本发明属于生化工程领域，涉及一种利用蔗糖及糖蜜的大肠杆菌工程菌及其发酵生产支链氨基酸(bcaa:l-缬氨酸、l-异亮氨酸及l-亮氨酸)的方法。
背景技术：
1、支链氨基酸(bcaa)是指α-碳上含有分支脂肪烃链的中性氨基酸，包括l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-缬氨酸，是人和动物必需氨基酸。三种支链氨基酸的生物合成途径，部分共享相同的前体物质和酶。支链氨基酸不能被高等动物自身合成，只能通过食物补充。支链氨基酸占必需氨基酸的40％，其足够的添加量及合理的比例对动物的正常发育十分重要。支链氨基酸的主要功能包括：细胞吸收能量增加，细胞活力提升，延缓细胞衰老，清除自由基，提升组织器官功能，抗疲劳，皮肤美容，提高心肺、心肌能力，提高心脑血管保护作用，降低脂肪，抗心力衰竭，骨骼肌合成以及提高免疫力。其在食品、医药、保健品、饲料、化妆品等领域均有着重要的应用。
2、支链氨基酸的生产方法有提取法、化学合成法、微生物发酵法等。提取法和化学合成法由于原料来源受限，生产成本高，难以实现工业化生产。与其他大部分l-氨基酸的生产相似，微生物发酵法是当前工业生产支链氨基酸的主要方法。微生物发酵法原料成本低，反应条件温和，容易实现大规模生产。但是，目前我国以微生物发酵法生产bcaa的技术尚不成熟，发酵水平不高，导致发酵周期长，产酸偏低，杂酸多，成为影响我国支链氨基酸产业化应用的首要因素。特别是由于l-亮氨酸及l-异亮氨酸的合成途径长、反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。
3、糖蜜是糖厂生产过程中的主要副产品，主要成分为糖类，其中蔗糖含量较高。甘蔗糖蜜含蔗糖约24％～36％，其他糖约12％～24％；甜菜糖蜜所含糖类几乎全为蔗糖，约47％之多，同时含有无机盐、维生素等成分，可提供微生物生长代谢所需的营养物质，是十分具有潜力的廉价生物质资源。大肠杆菌具有遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，易于进行工业化大规模生产。在目前已知可安全使用于实验室研究和工业生产的四种大肠杆菌菌株中，除e.coliw菌株外，其他菌株如escherichiacolik12等均不能利用蔗糖。e.coli w(atcc9637)菌株因具有天然的蔗糖代谢系统，可利用蔗糖为唯一碳源进行生长及发酵，其蔗糖代谢操纵子包括cscb、csck、csca、cscr基因及自身的内源启动子。e.coliw菌株代谢蔗糖时，胞外蔗糖首先被cscb基因表达的蔗糖通透酶转运至胞内，随后蔗糖被csca基因表达的蔗糖水解酶水解为果糖和葡萄糖，果糖经csck基因表达的果糖激酶磷酸化后进入碳代谢途径，cscr基因编码的阻遏蛋白负调控蔗糖代谢。与大肠杆菌w菌株不同，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)利用pep-蔗糖磷酸转移酶系统吸收蔗糖，其蔗糖利用途径由蔗糖操纵子sacap编码。sacp是蔗糖磷酸转移酶系统pts中的蔗糖特异性酶ii(ptssuc-eii)，且在大肠杆菌中有正常活性；saca负责将磷酸化的蔗糖水解为6-磷酸葡萄糖和果糖。对于常用于氨基酸工业生产的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)和黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)，只具有pep-蔗糖磷酸转移酶系统吸收蔗糖并通过磷酸蔗糖水解酶将磷酸蔗糖分解为6-磷酸葡萄糖和果糖，但由于它们缺乏内源的果糖激酶，导致它们无法直接利用这种内源果糖(但可以将果糖外排至培养基再利用pts系统将果糖磷酸化转运回胞内)。以谷氨酸棒杆菌为例，其pep-蔗糖磷酸转移酶系统酶ii(ptssuc-eii)基因为ptss，磷酸蔗糖水解酶基因为scrb。
4、目前，国内已有多家企业利用大肠杆菌工程菌发酵生产支链氨基酸。因此改造大肠杆菌使其能够利用蔗糖及糖蜜发酵合成支链氨基酸，进而降低生产成本，对提高市场竞争力具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明具体的方面如下：
2、本发明第一方面提供一种使用蔗糖或糖蜜为碳源生产支链氨基酸的工程菌株，其含有如下促进蔗糖利用的基因或缺失：
3、1)促进蔗糖向微生物体内的蔗糖通透酶基因或pep-蔗糖磷酸转移酶系统酶ii(ptssuc-eii)基因或其组合；
4、2)蔗糖水解酶基因或磷酸蔗糖水解酶基因或其组合；
5、3)果糖激酶基因；
6、以及任选的4)缺失cscr基因(keggaccessionno.：ecw_m2597)；
