本发明涉及基因测序、分子检测以及临床检测，具体涉及一种解旋酶，以及其在表征分析物，尤其是表征目标多核苷酸中的用途。
背景技术：
1、纳米孔测序技术利用可以为离子电流提供通道的纳米孔，电泳驱动分析物如多核苷酸通过纳米孔，并且由于分析物如多核苷酸穿过纳米孔，因此可以降低通过纳米孔的电流。每个通过的分析物如一个核苷酸或一系列核苷酸获得了特征电流，并且对电流的记录对应于多核苷酸序列。在“链测序”方法(如使用解旋酶控制多核苷酸穿过孔的移动)中，单个多核苷酸链穿过所述孔并能实现对核苷酸的鉴定。这种测序技术的优势在于建库简单，无需扩增；读取速度快，对单个分子可以达到每小时上万碱基的读取速度；读长非常长，通常在上千碱基；有可能可以对rna和dna甲基化进行直接测量。这些都是现有的二代测序技术所无法达到的。
2、但是，纳米孔测序技术也有棘手的问题需要解决，例如多核苷酸通过纳米孔的易位过快以至于单个核苷酸的电流过短而难以分辨。纳米孔测序中，为了减缓dna链穿越纳米孔的速率，需要用到一类减速蛋白。
3、因此，提供可用于纳米孔测序的新的控速酶是非常重要的。
技术实现思路
1、本发明提供了一种新的解旋酶，该解旋酶为经修饰的酶，具有控制多核苷酸移位的能力且突变后使双链多核苷酸解旋的能力降低。本发明所述的解旋酶是链测序过程中控制多核苷酸移位的有用工具，可以使多核苷酸在通过纳米孔之前停滞在解旋酶处，并在施加电势后顺着或逆着由所施加的电压引起的电场进行运动，从而控制多核苷酸的移位，获得可识别的电流。基于本发明所述的解旋酶在链测序领域可以控制多核苷酸过孔前停滞，过孔后平稳移位。甚至当多核苷酸未经过复杂的修饰(如添加间隔区)的情况下，本发明所述的某些解旋酶依然可以很好地停滞在多核苷酸上，从而控制多核苷酸的移位，即对于未经复杂处理的多核苷酸的停滞以及移位特别有效，可以降低甚至避免过孔前解旋以及对多核苷酸进行复杂修饰的优势。此外，本发明的解旋酶可以同时用于推入测序(entrysequencing)和回拉测序(outy sequencing)。
2、本发明的第一方面，提供了一种解旋酶突变体，与该突变前相比，所述解旋酶突变体具有控制多核苷酸移位的能力且使双链多核苷酸解旋能力降低。
3、优选地，当与该突变前相比时，所述解旋酶突变体具有使双链多核苷酸解旋至多80％、至多75％、至多70％、至多65％、至多60％、至多55％、至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、至多0.5％、至多0.1％、至多0.01％的能力或完全失去使双链多核苷酸解旋的能力。
4、优选地，所述解旋酶突变体在突变前是天然或经修饰的dda解旋酶、pif1-like解旋酶、hel308解旋酶、recd解旋酶、tral解旋酶或xpd解旋酶。更优选地，所述解旋酶突变体在突变前是天然或经修饰的dda解旋酶。
5、本技术中的“dda解旋酶”应该按照其广义来理解，并认为涵盖了dda解旋酶(例如seq id no:1)的同源蛋白。通常，只要一种酶具有dna解旋活性，含有(i)塔-销互作结构域、(ii)钩结构域、(iii)与置换链互作的结构域和(iv)偶联atp水解和/或链置换的结构域，且与seq id no:1具有至少30％的同源性，例如至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的同源性，则可以认为其属于dda解旋酶。
6、表1给出了一些同源dda解旋酶的示例，但是本技术的dda解旋酶并不限于这些例子。表1列出了示例性dda解旋酶，所述dda解旋酶选自eph-1、pba-pm2、aph-acj61、aph-px29、avi-aeh1、sph-cbh8、eph-pei26、aph-am101、pphpspyzu05、eph-ecs1、eph-cronus2、mph-mp1、rma、csu、sru、sgo、vhe-12b8、vph-pp2、ios、aph-cc2、cph-gap161、kph-kp15、sph-ime13、aph-ac42、sph-sp18、yph-rt、sph-s16或eph-2。其中，seq id no:2-12为pif1-like解旋酶。
7、表1：dda解旋酶的同源蛋白
8、
9、更优选地，所述dda解旋酶的突变包括选自以下结构域中的一个或多个结构域上的突变：(i)塔-销互作结构域、(ii)钩结构域、(iii)与置换链互作的结构域和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域。
10、优选地，可以在(i)塔-销互作结构域、(ii)钩结构域、(iii)与置换链互作的结构域和(iv)偶联atp水解和/或链置换的结构域引入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个突变。
11、优选地，所述解旋酶突变体包括：
12、(1)seq id no：1的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p89-f98和k364-w378、(ii)钩结构域的f276-k284、(iii)与置换链互作的结构域的k24-k25和k101-k123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的d143-r148中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
13、(2)seq id no：2的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p92-f101和r368-w383、(ii)钩结构域的i280-k288、(iii)与置换链互作的结构域的r26-s27和r104-k126和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q149为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d146-p151中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
14、(3)seq id no：3的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p92-f101和k367-w381、(ii)钩结构域的m281-k289、(iii)与置换链互作的结构域的t26-k27和s104-e126和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q149为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d146中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
15、(4)seq id no：4的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p92-f101和k376-w392、(ii)钩结构域的m282-e290、(iii)与置换链互作的结构域的s26-d27和s104-d130和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q153为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d150-q155中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
16、(5)seq id no：5的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p92-f101和k377-w393、(ii)钩结构域的m282-e290、(iii)与置换链互作的结构域的t26-d27和s104-d130和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q153为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d150-q155中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
17、(6)seq id no：6的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p89-f98和r365-w380、(ii)钩结构域的m276-k284、(iii)与置换链互作的结构域的k24-k25和k101-a123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q146为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d143-r148中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
