本发明属于细胞培养，涉及一种高性能的单一组分cho灌流培养基及其应用，具体涉及一种用于哺乳动物细胞培养用的灌流培养基的制备方法与应用。
背景技术：
1、从1986年美国fda批准第一个治疗性单克隆抗体药物上市，使用cho细胞表达抗体到现在已经有30多年的历史，技术逐渐完善和成熟，从最初的单抗，到现在的二抗，三抗，四抗，不断的推陈出新，疗效越来越好，副作用越来越低，给成千上万的患者带来新的希望。
2、cho细胞已经成为治疗性抗体和融合蛋白类新药开发使用最广泛的宿主细胞，但受到厂房面积和反应器规模的限制，抗体的产量还是无法满足日益增长的市场需求，而灌流培养作为一种的新的培养工艺，对厂房面积和反应器规模要求较小，与传统补料分批培养模式相比，灌流培养技术在可放大性和增加单位体积产率方面具有诸多优势，其中最关键的优势就在于灌流培养工艺使用的生物反应器体积更小，可在相对较小的生产空间下，获得相等甚至更高的产量，一般情况下，灌流培养工艺的产物收率是补料分批培养的10～30倍。
3、传统的分批补料培养模式，种子复苏需要使用基础培养基，生产过程中需要补充培养补料培养基以维持细胞的生长和表达。目前，分批补料培养基中应用最广泛的培养基是国际一线品牌丹纳赫旗下的cytiva平台的hyclonetmactiprotm(以下简称“actipro”)，cell boosttm7a(以下简称“7a”)和cell boosttm7b(以下简称“7b”)，actipro是基础培养基，7a/7b是一款组合型补料培养基，其中cell boosttm7b是一款强碱性的氨基酸浓缩液和cell boosttm7a搭配使用；国产供应商有上海迈邦生物科技有限公司cho maxa，maxfa(以下简称“fa”)和maxfb(以下简称“fb”)、上海多宁生物科技有限公司的dn feed 1和dn feed b(专利号：cn 111748527 b)等。
4、灌流培养工艺是一个相对较新的工艺，所以市面上成熟的培养基比较少，但是因为市场巨大，各个供应商都有解决方案，比如cytiva平台22.36g/l的actipro加上一定补料的7a和7b；上海迈邦生物cho maxa和一定比例的补料fa和fb；merck公司的advanced hd灌注培养基。cytiva和迈邦提供的方案是基础与补料的组合方案，优势是通用性比较好，产量高；缺点是培养基配制成液体培养基后稳定性很差，2～3周就会出现析出，由于灌流培养的周期一般都是30天左右，所以一个灌流培养周期至少要配制2次液体培养基，增加了配液的工作量且存在批间差异；merck公司提供的是单一组分的灌流培养基，液体稳定性较好，但产量不高。
5、综上，开发出一款稳定性好、产量高的单一组分的灌流培养基既可以简化配液操作，避免反复配液，提高批间培养的可重复性乃至于降低工业客户的生产成本，提升产品的核心竞争力具有非常重要的现实意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种性能接近或者超出组合型灌流培养基的单一组分的，无蛋白，无因子的化学成份明确的灌流培养基，适用于cho细胞高密灌流和产物表达。
2、为了实现上述的技术效果，本发明采用如下技术方案：
3、本发明提供了一种稳定的，高效的无蛋白，无生长因子的单一组分的灌流培养基，包括基础培养基、补料培养基和氨基酸衍生物。
4、在一种实施方式中，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、葡萄糖、多胺、p188、乙醇胺盐酸盐、丙酮酸钠、琥珀酸以及无机盐和微量元素。
5、在一种实施方式中，所述补料培养基包括氨基酸、维生素、葡萄糖、多胺、p188、乙醇胺盐酸盐、丙酮酸钠、hepes以及无机盐和微量元素组成。
6、在一种实施方式中，所述基础培养基包括cho maxa，购自上海迈邦生物科技有限公司。
7、在一种实施方式中，所述补料培养基包括maxfa，购自上海迈邦生物科技有限公司。