7、条件是当改造前菌株为e.coliw(atcc9637)或基于e.coliw(atcc9637)构建的菌株时，则缺失cscr基因(keggaccessionno.：ecw_m2597)；
8、优选地，1)-3)为同时出现的基因组合。
9、在本发明的优选方面：
10、其中蔗糖通透酶基因为来源于e.coliw(atcc9637)基因组的cscb基因(keggaccessionno.：ecw_m2594)；
11、pep-蔗糖磷酸转移酶系统酶ii(ptssuc-eii)基因为来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)基因组的sacp基因(keggaccessionno.：bsu38050)或来源于谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicumatcc13032)的ptss基因(keggaccessionno.：cg2925)；
12、蔗糖水解酶基因为来源于e.coliw(atcc9637)基因组的csca基因(keggaccessionno.：ecw_m2596)，或为来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)基因组的saca基因(kegg accessionno.：bsu38040)，或其组合；
13、果糖激酶基因为来源于e.coliw(atcc9637)基因组的csck基因(keggaccessionno.：ecw_m2595)，或为来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)基因组的gmue(ydhr)基因(keggaccessionno.：bsu05860)，或其组合；
14、优选地，所述基因组合包含至少一个来自枯草芽孢杆菌的基因或谷氨酸棒杆菌的基因。
15、本发明进一步优选基因组合1)-3)具体如下：
16、
17、在本发明具体的实施方式中，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱氨酶的基因和/或乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了l-异亮氨酸抑制的相应基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilva基因，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种。
18、在本发明具体的实施方式中，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，所述基因工程菌株中乙醇、乙酸、乳酸为代表的杂酸杂醇代谢副产物的生成通路被减弱或阻断，例如下列基因ldha、adhe、pta、poxb的活性分别或同时被减弱或消除。
19、在本发明具体的实施方式中，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱水酶基因、苏氨酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvc)、二羟酸脱水酶基因(ilvd)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilve)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种；
20、在本发明具体的实施方式中，所述基因工程菌株进一步包括异丙基苹果酸合成酶(leua)、异丙基苹果酸脱氢酶(leub)、异丙基苹果酸脱水酶(大亚基，leuc)、异丙基苹果酸脱水酶(小亚基，leud)中的一种或多种。
21、在本发明具体的实施方式中，所述工程菌株为野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus)、短杆菌(brevibacterium)、酵母(yeast)、棒杆菌(corynebacterium)或链霉菌(streptomyces)。
22、在本发明具体的实施方式中，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收bcaa的能力，和或具有所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌bcaa的能力；优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸abc转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnq基因或抑制brnq基因的表达；进一步优选地敲除或突变livjkhmgf基因的一个或多个或抑制livjkhmgf基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygazh、brnef、yjeh或leue的表达被增强，进一步优选，增强ygazh、brnef、yjeh或leue表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。
