本发明属于生物医药，具体涉及能特异性结合人转化生长因子-β1(tgf-β1)的抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及所述抗体的制备方法和用途。
背景技术：
1、人转化生长因子-β(transforming growth factor beta，tgf-β)是一种25kda的由二硫键连接的二聚体蛋白分子。在人体中，tgf-β有3种结构相似的异构体，tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3。tgf-β的前体蛋白具有n端潜在相关肽(latency-associated peptide)，在内肽酶、弗林蛋白酶作用下产生二聚体n端潜在相关肽和二聚体c端成熟tgf-β分子，两者形成小潜在复合物(small latent complex)。此复合物被转移至细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)中与tgf-β结合蛋白结合后形成大潜在复合物(large latent complex)，在一系列复杂反应后，tgf-β被活化并从复合物中释放。活化的tgf-β可通过参与调控多种细胞信号通路发挥其广泛的生物学效应。当活化的tgf-β与高亲和的转化生长因子-β受体-2(transforming growth factor-βreceptor-2，tβrii)结合，在tβriii的参与下，tβrii发生结构变化，tβri，一种丝氨酸/苏氨酸激酶，随即被招募至tgf-β/τβrii复合物中。此复合物可磷酸化smad2和smad3，后者与smad4形成的复合物可进入细胞核内作用于多种转录因子，参与调节多种细胞活动。
2、tgf-β1在细胞信号通路中的作用使得其具有多种细胞调节功能。它参与调节细胞生长分化，细胞凋亡，细胞机动，ecm合成，细胞免疫反应等多种细胞活动。研究指出，tgf-β1在多种疾病中扮演着抑制或促进的双重作用。值得注意的是，tgf-β1在肿瘤发生的早期阶段呈现抑瘤效果，然而在肿瘤发生的后期，tgf-β1则促进肿瘤生长，转移和浸润。tgf-β1可以通过阻滞细胞周期进程来抑制肿瘤，肿瘤细胞可通过一系列使得tgf-β/τβrii复合物中及其下游相关蛋白分子失活的变异来逃逸tgf-β1早期对肿瘤发展的抑制作用，并开始过度表达tgf-β分子来促进细胞增殖和肿瘤浸润。tgf-β1促进肿瘤生长和发展的机制主要有3种：诱导癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，emt)；促进肿瘤转移及浸润；免疫抑制。emt重塑细胞骨架，增强细胞机动性，促进肿瘤细胞的转移和浸润。研究表明tgf-β在激活促emt信号方面具有至关重要的作用。tgf-β1的增加和肺癌循环肿瘤细胞的增加以及肺转移相关。tgf-β1提高血管上皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，vegf)表达，促进血管生成。研究发现在恶性肿瘤中tgf-β1通过抑制nk细胞活性，降低细胞因子表达，抑制树突细胞成熟及改变t细胞的细胞毒性来肿瘤微环境中的免疫反应。在肿瘤微环境中，调节性t细胞(tregs)通过抑制细胞毒性t细胞和辅助性t细胞的功能抑制免疫系统的抑瘤作用，tgf-β1则被证实可提高调节性t细胞(tregs)的数量。
3、由于tgf-β1的多种促瘤效应，tgf-β1及其相关的信号通路蛋白被认为是极具潜力的抑瘤靶点。针对特异性阻断tgf-β1与其受体结合的方式受到领域关注。已有研究表明特异性识别结合tgf-β1的单克隆抗体可降低肿瘤的浸润侵袭和转移，调节肿瘤微环境的免疫活动，提高抗肿瘤治疗效果。
4、当前大部分完整抗体存在免疫原性高、溶解性差、易沾粘聚集和易被蛋白酶降解等缺点，限制了这类蛋白抗体在封闭tgf-β1进而抑制肿瘤生长和迁移中的应用。因此开发出能高效进入肿瘤内部，并在肿瘤酸性缺氧环境下仍对tgf-β有高亲和力，高特异性结合的抗体至关重要，这将有效改善肿瘤微环境中的免疫功能，抑制肿瘤的发展和转移，提高抗瘤治疗的效果。
5、纳米抗体，是指天然缺失轻链而只有重链可变区的一类抗体，其相对分子量只有15kd，仅为普通抗体分子量的1/10左右，因此也被称为单域抗体或vhh抗体。纳米抗体是目前可以得到的具有完整功能的抗原结合最小单位，其对高密度实体瘤、脑组织的穿透力远强于普通抗体，能高效到达肿瘤位点发挥疗效。同时纳米抗体还易于改造，便于后续改进开发更高亲和高特异的抗体。
6、开发出可高效进入肿瘤内部并高度特异性亲和识别tgf-β的纳米抗体将有效提高抗肿瘤疗效，具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提供特异性结合tgf-β1的抗体或其抗原结合片段，本发明提供的特异性结合tgf-β1的抗体均可识别并结合人tgf-β1，且具有较强的中和tgf-β1的活性。本发明还提供了特异性结合tgf-β1的多肽、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、核酸片段、载体、宿主细胞、药物组合物、制备方法、制药用途以及疾病治疗方法。
2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
3、本发明利用tgf-β抗原冲击免疫羊驼，并建立天然噬菌体展示抗体库，得到特异性tgf-β抗体，最后获得高亲和力的tgf-β抗体。
4、本发明的第一方面提供了一种特异性结合tgf-β1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1、cdr2和cdr3分别包含选自seq id no:1～7任一项所示的vhh结构域中的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
5、在一些实施方案中，各个hcdr1、hcdr2和hcdr3为根据imgt编号系统、kabat编号系统或chothia编号系统确定所述hcdr1、hcdr2和hcdr3；
6、可选地，所述hcdr1具有如seq id no：15、18、21、23、25、26、27、28、29、30、33、36、38、43、47、49或51所示的氨基酸序列；
7、可选地，所述hcdr2具有如seq id no：16、19、22、31、34、37、39、41或44所示的氨基酸序列；
8、可选地，所述hcdr3具有如seq id no：17、20、24、32、35、40、42、45、46、48或50所示的氨基酸序列；
9、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：15、16和17所示的氨基酸序列；或
10、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：18、19和20所示的氨基酸序列；或
11、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：21、22和20所示的氨基酸序列；或
12、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：23、16和24所示的氨基酸序列；或
13、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：25、19和20所示的氨基酸序列；或
14、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：26、22和20所示的氨基酸序列；或
15、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：27、16和17所示的氨基酸序列；或
16、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：28、19和20所示的氨基酸序列；或
17、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：29、22和20所示的氨基酸序列；或