18、(7)seq id no：7的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p94-f103和r370-w385、(ii)钩结构域的i282-k290、(iii)与置换链互作的结构域的r28-n29和r106-k128和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q151为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d148-q153中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
19、(8)seq id no：8的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p103-f122和k378-w391、(ii)钩结构域的m292-k300、(iii)与置换链互作的结构域的k27-s28和s115-e137和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q160为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d157-r162中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
20、(9)seq id no：9的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p99-f108和r379-w393、(ii)钩结构域的t290-k298、(iii)与置换链互作的结构域的q26-n27和r111-k133和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q156为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d153-r158中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
21、(10)seq id no：10的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p89-f98和r365-w380、(ii)钩结构域的m276-k284、(iii)与置换链互作的结构域的k24-k25和k101-a123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q146为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d143-r148中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
22、(11)seq id no：11的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p91-f100和k370-w382、(ii)钩结构域的t281-k289、(iii)与置换链互作的结构域的k26-r27和k103-k125和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q148为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d145-r150中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
23、(12)seq id no：12的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p100-f109和k366-w378、(ii)钩结构域的i280-k288、(iii)与置换链互作的结构域的a25-t26和s122-k134和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q157为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d154-r159中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
24、(13)seq id no：13的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的d88-f110和r392-l408、(ii)钩结构域的p311-f316、(iii)与置换链互作的结构域的r113-t133和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q177为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d174-p179中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
25、(14)seq id no：14的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p151-f162和r421-y437、(ii)钩结构域的f344-k352、(iii)与置换链互作的结构域的n165-d189和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q213为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d210-p215中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
26、(15)seq id no：15的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的d96-y102和r344-f359、(ii)钩结构域的y277-q282、(iii)与置换链互作的结构域的v105-e128和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q150为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d147-p152中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
27、(16)seq id no：16的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p119-f130和k381-y369、(ii)钩结构域的t314-v315、(iii)与置换链互作的结构域的k29-v30和d133-t156和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q181为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d178-l183中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
28、(17)seq id no：17的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p102-d106和n368-w382、(iii)与置换链互作的结构域的p24和v110-e134和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q155为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d152-g157中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
29、(18)seq id no：18的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p81-f90和k346-w360、(ii)钩结构域的m266-g270、(iii)与置换链互作的结构域的e16-s17和s93-e116和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q139为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d136-q141中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