23、在本发明具体的实施方式中，所述工程菌株构建的方法包括质粒表达，基因组整合如crispr、lambda-red、噬菌体等介导的同源重组。
24、本发明第二方面提供上述工程菌株在制备支链氨基酸优选l-异亮氨酸、l-亮氨酸或l-缬氨酸中，或制备含支链氨基酸优选l-异亮氨酸、l-亮氨酸或l-缬氨酸食品、保健品或饲料中的用途。
25、本发明第三方面提供一种生产支链氨基酸优选l-异亮氨酸、l-亮氨酸或l-缬氨酸的方法，其特征在于，包括步骤：
26、(i)在以蔗糖或糖蜜为碳源的培养基中培养本发明上述任一项所述的工程菌株；
27、(ii)从(i)的培养物中分离支链氨基酸。
28、ii.具体实施方式
29、下文将结合具体实施例对本发明的合成方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
30、实施例
31、实施例1：重组质粒pzs-pcsc-cscbka、pzs-p1-93-sacpa-gmue、pzs-p1-93-ptss-scrb-csck、pzs-p1-93-ptss-scrb-gmue、pzs-p1-93-sacpa-csck和pzs-pcsc-cscbka-p1-93-sacpa-csck的构建
32、通过pcr克隆e.coliw基因组中参与蔗糖代谢的cscbka基因簇(在基因簇中间自带双向内源启动子pcsc)(csca：genbankgeneid：12696354；cscb：genbankgeneid：12696352；csck：genbankgeneid：12696353)，利用吉布森组装(gibsonassembly)2将获得的pcsc-cscbka片段连接到质粒pzslac1的xhoi与xbai位点之间，获得重组质粒pzs-pcsc-cscbka。
33、通过pcr从bacillussubtilis168基因组中克隆蔗糖磷酸转移酶(ptssuc-eii)基因及磷酸蔗糖水解酶sacpa基因簇(sacp：genbankgeneid：937266；saca：genbankgeneid：937277)，及果糖激酶基因gmue(ydhr)(genbankgeneid：938016)；利用吉布森组装将sacpa和gmue基因片段顺序连接到质粒pzslac的xhoi与xbai位点之间，并受控于同时插入的强启动子p1-933之后，获得重组质粒pzs-p1-93-sacpa-gmue。
34、通过pcr分别克隆e.coliw基因组中的果糖激酶基因csck，和从corynebacteriumglutamicumatcc13032基因组中克隆蔗糖磷酸转移酶(ptssuc-eii)基因ptss(genbankgeneid：3345489)和磷酸蔗糖水解酶scrb基因(genbankgeneid：3345082)；利用吉布森组装将ptss、scrb和csck基因片段顺序连接到质粒pzslac的xhoi与xbai位点之间，并受控于同时插入的强启动子p1-93之后，获得重组质粒pzs-p1-93-ptss-scrb-csck。
35、通过pcr分别克隆bacillussubtilis168基因组的果糖激酶基因gmue和从corynebacteriumglutamicumatcc13032基因组中克隆蔗糖磷酸转移酶基因ptss和磷酸蔗糖水解酶scrb基因；利用吉布森组装将ptss、scrb和gmue基因片段顺序连接到质粒pzslac的xhoi与xbai位点之间，并受控于同时插入的强启动子p1-93之后，获得重组质粒pzs-p1-93-ptss-scrb-gmue。
36、通过pcr分别克隆e.coliw基因组中果糖激酶基因csck，和从bacillussubtilis168基因组中克隆蔗糖磷酸转移酶基因及磷酸蔗糖水解酶sacpa基因簇，利用吉布森组装将sacpa和csck基因片段顺序连接到质粒pzslac的xhoi与xbai位点之间，并受控于同时插入的强启动子p1-93之后，获得重组质粒pzs-p1-93-sacpa-csck。
37、通过pcr克隆e.coliw基因组中参与蔗糖代谢的cscbka基因簇(在基因簇中间自带双向内源启动子pcsc)；并且利用pcr获得线性化的pzs-p1-93-sacpa-gmue，利用吉布森组装将pcsc-cscbka片段连接到质粒pzs-p1-93-sacpa-gmue启动子xhoi位点之后及启动子p1-93之前，获得重组质粒pzs-pcsc-cscbka-p1-93-sacpa-gmue。
