本发明属于生物制药领域。具体而言，本发明提供了通过细胞培养生产蛋白质的方法。本发明的方法利用灌流培养和流加培养相结合的方式，由此生产的蛋白质表达量高且质量稳定，并且避免了n-1级制备高密度种子向n级转换，操作便捷、节省成本。
背景技术：
0、技术背景
1、cho细胞培养是一种始于20世纪初，目前被生物和医学等领域广泛采用的方法。哺乳动物细胞大规模工业化培养成为生物药物生产的关键。动物细胞株培养需要面对三大难题：1.如何提高细胞密度、2.如何长时间维持细胞活力、3.如何提供高表达抗体所需的营养环境。常用的动物细胞培养分为批次培养、补料批次培养、灌流培养等。流加培养培养过程中添加补料，细胞生长过程中补充营养，维持细胞正常表达代谢。灌流培养能使培养过程中的培养基不断更换，满足细胞持续对营养的需求，同时能排出乳酸、铵离子等有害代谢产物。然而，现有技术如流加培养，细胞生长环境随代谢废物产生影响细胞生长，活率下降快，抗体表达量低。高密度接种需要在n-1级制备高密度种子，再接种到n级反应器中，操作复杂，成本高。
2、因此，本领域需要改进的蛋白质生产方法，在保证质量稳定的同时进一步提高表达量，并且能够简化操作、节省成本。
技术实现思路
1、本发明巧妙结合灌流和流加培养模式，避免n-1级制备高密度种子向n级转换，提供了表达量高且质量稳定、同时操作便捷、节省成本的生产蛋白质的方法。
2、在一个方面，本发明提供了通过细胞培养生产蛋白质的方法，其包括将细胞以约0.8×106～1.2×106cells/ml的细胞密度接种至生物反应器以起始细胞培养，所述细胞培养包括灌流培养和流加培养，其中，在接种细胞后的第3天开始灌流培养，培养温度为约36-38℃；在接种细胞后的第10天降低培养温度至约30-35℃并开始流加培养。在某些实施方案中，以接种细胞当天记为接种细胞后的第0天。
3、在某些实施方案中，当细胞活率低于约65％时停止培养。
4、在某些实施方案中，所述灌流培养的细胞特异性灌流速率(cspr)为约0.05～0.1nl/cell/day，例如约0.05～0.09nl/cell/day，约0.05～0.08nl/cell/day，或约0.06～0.08nl/cell/day，例如约0.07nl/cell/day。
5、在某些实施方案中，所述灌流培养的培养温度为约36-37℃或约37-38℃，例如约37℃。
6、在某些实施方案中，所述流加培养的培养温度为约30-34℃，例如约31-34℃，约32-34℃，或约33-34℃，例如约34℃。
7、在某些实施方案中，所述开始流加培养是指停止灌流换液，并开始进行流加补料。在某些实施方案中，所述流加培养包括每天向培养物中加入补料。术语“补料”是指常规用于流加培养(fed-batch culture)中的补充组分，其增强生长和/或存活以超过最低速率，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(诸如钠离子、钙离子、镁离子和磷酸根)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、和/或葡萄糖或其他能源。在某些实施方案中，所述补料包含浓缩的上述营养素。
8、在某些实施方案中，所述流加培养(例如，每天向培养物中加入补料)持续至少约5天，例如约5～8天，约5～7天，约6～8天，例如约5天、约6天、约7天或约8天。
9、在某些实施方案中，所述方法还包括在停止流加培养之后(例如，停止向培养物中加入补料之后)继续培养培养物的步骤。在某些实施方案中，所述继续培养持续约1～2天(例如约1天)，或者当细胞活率低于约65％时停止培养。
10、在某些实施方案中，所述补料的加入量为初始培养物体积的约3～4％(v/v)。
11、在某些实施方案中，所述补料包括第一补料和第二补料，所述第一补料和第二补料的加入量之比为约11:1～9:1，例如约10.5:1～9.5:1，例如约10:1。
12、在某些实施方案中，所述第一补料的加入量为约2.5～3.5％(v/v)，例如约2.5～3.2％(v/v)，约2.8～3.5％(v/v)，约2.8～3.2％(v/v)，约2.9～3.1％(v/v)，例如约3％(v/v)。
13、在某些实施方案中，所述第二补料的加入量为约0.1～0.5％(v/v)，例如约0.2～0.5％(v/v)，约0.1～0.4％(v/v)，约0.2～0.4％(v/v)，例如约0.3％(v/v)。
