明为非诊断目的。
38、与现有技术相比，本发明提供的方法具有操作简单、准确性高、重复性好、检测灵敏度高和通用性强等优点。因此，本发明提供的smrm靶向测量方法是在cd24蛋白检测领域一个具有广泛应用前景的创新方法。
1.一种信号传感器cd24表达量的mrm靶向测量方法，其特征在于，所述测量方法通过检测cd24的标志性肽段的含量来代表cd24蛋白的表达量；所述的cd24的标志性肽段序列为如seq id no.1所述的setttgtssdssqstsnsglapnptdattk；所述测量方法包括以下步骤：生物样品的前处理，mrm方法开发，样本中cd24的mrm检测与数据分析。
2.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述cd24的标志性肽段是指序列为如seq id no.1所述的setttgtssdssqstsnsglapnptdattk的轻标内标肽；所述的轻标内标肽由重组人cd24蛋白还原烷基化后产生；和/或，所述标志性肽段序列为如seq id no.1所述的setttgtssdssqstsnsglapnptdattk的分子量分别为776.99。
3.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的测量方法检测来自所述生物样品细胞中的蛋白质消化物的cd24的肽段片段的含量，所述的表达量是指相对含量或者绝对含量；所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物或者胰蛋白酶消化物。
4.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，用于检测的所述生物样品包括对照和/或药物处理后细胞样品、组织样品、细胞样品、细胞样品、尿液样品。
5.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的测量方法是通过mrm检测样品中cd24的标志性肽段的mrm特征峰面积以及掺入样品中浓度已知的重组人cd24蛋白的mrm特征峰面积性，对比峰面积，即可计算出样品中cd24的相对含量，通过对比已知浓度的轻标肽段峰面积做线性方程，带入比例即可测出样品中cd24的绝对含量。
6.如权利要求5所述的测量方法，其特征在于，所述的对cd24的标志性肽段的mrm检测，特征峰面积计算是通过检测标志性肽段母离子与其产生的子离子碎片组成的母子离子对组合实现的；和/或，所述的标志性肽段的母子离子对组合为：776.99/886.2。
7.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述测量方法包括使用质谱测定；所述的质谱为三重四级杆质谱(sciex triple quadtm6500+)；所述的质谱采用的模式是动态多反应监测模式mrm；所述的cd24的mrm靶向质谱检测的优化后的参数为：去簇电压设为40，q1/q3四级杆设为unit，喷雾电压5500v，帘气35psi，鞘气55psi，辅助加热气55psi，辅助加热气温度550℃，cad:medium，质谱检测参数见表1。
8.一种药效评价方法，其特征在于，其基于如权利要求1所述的信号传感器cd24表达量的mrm靶向测量方法，用于评估以cd24为药物靶点开发的protac，小分子抑制剂等多种形式药物对cd24蛋白的降解量即药效。
9.一种测量用试剂盒，其特征在于，其包括序列如seq id no.1所述的setttgtssdssqstsnsglapnptdattk的轻标内标肽。
10.如权利要求1-7之任一项所述测量方法、如权利要求8所述的药效评价方法、如权利要求9所述的测量用试剂盒在制备用于cd24的检测、疾病诊断、病程监测或预后评估的产品/制品中的用途、在基于cd24蛋白降解量测定的药物药效评价中的应用。