38、将pzs-pcsc-cscbka、pzs-p1-93-sacpa-gmue、pzs-p1-93-ptss-scrb-csck、pzs-p1-93-ptss-scrb-gmue、pzs-p1-93-sacpa-csck和pzs-pcsc-cscbka-p1-93-sacpa-gmue重组质粒分别转化至含有pze-ilvcmde-ygazh和pza-ilvaih质粒的基于大肠杆菌bw25113(dsm27469/cgsc7636)背景的菌株dv10(δldhaδptaδpoxbδadheδpflbδmgsaδfrdaδdadaδavtaδilve)(中国专利公开号：cn114410701a)菌株中，得到的菌株分别命名为di10-suc1、di10-suc2、di10-suc3、di10-suc4、di10-suc5和di10-suc6。
39、实施例2：基于dv10底盘菌生产l-异亮氨酸
40、采用实例1中的菌株di10-suc1、di10-suc2、di10-suc3、di10-suc4、di10-suc5和di10-suc6，使用发酵培养基(蔗糖或糖蜜4％、苏氨酸2％、酵母提取物0.5％、mgso40.12％、cacl20.01％、nh4cl1％、nacl0.05％、na2hpo40.6％、kh2po40.3％、vb10.0005％。用naoh和盐酸调ph至7.0～7.2，115℃灭菌15min)进行发酵。发酵过程及方法如下：将菌种接入lb培养基中，于37℃下培养10h，转速240rpm。将lb培养物接种量为4％接入含有适当浓度的氨苄青霉素、卡那霉素发酵和盐酸大观霉素的上述100ml发酵培养基的500ml摇瓶中(含有20g/lcaco3作为ph稳定剂)中，透气膜封口；在37℃，220rpm条件下培养至od600为2，加入iptg诱导(终浓度为0.1mm)，继续培养至48h停止发酵。发酵结果异亮氨酸产量见表1。
41、表1：实施例2中各菌株的异亮氨酸(ile)发酵结果
42、
43、实施例3：基于dv10底盘菌生产l-缬氨酸
44、因缬氨酸的代谢途径与异亮氨酸的后期途径及酶一致且重合，因此生产异亮氨酸的菌株也可以用于生产缬氨酸。采用实施例1中的菌株di10-suc1、di10-suc2、di10-suc3、di10-suc4和di10-suc5进行缬氨酸发酵，培养基同实施例1。发酵过程及培养方法如下：将菌种接入lb培养基中，于37℃下培养10h，转速240rpm。将lb培养物接种量为4％接入含有适当浓度的氨苄青霉素、卡那霉素发酵和盐酸大观霉素的上述100ml发酵培养基的500ml摇瓶中(含有20g/lcaco3作为ph稳定剂)中；在37℃，220rpm条件下培养至od600为2，加入iptg诱导(终浓度为0.1mm)同时将透气封口膜更换为不透气的封口膜，继续培养至48h停止发酵。发酵结果缬氨酸产量见表2。
45、表2：实施例3中各菌株的缬氨酸(val)发酵结果
46、
47、实施例4：基于dv10底盘菌生产l-亮氨酸
48、将质粒组合①pzs-pcsc-cscbka，pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih；②pzs-p1-93-sacpa-gmue，pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih；③pzs-p1-93-ptss-scrb-csck，pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih；④pzs-p1-93-ptss-scrb-gmue，pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih；⑤pzs-p1-93-sacpa-csck，pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih；及⑥pzs-pcsc-cscbka-p1-93-sacpa-gmue，pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih分别电转化转入dv10菌株中(pza-leuabcd-ilvih来自中国专利申请号：2022116349801，名称：“一种提高支链氨基酸(bcaa)产量的方法及菌株构建”)，得到的亮氨酸生产菌株分别命名为dl10-suc1、dl10-suc2、dl10-suc3、dl10-suc4、dl10-suc5和dl10-suc6，使用这些菌株进行亮氨酸发酵，发酵培养基为：蔗糖或糖蜜4％、酵母提取物0.5％、mgso40.12％、cacl20.01％、nh4cl1％、nacl0.05％、na2hpo40.6％、kh2po40.3％、vb10.0005％。用naoh和盐酸调ph至7.0～7.2，115℃灭菌15min。发酵流程控制及培养方法如下：将菌种接入lb培养基中，于37℃下培养10h，转速240rpm。将lb培养物接种量为4％接入含有适当浓度的氨苄青霉素、卡那霉素发酵和盐酸大观霉素的上述100ml发酵培养基的500ml摇瓶中(含有20g/lcaco3作为ph稳定剂)中，透气膜封口；在37℃，220rpm条件下培养至od600为2，加入iptg诱导(终浓度为0.1mm)，继续培养至48h停止发酵。发酵结果亮氨酸产量见表3。
