：本发明属于生物催化，具体涉及一种改造的fad合成酶突变体及其在制备fmn中的应用。
背景技术
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背景技术：
1、黄素单核苷酸(flavin mononucleotide)，亦称核黄素-5-磷酸，核黄素磷酸钠，是黄素蛋白(flavoprotein)的辅基，对呼吸等生物氧化过程的电子传递起着重要的作用。
2、核黄素磷酸钠别名维生素b2磷酸钠，是核黄素的重要衍生物之一，用于口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎及阴囊炎等疾病的治疗。与核黄素相比，核黄素磷酸钠在水中的溶解度远远高于核黄素，容易被机体吸收利用，且效价远高于核黄素，解决了核黄素只能口服不能制成注射剂的问题。在临床上可被制成核黄素复合制剂、性质稳定的注射液等，在使用上更加便利，应用范围广泛提高。
3、当前合成fmn的方法主要为化学法，酶法和生物发酵法，其中化学法为主。专利jp50025597a、jp50025596a、us5017700a中均公开了化学法，主要是在有机溶剂中使核黄素与pocl3反应生成核黄素4'，5'-环磷酰氯，然后水解磷酰物及过量的pocl3，再用naoh中和，经过滤得到核黄素-5'-磷酸钠，使用剧毒试剂，不利于工业化生产。
4、专利cn108330136 a、jp2008289434a中均公开了发酵法制备fmn，但是转化底物浓度均在毫克级别，严重的限制了产业化应用。
5、动物和人体内的fmn主要来源于体外核黄素的摄取，再经过体内的核黄素激酶作用，使得核黄素磷酸化，实现了fmn的体内合成。在合成fmn的过程中核黄素激酶成为重要的催化剂，现有的核黄素激酶活力非常有限，使得体外用来酶催化核黄素方法制备fmn的过程受到严重的限制，也导致酶法合成fmn的价格昂贵。
6、因此，我们需要寻找一种合适的酶用于制备fmn。
技术实现思路
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技术实现要素：
1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种改造的fad合成酶及操作简单易于产业化的fmn制备方法。
2、一方面，本发明提供了一种新的fad合成酶突变体，该突变体是以seq idno.2所示的野生型fad合成酶为模板，通过敲除片段获得。
3、进一步，所述野生型fad合成酶来源于产氨棒杆菌(corynebacteriumammoniagenes)，基因序列的登录号为wp_066 793436，核苷酸序列和氨基酸序列分别如seqid no.1和seq id no.2所示。
4、更进一步，所述野生型fad合成酶是一种单酶双功能的催化剂，从公布的晶体结构2xok(见图1)中可以发现，该酶有两个明显的结构域，分别是位于n端腺苷转移酶(n-fmnat)和位于c端的核黄素磷酸激酶(c-rfk)，两个结构域在空间结构上距离较远，相互作用的氨基酸较少。通过构建该酶在大肠杆菌中表达，测试发现利用该酶去进行体外催化核黄素，在产物中出现fad和fmn的混合物，且fmn占主要产物，而fad仅有0.3g/l。
5、更进一步，利用结构生物学的辅助，对fad合成酶进行理性的改造，使得该酶失去c端激酶的活性，保留n端腺苷转移酶活性，从而实现从fmn到fad的高效率合成。
6、进一步，利用现有的fad合成酶单独催化fmn，发现合成的fad产物更少，且产物中发现了核黄素，通过结构分析，初步推断底物在反应过程中会优先跟c端的激酶活性区域结合，导致合成fad结合的fmn减少。
7、更进一步，为了阻止fmn与c端激酶的活性区域结合，对该蛋白和fmn、adp的复合晶体结构(pdb：5a8a)进行分析(图1)。通过adp在蛋白结构中的位置，可以发现在该活性区域有一个很大的口袋，方便底物的进入，为了失活激酶的活性，我们选取口袋附近的两个氨基酸d275和p206，通过定向进化合理的筛选失去激酶活性的蛋白。通过fmn与底物的结合部位，发现r199和t208在与fmn的磷酸化部位有着多个氢键相互作用，通过进化这两个主要氨基酸，使得活性区域无法催化磷酸集团和核黄素的结合，从而获得只具有fmn转移酶活性的突变体。
8、更进一步，通过fad合成酶的晶体结构分析出在n端的fmnat酶具有明显的活性口袋，其中氨基酸片段h116-a136和i21-l34是维持活性口袋的主要骨架和底物结合区域，通过引物设计和pcr方法将fmnat的h116-a136、s118-a124、i21-l34和g22-v27这些片段分别敲除，使得fad酶失去了fmnat的活性，从而保留了rfk激酶的活性，对应的突变体分别为mut1、mut2、mut3和mut4。
9、更进一步，敲除了基因片段后的fad合成酶突变体核苷酸序列如seq idno.3、seqid no:5、seq id no:7和seq id no:9所示。
10、更进一步，所述fad合成酶突变体氨基酸序列如seq id no.4、seq idno:6、seq idno:8和seq id no:10所示。
11、进一步，所述fad合成酶突变体表达于基因工程菌。
12、进一步，所述fad合成酶突变体表达菌株选自大肠杆菌、酵母菌或枯草杆菌。
13、另一方面，本发明提供一种利用fad合成酶制备fmn的方法。
14、以核黄素和atp为底物，经过fad合成酶的催化反应，制得fmn。
15、进一步，所述的fad合成酶选自fad合成酶的细胞、fad合成酶的酶粉、固定化fad合成酶或者各种fad合成酶的固态或液态制剂，优选fad合成酶细胞。
16、进一步，所述反应中需要加入缓冲液，优选磷酸钾缓冲液。
17、进一步，所述反应需要控制ph为4.0～8.5，优选ph为7.0。
18、进一步，所述反应温度为20℃～60℃，优选50℃。
19、本发明的有益效果在于，本发明公开了一种新的fad合成酶突变体，在野生型酶的基础上经过改造敲除部分基因片段所得，可以有效保持c端的核糖激酶活性，能够单独转化为fmn，产物浓度最高可达130g/l，实现了产业上酶法制备fmn的应用。
1.一种fad合成酶突变体，其特征在于，所述的fad合成酶突变体氨基酸序列如seq idno:4、seq id no:6、seq id no:8和seq id no:10所示。
2.如权利要求1所述的fad合成酶突变体，其特征在于，所述fad合成酶突变体核苷酸序列如seq id no:3、seq id no:5、seq idno:7和seq id no:9所示。
3.如权利要求1所述的fad合成酶突变体，其特征在于，所述fad合成酶突变体是以seqid no.2所示的野生型fad合成酶为模板，通过敲除片段h116-a136、s118-a124、i21-l34和g22-v27所得。
4.如权利要求1所述的fad合成酶突变体，其特征在于，所述fad合成酶突变体表达于基因工程菌。
5.如权利要求1所述的fad合成酶突变体，其特征在于，所述的fad合成酶突变体表达菌株选自大肠杆菌、酵母菌或枯草杆菌。
6.一种制备fmn的方法，其特征在于，所述方法以核黄素和atp为底物，经fad合成酶的催化，得到fmn，所述fad合成酶选自权利要求1中所述的fad合成酶突变体。