14、在某些实施方案中，所述第一补料包含氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐和微量元素。在某些实施方案中，所述第一补料包含浓缩的氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐和微量元素。
15、在某些实施方案中，所述第二补料包含氨基酸。在某些实施方案中，所述第二补料包含浓缩的氨基酸。
16、在某些实施方案中，所述第一补料为maxfa或cell boost 7a(cb7a)。
17、在某些实施方案中，所述第二补料为maxfb或cell boost 7b(cb7b)。
18、在某些实施方案中，所述第一补料和第二补料分别为maxfa/maxfb。
19、在某些实施方案中，所述第一补料和第二补料分别为cb7a/cb7b。
20、在某些实施方案中，所述第一补料(例如maxfa或cb7a)的加入量为初始培养物体积的约3％(v/v)，所述第二补料(例如maxfb或cb7b)的加入量为初始培养物体积的约0.3％(v/v)。
21、在某些实施方案中，所述灌流培养通过交替式切向流(atf)系统实施。
22、在某些实施方案中，所述atf系统的截留分子量不大于约100kd，例如为约50～100kd，约60～100kd，约70～100kd，约80～100kd，约60～90kd，约70～90kd，或约80～90kd，例如为约80kd。
23、在某些实施方案中，所述灌流培养的培养条件还包括：ph为7.0±0.2，溶氧为至少约30％(例如约30％-80％，约30％-60％，约30％-50％，约30％-40％；例如约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％)，和/或转速为至少约200rpm(例如约200-500rpm，约200-400rpm，或约200-300rpm；例如约200rpm、约250rpm、约300rpm、约350rpm、约400rpm、约450rpm、约500rpm)。
24、在某些实施方案中，所述开始灌流培养是指开始灌流换液。
25、在某些实施方案中，所述方法包括在接种细胞后进行常规细胞培养，直至开始灌流培养。
26、在某些实施方案中，在开始灌流培养之前(例如开始灌流换液之前)的常规细胞培养的培养条件包括：培养温度为约36-38℃(例如36-37℃或约37-38℃，例如约37℃)，ph为7.0±0.2，溶氧为至少约30％(例如约30％-80％，约30％-60％，约30％-50％，约30％-40％；例如约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％)，和/或转速为至少约200rpm(例如约200-500rpm，约200-400rpm，或约200-300rpm；例如约200rpm、约250rpm、约300rpm、约350rpm、约400rpm、约450rpm、约500rpm)。
27、在某些实施方案中，所述细胞培养在培养基中进行，所述培养基为无血清培养基或化学成分确定的培养基。术语“化学成分确定的培养基”是指所有组分都是已知的细胞培养基，其包含维持细胞生长必需的营养素和组分，例如维生素、微量元素(例如硫酸锰)、盐(例如氯化钠或氯化钾)、氨基酸、脂质、碳源(如葡萄糖)，并且不包含动物血清或者植物、酵母或动物水解物。此类培养基是本领域已知的，例如dynamis培养基(gibco)、ex-cell302无血清培养基(sigma-aldrich)、cd cho培养基(gibco)、cd opticho培养基(gibco)、expicho稳定生产培养基(gibco)、balancd cho growth a培养基(irvine scientific)、powerchoadvance培养基(lonza)、ex-cell advanced cho培养基(millipore sigma-aldrich)、hyclone actipro培养基(ge healthcare life sciences)等，或其任意组合。
28、在某些实施方案中，本发明的方法在细胞培养中所使用的培养基为常规用于灌流培养或流加培养的基础培养基。
29、在某些实施方案中，所述培养基优选地是培养哺乳动物细胞(例如cho细胞)的细胞培养基。
30、在某些实施方案中，所述培养基选自dynamis培养基、ex-cell 302无血清培养基或其组合。
31、在某些实施方案中，本发明的方法中所述灌流培养和流加培养使用的培养基相同。在某些实施方案中，本发明的方法中各个培养阶段所使用的培养基相同。