49、表3：实施例4中各菌株的亮氨酸(leu)发酵结果
50、
51、实施例5：缺失e.coliw菌株的cscr基因
52、使用基于λ-red大肠杆菌重组系统4-6，根据cscr基因(keggaccessionno.：ecw_m2597)两侧的序列，设计引物从pkd13质粒上扩增带有cscr旁侧序列的卡那霉素抗性基因kan，获得δcscr::kanpcr片段，将该片段经过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化，然后电转化l-阿拉伯糖诱导培养后的菌株e.coliw/pkd46，转化后将培养物涂布于含50mg/l卡那霉素的lb平板上，37度下培养过夜，得到e.coliwδcscr::kan菌株。然后用pcp20质粒电转化e.coliwδcscr::kan菌株，转化物涂布于含有100mg/l的氨苄青霉素的lb平板上，置于30度培养，对长出的转化子进行pcr验证；将kan基因被正确移除的转化子在lb平板上划线单菌落，置于37度培养，最终得到去除pcp20质粒的无抗性大肠杆菌菌株e.coliwδcscr，命名为w-suc菌株。
53、实施例6：使用e.coliw底盘菌发酵生产l-异亮氨酸
54、将pze-ilvcmde-ygazh和pza-ilvaih质粒转化至天然能代谢蔗糖的e.coliw-suc菌株，获得质粒菌株wi-suc。培养基为现有普遍采用的发酵培养基：蔗糖或糖蜜4％、苏氨酸2％、酵母提取物0.5％、mgso40.12％、cacl20.01％、nh4cl1％、nacl0.05％、na2hpo40.6％、kh2po40.3％、vb10.0005％。用naoh和盐酸调ph至7.0～7.2，115℃灭菌15min。
55、培养方法：将菌种接入lb培养基中，于37℃下培养10h，转速240rpm。将lb培养物接种量为4％接入含有适当浓度的氨苄青霉素、卡那霉素发酵的上述100ml发酵培养基的500ml摇瓶中(含有20g/lcaco3作为ph稳定剂)中，透气膜封口；在37℃，220rpm条件下培养至od600为2，加入iptg诱导(终浓度为0.1mm)，继续培养至48h停止发酵。wi-suc菌株当碳源为蔗糖时产出l-异亮氨酸2.1g/l；当碳源为糖蜜时产出l-异亮氨酸1.8g/l。
56、实施例7：使用e.coliw底盘菌发酵生产l-缬氨酸
57、同实施例3类似，wi-suc菌株在特定条件下也可用于生产缬氨酸。按照实施例3所述的发酵流程控制和培养条件使用wi-suc菌株进行缬氨酸发酵。iptg诱导48小时后发酵停止时，wi-suc菌株碳源为蔗糖时产出l-缬氨酸3.2g/l；碳源为糖蜜时产出l-缬氨酸2.7g/。
58、实施例8：使用e.coliw底盘菌发酵生产l-亮氨酸
59、将pze-ilvcmde-ygazh和pza-leuabcd-ilvih质粒转化至可天然利用蔗糖的w-suc菌株中，获得wl-suc菌株。按照实施例4所述的培养基及发酵条件使用wl-suc菌株进行亮氨酸发酵。iptg诱导48小时后发酵停止时，wl-suc菌株碳源为蔗糖时产出l-亮氨酸1.6g/l；碳源为糖蜜时产出l-亮氨酸1.1g/l。
60、本发明提供的基于蔗糖或糖蜜培养基生产支链氨基酸(bcaa)的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现要素：
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的培养基试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
61、参考文献
62、1.zhang,k.；li,h.；cho,k.m.；liao,j.c.,expandingmetabolismfortotalbiosynthesisofthenonnaturalamino acidl-homoalanine.proceedingsofthenationalacademyofsciences2010,107(14),6234-6239.