8、进一步的，本发明的灌流培养基由cho maxa、maxfa和氨基酸衍生物组成。
9、在一种实施方式中，所述cho maxa的添加量为20～25g/l；
10、在一种实施方式中，所述maxfa添加量为9～18g/l；
11、其中氨基酸衍生物由半胱氨酸衍生物，胱氨酸衍生物和酪氨酸衍生物中的一种或者几种组成。
12、优选的，所述氨基酸衍生物由半胱氨酸衍生物，胱氨酸衍生物和酪氨酸衍生物组成。
13、其中半胱氨酸衍生物包括l-半胱氨酸盐酸盐一水合物、n-乙酰基-l-半胱氨酸、s-磺基-l-半胱氨酸钠盐中的一种或几种。
14、进一步的，半胱氨酸衍生物的添加量为0.05～1g/l。
15、其中胱氨酸衍生物由包括丙氨酰-l-胱氨酸、胱氨酸二钠盐一水合物、胱氨酸二盐酸中的一种或几种。
16、进一步的，胱氨酸衍生物的添加量为0.05～1g/l。
17、酪氨酸衍生物包括l-酪氨酸二钠二水合物、甘氨酰-l-酪氨酸-二水合物、磷酸-l-酪氨酸二钠盐中的一种或几种。
18、进一步的，酪氨酸衍生物的添加量为0.05～1g/l。
19、优选的，所述灌流培养基由cho maxa、maxfa和氨基酸衍生物组成。
20、其中氨基酸衍生物由半胱氨酸衍生物，胱氨酸衍生物和酪氨酸衍生物中的一种或者几种组成。
21、优选的，所述氨基酸衍生物由半胱氨酸衍生物，胱氨酸衍生物和酪氨酸衍生物组成。
22、其中半胱氨酸衍生物包括l-半胱氨酸盐酸盐一水合物、n-乙酰基-l-半胱氨酸、s-磺基-l-半胱氨酸钠盐中的一种或几种。
23、进一步的，半胱氨酸衍生物的添加量为0.1～0.8g/l。
24、其中胱氨酸衍生物由丙氨酰-l-胱氨酸、胱氨酸二钠盐一水合物、胱氨酸二盐酸中的一种或几种组成。
25、进一步的，胱氨酸衍生物的添加量为0.1～0.8g/l。
26、酪氨酸衍生物包括l-酪氨酸二钠二水合物、甘氨酰-l-酪氨酸-二水合物、磷酸-l-酪氨酸二钠盐中的一种或几种。
27、进一步的，酪氨酸衍生物的添加量为0.1～0.8g/l。
28、在一种实施方式中，所述cho细胞包括cho-s细胞，cho-k1细胞，chozn细胞，以及dg44细胞。
29、在一种实施方式中，所述灌流培养基为液态制剂或冻干粉剂。
30、在一种实施方式中，所述液态制剂包括浓缩液。
31、本发明的第二个目的是提供一种制备所述灌流培养基的方法，所述方法为将所述灌流培养基的冻干粉剂与超纯水混合，调整ph为6.5～6.8±0.1，搅拌直至澄清，过滤除菌。
32、在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
33、1)取适量容器加入体积分数为60％～70％的超纯水，水温20～30℃；
34、2)加入基础培养基、补料培养基和氨基酸衍生物，搅拌直至粉末溶解成悬浊液。
35、3)调节液体培养基的ph值至6.5～6.8±0.1，继续搅拌直至干粉完全溶解。
36、4)加入适量超纯水，定容至终体积，继续搅拌5～20min，测量培养基最终的ph值，渗透压和浊度。
37、5)过滤除菌，避光冷藏。
38、优选的，所述步骤1)初始超纯水的用量为终体积的65～70％；水温为25～30℃。
39、所述步骤3)液体培养基的ph值应大于6.4，更优选的6.6～6.7±0.1；浊度应小于5ntu，更优选的小于3ntu；渗透压应小于400mosm/kg，更优选的，渗透压为300～380mosm/kg，最优选的，渗透压为340～380mosm/kg。
40、本发明的第三个目的在于提供上述灌流培养基在细胞培养中的应用。
41、在一种实施方式中，所述应用包括生产目的蛋白。
42、在一种实施方式中，通过灌流培养外源表达目的蛋白的细胞实现目的蛋白的生产。
43、在一种实施方式中，所述细胞包括cho细胞。
44、优选的，所述cho细胞包括cho-s细胞，cho-k1细胞，chozn细胞，以及dg44细胞。
45、另外，本发明还提供一种cho细胞灌流培养方法，包括如下步骤：