32、在某些示例性实施方案中，所述方法包括：将细胞以约0.8×106～1.2×106cells/ml的细胞密度接种至生物反应器以起始细胞培养，所述细胞培养包括灌流培养和流加培养，其中，在接种细胞后的第3天开始灌流培养，培养温度为约36-38℃(例如约36-37℃或约37-38℃，例如约37℃)；在接种细胞后的第10天降低培养温度至约30-35℃(约30-34℃，例如约31-34℃，约32-34℃，或约33-34℃，例如约34℃)并开始流加培养；其中，
33、所述流加培养包括每天向培养物中加入补料；所述补料包括第一补料和第二补料，其中所述第一补料(例如maxfa或cb7a)的加入量为初始培养物体积的约2.8～3.2％(v/v)(例如约2.9～3.1％(v/v)，例如约3％(v/v))，所述第二补料(例如maxfb或cb7b)的加入量为初始培养物体积的约0.2～0.4％(v/v)(例如约0.3％(v/v))；优选地，所述流加培养(例如，每天向培养物中加入补料)持续至少约5天(例如约5～8天，约5～7天，约6～8天，例如约5天、约6天、约7天或约8天)；
34、所述灌流培养通过交替式切向流(atf)系统实施；
35、所述灌流培养和流加培养在培养基中进行，所述培养基为无血清培养基或化学成分确定的培养基(优选地是培养哺乳动物细胞(例如cho细胞)的细胞培养基，例如dynamis培养基、ex-cell 302无血清培养基或其组合)。
36、在某些实施方案中，所述方法还包括通过种子扩增培养以提供所述细胞密度为0.8×106～1.2×106cells/ml的接种物。
37、在某些实施方案中，通过种子扩增培养获得的培养产物的细胞密度为约4.5×106～5.5×106cells/ml，例如约4.8×106～5.2×106cells/ml，例如约5×106cells/ml。
38、在某些实施方案中，所述种子扩增培养包括以下步骤：
39、-复苏细胞并在摇床中振荡培养至活细胞密度达约2×106～4×106cells/ml；
40、-收获上一步获得的细胞并以约0.3×106～0.5×106cells/ml的细胞密度接种至第一培养容器中培养，至活细胞密度达约3×106～5×106cells/ml；
41、-收获上一步获得的细胞并以约0.4×106～0.6×106cells/ml的细胞密度接种至第二培养容器中培养，至活细胞密度达约4.5×106～5.5×106cells/ml(例如约4.8×106～5.2×106cells/ml，例如约5×106cells/ml)，收获培养产物。
42、在某些实施方案中，所述第一培养容器和第二培养容器为摇瓶(shake flask)。
43、在某些实施方案中，所述第一培养容器和第二培养容器选自体积为数毫升至数升的小规模反应容器。本领域技术人员知晓并且能够基于实际需要及相关考虑而选择用于实施种子扩增培养的适合的培养容器。
44、在某些实施方案中，所述第二培养容器的体积大于第一培养容器。
45、在某些实施方案中，用于种子扩增培养的培养基与上文中所述的包含灌流培养和流加培养的细胞培养所使用的培养基可以相同或不同。
46、在某些实施方案中，用于种子扩增培养的培养基为无血清培养基或化学成分确定的培养基。在某些实施方案中，所述培养基优选地是培养哺乳动物细胞(例如cho细胞)的细胞培养基。在某些实施方案中，所述培养基选自dynamis培养基、ex-cell 302无血清培养基或其组合。
47、在某些实施方案中，用于上文中所述的包含灌流培养和流加培养的细胞培养的生物反应器为大规模商业生物反应器，例如所述生物反应器的体积范围为大约至少1升至10升、50升、100升、250升、500升、1000升、2500升、5000升、8000升、10000升、12000升、15000升、20000升或25000升或更大，或者其间的任何体积。本领域技术人员知晓并且能够基于实际需要及相关考虑而选择用于实施本发明的适合的生物反应器。
48、在某些实施方案中，所述方法还包括在停止培养后收获培养物中的蛋白质。在某些实施方案中，所述方法还包括纯化所述收获的蛋白质。
49、在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞，例如cho细胞。
50、在某些实施方案中，所述细胞包含编码所述蛋白质的核苷酸序列。
51、在某些实施方案中，本发明的方法可用于生产任何可期望表达的蛋白质，例如酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等。
52、在某些实施方案中，所述蛋白质为抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