63、2.gibson,d.g.；young,l.；chuang,r.-y.；venter,j.c.；hutchison,c.a.；smith,h.o.,enzymaticassemblyof dnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.naturemethods2009,6(5),343-345.
64、3.lu,j.；tang,j.；liu,y.；zhu,x.；zhang,t.；zhang,x.,combinatorialmodulationofgalpandglkgeneexpression forimprovedalternativeglucoseutilization.appliedmicrobiologyandbiotechnology2012,93(6),2455-2462.
65、4.baba,t.；ara,t.；hasegawa,m.；takai,y.；okumura,y.；baba,m.；datsenko,k.a.；tomita,m.；wanner,b.l.；mori,h.,constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection.molecular systemsbiology2006,2(1),2006.0008.
66、5.yu,d.；ellis,h.m.；lee,e.c.；jenkins,n.a.；copeland,n.g.；court,d.l.,anefficientrecombinationsystem forchromosomeengineeringinescherichiacoli.procnatlacadsciusa2000,97(11),5978-83.
67、6.datsenko,k.a.；wanner,b.l.,one-stepinactivationofchromosomalgenesin<i>escherichiacoli</i>k-12using pcrproducts.proceedingsofthenationalacademyofsciences2000,97(12),6640-6645.
1.一种使用蔗糖或糖蜜为碳源生产支链氨基酸的工程菌株，其含有如下促进蔗糖利用的基因或缺失：
2.如权利要求1所述的基因工程菌株，
3.如权利要求1-2任一项所述的基因工程菌株，其中所述基因组合1)-3)具体如下：
4.如权利要求1-3任一项所述基因工程菌株，其进一步包括苏氨酸脱氨酶的基因和/或乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了l-异亮氨酸抑制的相应基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilva基因，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种。
5.如权利要求1-4任一项所述基因工程菌株，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，所述基因工程菌株中乙醇、乙酸、乳酸为代表的杂酸杂醇代谢副产物的生成通路被减弱或阻断，例如下列基因ldha、adhe、pta、poxb的活性分别或同时被减弱或消除。
6.如权利要求1-5任一项所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株包括苏氨酸脱水酶基因、苏氨酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvc)、二羟酸脱水酶基因(ilvd)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilve)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种；
7.如权利要求1-6任一项所述基因工程菌株，其中，所述工程菌株为野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus)、短杆菌(brevibacterium)、酵母(yeast)、棒杆菌(corynebacterium)或链霉菌(streptomyces)。
8.如权利要求1-7任一项所述的工程菌株，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收bcaa的能力，和或具有所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌bcaa的能力；优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸abc转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnq基因或抑制brnq基因的表达；进一步优选地敲除或突变livjkhmgf基因的一个或多个或抑制livjkhmgf基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygazh、brnef、yjeh或leue的表达被增强，进一步优选，增强ygazh、brnef、yjeh或leue表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。
9.如权利要求1-8任一项所述的工程菌株，所述工程菌株构建的方法包括质粒表达，基因组整合如crispr、lambda-red、噬菌体等介导的同源重组。
10.权利要求1-8任一项所述的工程菌株在制备支链氨基酸优选l-异亮氨酸、l-亮氨酸或l-缬氨酸中，或制备含支链氨基酸优选l-异亮氨酸、l-亮氨酸或l-缬氨酸食品、保健品或饲料中的用途。
11.一种生产支链氨基酸优选l-异亮氨酸、l-亮氨酸或l-缬氨酸的方法，其特征在于，包括步骤：