18、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：30、31和32所示的氨基酸序列；或
19、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：33、34和35所示的氨基酸序列；或
20、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：36、37和35所示的氨基酸序列；或
21、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：38、39和40所示的氨基酸序列；或
22、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：25、41和42所示的氨基酸序列；或
23、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：43、44和42所示的氨基酸序列；或
24、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：38、39和45所示的氨基酸序列；或
25、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：25、41和46所示的氨基酸序列；或
26、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：43、44和46所示的氨基酸序列；或
27、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：47、16和48所示的氨基酸序列；或
28、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：49、19和50所示的氨基酸序列；或
29、优选地，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有如seq id no：51、22和50所示的氨基酸序列。
30、根据本发明的实施方案，所述cdr1、cdr2和/或cdr3包含在所述hcdr1、hcdr2和/或hcdr3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
31、根据本发明的实施方案，所述cdr1、cdr2和/或cdr3包含与所述hcdr1、hcdr2和/或hcdr3相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
32、根据本发明的实施方案，所述抗体或抗原结合片段包含纳米抗体，所述纳米抗体包含所述cdr1、cdr2和cdr3。
33、根据本发明的实施方案，所述纳米抗体包含如seq id no:1～7任一项所示的序列；
34、可选地，所述纳米抗体包含与seq id no:1～7任一项所示的序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列，所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换；
35、可选地，所述纳米抗体包含与seq id no:1～7任一项所示的序列相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
36、根据本发明的实施方案，所述纳米抗体包含seq id no:1～7任一项所示vhh结构域中的fr区；
37、可选地，所述纳米抗体包含与seq id no:1～7任一项所示vhh结构域中的fr区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列，所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换；
38、可选地，所述纳米抗体包含与seq id no:1～7任一项所示vhh结构域中的fr区相比具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
39、根据本发明的实施方案，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；或(3)全人抗体或其片段；
40、可选地，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；
41、可选地，所述抗体重链恒定区可源自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；
42、可选地，所述抗体重链恒定区可选自igg、igm、iga、ige或igd，所述igg可选自igg1，igg2，igg3或igg4；
43、可选地，所述重链恒定区可选自fc区、ch3区或完整重链恒定区，优选为人fc区；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
44、根据本发明的实施方案，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、化疗药或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
45、本发明的第二方面提供了一种多肽，所述多肽包含前述抗体或抗原结合片段，优选地，所述多肽还连接有其他功能性分子，所述其他功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签或其他抗原结合分子或细胞因子；
46、优选地，所述其他抗原结合分子特异性结合tgf-β1以外的抗原或结合与前述抗体或抗原结合片段不同的tgf-β1表位；
47、优选地，所述tgf-β1以外的抗原可选自：cd3，优选cd3ε；cd16，优选cd16a；cd19；tgf-βⅱ型受体；nkg2d；cd40；4-1bb；cd137或cd19；egfr；egfrviii；mesothelin；her2；epha2；her3；epcam；muc1；muc16；cea；claudin18.2；叶酸受体；claudin6；wt1；ny-eso-1；mage3；asgpr1或cdh16；
48、优选地，所述其他抗原结合分子为抗体或抗原结合片段；
49、优选地，所述多肽为多特异性抗原结合分子，例如双特异性、三特异性或四特异性，更优选地，所述多特异性抗原结合分子可为二价、四价或六价。
50、本发明的第三方面提供了一种嵌合抗原受体(car)，-所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含前述抗体或抗原结合片段。
51、本发明的第四方面提供了一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达前述的嵌合抗原受体或包含编码前述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自t细胞、nk细胞、nkt细胞、dnt细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述t细胞优选自细胞毒性t细胞、调节性t细胞或辅助性t细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
52、本发明的第五方面提供了一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码前述的抗体或抗原结合片段、前述多肽或前述的嵌合抗原受体。
53、在一些实施方案中，所述核酸片段包含如seq id no:8～14任一项所示的核酸序列。
54、本发明的第六方面提供了一种载体，所述载体包含前述的核酸片段。
55、本发明的第七方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的载体；