53、在某些示例性实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
54、(1)细胞复苏：
55、将cho细胞解冻后转移到基础混合培养基dynamis+ex-cell302中，离心弃上清，再用基础混合培养基dynamis+ex-cell302将细胞重悬后，置于二氧化碳摇床中培养到第三天，活细胞密度达到(2～4)×106cells/ml时转移至下一级培养；
56、(2)500ml摇瓶种子扩增：
57、将步骤(1)得到的细胞接种到基础混合培养基dynamis+ex-cell302中进行培养，当活细胞密度达到(3～5)×106cells/ml时转移至下一级培养500ml摇瓶，接种密度约(0.4～0.6)×106cells/ml，培养体积100ml；
58、(3)1l摇瓶种子扩增：
59、将步骤(2)得到的细胞接种到混合培养基dynamis+ex-cell302中，培养体积300ml再置于1l摇瓶中培养，培养3天；
60、(4)3l反应器灌流培养：
61、将步骤(3)得到的种子以(0.8～1.2)×106cells/ml细胞密度接种生物反应器中培养，以接种细胞当天记为第0天，在培养基第3天到第10天开始进行灌流换液，细胞生长达到较高密度水平；
62、(5)3l反应器流加培养：
63、第10天到第15天开始进行流加培养，并进行降温34℃，第18天结束培养或活率在65％以下收获。
64、在某些示例性实施方案中，本发明的方法的流程图如图1a所示。
65、在某些示例性实施方案中，本发明的方法所使用的生物反应器示意图如图1b所示。
66、术语定义
67、在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
68、如本文中所使用的，如本文结合特定值(例如温度、浓度、时间等)使用的术语“约”应指术语“约”指的特定值的+/-10％的变化，例如+/-5％、+/-4％、+/-3％、+/-2％或+/-1％的变化。术语“约”涵盖的可允许的变化取决于所研究的具体系统，并且可以由本领域普通技术人员容易地理解。
69、如本文中所使用的，术语“灌流培养(perfusion culture)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指一种细胞培养方式，其中细胞培养物接受灌流新鲜培养基并且移除废培养基。
70、如本文中所使用的，术语“流加培养(fed-batch culture)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指一种细胞培养方式，其中在开始培养过程之后的一些时间点将额外的组分提供给培养物；所提供的组分通常包括在培养过程中已被耗尽的细胞的营养补充剂。流加培养也称为补料分批培养。
71、如本文中所使用的，术语“培养基”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指含有维持细胞生长的营养物的溶液。通常，此类溶液至少提供细胞生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。在某些实施方案中，培养基被有利地配制成对细胞存活和增殖最佳的ph和盐浓度。
72、如本文中所使用的，术语“补料”具有本领域技术人员通常理解的含义，是指常规用于流加培养(fed-batch culture)中的补充组分，其增强生长和/或存活以超过最低速率，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(诸如钠离子、钙离子、镁离子和磷酸根)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、和/或葡萄糖或其他能源。在某些实施方案中，所述补料是浓缩的上述营养素。
73、如本文中所使用的，术语“生物反应器”意指用于细胞培养物的生长的任何容器。生物反应器可为任何尺寸，只要它对细胞培养有用；通常，生物反应器的尺寸适于在其之内生长的细胞培养物的容积。通常，生物反应器会是至少1升，例如至少2、5、10、50、100、200、250、500、1,000、1500、2000、2500、5000、8000、10000、12000升或更多或在中间的任何容积。可在培养期期间控制生物反应器的内部条件，包括但不限于ph和温度。