46、1)种子细胞摇瓶复苏后，传代2～3代后，细胞活率达到95％以上时，按照0.5×106个/ml的密度接种到基础培养基内，接种日计为d0；
47、2)接种后，每日取样，计算细胞密度和活率，维持糖含量不低于2g/l；采用摇管或反应器进行细胞培养：
48、a.摇管培养，每天换液，当细胞密度达到(15～20)×106个细胞/ml的时，更换至所述灌流培养基培养；
49、b.反应器培养，接种后第二天使用基础培养基按照0.5vvd进行灌流，以后每天逐步调整，直至细胞密度达到(15～20)×106个细胞/ml的时候，切换至所述灌流培养基培养。
50、3)一般细胞活率低于80％，停止培养，检测细胞培养液表达产物的产量。
51、本发明具有如下有益效果：
52、本发明的灌流培养基配液后ph为中性范围，单一组分，不含蛋白质，水解物，无生长因子，为化学成份明确培养基，配制方法简单，配制的溶液稳定性好，可在冷藏条件或常温条件下稳定存放3个月不析出，避免反复配液，可以常温保存无需放置在冷藏环境，有效降低工业生产成本；
53、应用本发明的灌流培养基灌流培养细胞，从细胞活率、细胞密度、乳酸代谢的趋势以及目的蛋白的表达量与市售培养基相比无显著差异，应用前景广阔。
54、本发明提供的灌流培养基以及利用该灌流培养基灌流培养cho细胞的方法是参考了actipro、“7a”和“7b”以及cho maxa、“fa”和“fb”灌流培养cho细胞的方法，因本发明的培养基将上述的三款培养基整合为一款单一的灌流培养基，所述培养基配方的体系没有变化，在细胞生长，活率维持和产物提升方面与组合型灌流培养基基本无差异，但是本灌流培养基为单一组分的培养基，无论是培养基的生产成本，还是在配液和工艺参数控制方面都节省了生产成本和简化了操作，应用前景广阔。
1.一种cho细胞灌流培养基，其特征在于，所述灌流培养基包括基础培养基、补料培养基和氨基酸衍生物；所述氨基酸衍生物由半胱氨酸衍生物，胱氨酸衍生物和酪氨酸衍生物组成。
2.根据权利要求1所述的灌流培养基，其特征在于，所述基础培养基的添加量为20～25g/l，所述补料培养基的添加量为9～18g/l，所述半胱氨酸衍生物的添加量为0.05～1g/l，所述胱氨酸衍生物的添加量为0.05～1g/l，所述酪氨酸衍生物的添加量为0.05～1g/l。
3.根据权利要求1或2所述的灌流培养基，其特征在于，所述半胱氨酸衍生物包括l-半胱氨酸盐酸盐一水合物、n-乙酰基-l-半胱氨酸、s-磺基-l-半胱氨酸钠盐中的一种或几种；
4.根据权利要求1或2所述的灌流培养基，其特征在于，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、葡萄糖、多胺、p188、乙醇胺盐酸盐、丙酮酸钠、琥珀酸以及无机盐和微量元素；
5.根据权利要求1～4任一所述的灌流培养基，其特征在于，所述cho细胞包括cho-s细胞，cho-k1细胞，chozn细胞或dg44细胞。
6.根据权利要求1～5任一所述的灌流培养基，其特征在于，所述灌流培养基为干粉培养基或液体培养基。
7.权利要求1～6任一所述灌流培养基在细胞培养中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括生产目的蛋白；可选的，通过灌流培养外源表达目的蛋白的细胞实现目的蛋白的生产。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述细胞包括cho细胞；可选的，所述cho细胞包括cho-s细胞，cho-k1细胞，chozn细胞或dg44细胞。
10.一种制备权利要求1～6任一所述灌流培养基的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1～6任一所述的灌流培养基的冻干粉剂与超纯水混合，调整ph为6.5～6.8±0.1，搅拌直至澄清，过滤除菌。