56、优选地，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞；更优选地，所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌。
57、本发明的第八方面提供了一种制备前述抗体或抗原结合片段或前述多肽的方法，其中，
58、所述方法包括培养前述宿主细胞，以及分离所述细胞表达的抗体、抗原结合片段或多肽。
59、本发明的第九方面提供了一种制备前述免疫效应细胞的方法，其中，
60、所述方法包括将编码前述嵌合抗原受体(car)的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达前述嵌合抗原受体(car)。
61、本发明的第十方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前述的抗体或抗原结合片段、前述多肽、前述免疫效应细胞、前述的核酸片段、前述载体或根据前述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
62、本发明的第十一方面提供了一种前述的抗体或抗原结合片段、前述的多肽、前述免疫效应细胞、前述的核酸片段、前述载体或前述方法制备获得的产品或前述的药物组合在制备用于抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖的药物中的用途；
63、优选地，其中所述肿瘤选自b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤、高级别胶质瘤、母细胞瘤神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、aids相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病。
64、本发明的第十二方面提供一种抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法，包含向有此需要的患者施用前述的抗体或抗原结合片段、前述的多肽、前述免疫效应细胞、前述的核酸片段、前述载体或前述方法制备获得的产品或前述的药物组合；
65、优选地，其中所述肿瘤选自b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤、高级别胶质瘤、母细胞瘤神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、aids相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病。
66、本发明的第十三方面提供一种试剂盒，其包含前述的抗体或抗原结合片段、前述的多肽、前述免疫效应细胞、前述的核酸片段、前述载体或前述方法制备获得的产品或前述的药物组合；以及使用说明。
67、本发明的有益效果是：本发明提供了能够特异性结合人tgf-β的纳米抗体，所述纳米抗体具有高亲和力，例如编号为vi005-2与vi005-3的纳米抗体具有高亲和力，分别为5.239×10-9m与7.219×10-9m。通过对特异性结合人tgf-β的抗体vi005-1、vi005-2、vi005-3、vi005-4、vi005-5、vi005-6和vi005-7的体外生物学功能的鉴定，发现这些抗体均具有较强的中和tgf-β1的活性，可以制备用于靶向tgf-β高表达疾病的car-t或者单克隆抗体等治疗药物，有非常良好的前景。
68、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅限制，在此不再一一赘述。
1.一种特异性结合tgf-β1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1、cdr2和cdr3分别包含选自seq id no:1～7任一项所示的vhh结构域中的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，
3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述cdr1、cdr2和/或cdr3包含在所述hcdr1、hcdr2和/或hcdr3上发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的氨基酸序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中，
5.根据权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，
6.根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，
7.根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，
8.根据权利要求1～7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，
9.根据权利要求1～8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，
10.多肽，其特征在于，所述多肽包含权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段，优选地，所述多肽还连接有其他功能性分子，所述其他功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签或其他抗原结合分子或细胞因子；
11.一种嵌合抗原受体(car)，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段。
12.一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达权利要求11所述的嵌合抗原受体或包含编码权利要求11所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自t细胞、nk细胞、nkt细胞、dnt细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述t细胞优选自细胞毒性t细胞、调节性t细胞或辅助性t细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
13.一种分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述多肽或权利要求11所述的嵌合抗原受体。
14.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求13所述的核酸片段。
15.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求14所述的载体；
16.一种制备权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求10任一项所述多肽的方法，其中，
17.一种制备权利要求12所述免疫效应细胞的方法，其中，
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多肽、权利要求12所述免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸片段、权利要求14所述载体或根据权利要求16或17所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
19.权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求10所述的多肽、权利要求12所述免疫效应细胞、权利要求13所述的核酸片段、权利要求14所述载体或根据权利要求16或17所述方法制备获得的产品或如权利要求18所述的药物组合在制备用于抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖的药物中的用途；