74、如本文中所使用的，术语“细胞密度”是指给定体积的培养基中存在的细胞数量。细胞密度可以通过技术人员已知的任何方法来测量。例如使用自动细胞计数器测量细胞密度。在某些实施方案中，所述细胞密度是指活细胞密度，可以使用染料(例如台盼蓝)来测定活细胞。
75、如本文中所使用的，术语“细胞活率”是指细胞培养物中活细胞所占的百分比。测定细胞活率的方法是本领域技术人员熟知的，例如可以使用染料(例如台盼蓝)来测定活细胞，所述染料不穿过活细胞的膜，但可以穿过死亡或濒死细胞的破裂的膜；例如，反映活细胞的能量代谢的荧光法(例如基于碘化丙啶)、量热法或酶促法，例如使用ldh乳酸脱氢酶或某些四唑盐的方法，所述四唑盐例如阿尔玛蓝、mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基溴化四唑)或ttc(氯化四唑)。
76、有益效果
77、本技术的发明人巧妙结合灌流和流加培养模式，利用灌流换液为细胞提供充足的营养物质，改善细胞生长环境，使得细胞达到高密度水平；再进行流加培养在高密度细胞水平维持细胞抗体表达所需的营养，降温使得细胞密度不再继续增加，能够有充分营养供给细胞表达抗体。本发明的方法避免n-1级制备高密度种子向n级转换，操作便捷、节省成本，同时表达量高且质量稳定。此外，本发明的方法还采用小孔径中空纤维膜有效截留抗体，避免灌流培养过程中连续收获，实现下游纯化操作便捷性。
78、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
1.通过细胞培养生产蛋白质的方法，其包括将细胞以0.8×106～1.2×106cells/ml的细胞密度接种至生物反应器以起始细胞培养，所述细胞培养包括灌流培养和流加培养，其中，以接种细胞当天记为第0天，在接种细胞后的第3天开始灌流培养，培养温度为36-38℃；在接种细胞后的第10天降低培养温度至30-35℃并开始流加培养。
2.权利要求1所述的方法，其中，当细胞活率低于65％时停止培养。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述灌流培养的细胞特异性灌流速率(cspr)为0.05～0.1nl/cell/day，例如0.05～0.09nl/cell/day，0.05～0.08nl/cell/day，或0.06～0.08nl/cell/day，例如0.07nl/cell/day。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述灌流培养的培养温度为36-37℃或37-38℃，例如37℃。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述流加培养的培养温度为30-34℃，例如31-34℃，32-34℃，或33-34℃，例如34℃。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述流加培养包括每天向培养物中加入补料；
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述灌流培养通过交替式切向流(atf)系统实施。
8.权利要求7所述的方法，其中，所述atf系统的截留分子量不大于100kd，例如为50～100kd，60～100kd，70～100kd，80～100kd，60～90kd，70～90kd，或80～90kd，例如为80kd。
9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中，所述细胞培养在培养基中进行，所述培养基为无血清培养基或化学成分确定的培养基；
10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中，所述方法还包括通过种子扩增培养以提供所述细胞密度为0.8×106～1.2×106cells/ml的接种物；
11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在停止培养后收获培养物中的蛋白质。
12.权利要求11所述的方法，其中，所述方法还包括纯化所述收获的蛋白质。
13.权利要求1-12任一项所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物细胞，例如cho细胞。
14.权利要求1-13任一项所述的方法，其中，所述细胞包含编码所述蛋白质的核苷酸序列。
15.权利要求1-14任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