30、(19)seq id no：19的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p85-f94和k353-w369、(ii)钩结构域的m272-d276、(iii)与置换链互作的结构域的n21-g22和s97-t119和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q142为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d139-q144中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
31、(20)seq id no：20的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p72-f81和k340-w355、(ii)钩结构域的m258-d263、(iii)与置换链互作的结构域的s8-g9和s84-a106和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q129为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d126-q131中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
32、(21)seq id no：21的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p91-f100和k365-w381、(ii)钩结构域的v279-q287、(iii)与置换链互作的结构域的n26-a27和q103-d128和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q151为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d148-r153中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
33、(22)seq id no：22的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p91-f100和k364-w380、(ii)钩结构域的v279-v287、(iii)与置换链互作的结构域的n26-k27和q103-e128和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q151为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d148-r153中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
34、(23)seq id no：23的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p89-f98和r363-w375、(ii)钩结构域的m274-q282、(iii)与置换链互作的结构域的t24-k25和k101-k123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q146为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d143-r148中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
35、(24)seq id no：24的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p95-f104和k369-w381、(ii)钩结构域的i282-k290、(iii)与置换链互作的结构域的t23-v24和k107-k129和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q152为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d149-r154中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
36、(25)seq id no：25的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p91-f100和k366-w381、(ii)钩结构域的m278-k286、(iii)与置换链互作的结构域的r24-r25和k103-s125和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q148为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d145-q150中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
37、(26)seq id no：26的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p90-f100和k366-w378、(ii)钩结构域的m277-k285、(iii)与置换链互作的结构域的n24-k25和r102-k124和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q147为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d144-r149中的至少一个氨基酸被取代或缺失；
38、(27)seq id no：27的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p90-f99和k365-w380、(ii)钩结构域的m277-k285、(iii)与置换链互作的结构域的e24-k25和r102-k124和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q147为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d144-r149中的至少一个氨基酸被取代或缺失；或
39、(28)seq id no：28的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p89-f98和k364-w378、(ii)钩结构域的f276-k284、(iii)与置换链互作的结构域的k24-k25和k101-k123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的以q146为中心4埃范围内的口袋中的氨基酸包括d143-r148中的至少一个氨基酸被取代或缺失。
40、更优选地，经修饰的dda解旋酶包括seq id no：1的变体，其中在(i)塔-销互作结构域的p89、e93、f98、k364、w378、(ii)钩结构域的f276、y279-k284、(iii)与置换链互作的结构域的k24、k25、k101、r122、k123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的q146中的至少一个氨基酸被取代或缺失；以及
41、seq id no：2-28的变体，其中取代或缺失的氨基酸是与seq id no:1中的(i)塔-销互作结构域的p89、e93、f98、k364、w378、(ii)钩结构域的f276、y279-k284、(iii)与置换链互作的结构域的k24、k25、k101、r122、k123和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域的q146相对应的氨基酸。优选地，seq id no:1的y279-k284以及seq id no：2-28中与之对应的氨基酸被缺失，seq id no:1的p89、e93、f98、k364、w378、f276、k24、k25、k101、r122、k123和q146以及seq id no：2-28中与之对应的氨基酸被其他氨基酸取代。
42、表2示出了与seq id no:1中的p89、e93、f98、k364、w378、f276、y279-k284、k24、k25、k101、r122、k123和q146对应的seq id no:2至28中的氨基酸。
43、表2：seq id no：1-28所示的dda解旋酶的对应的氨基酸位置
44、
45、
46、进一步优选地，将以上位点的氨基酸突变为与该位点的氨基酸性质不同的氨基酸。优选地，带正电的氨基酸被不带正电的氨基酸取代或缺失；带负电的氨基酸被不带负电的氨基酸取代或缺失；脯氨酸(p)被其他氨基酸取代或缺失；芳香族氨基酸被非芳香族氨基酸或者侧链更小的或更大的氨基酸取代或缺失；无侧链氨基酸被其他氨基酸取代或缺失；非极性不带电的氨基酸被带电的氨基酸取代或缺失；较大侧链的氨基酸被较小侧链的氨基酸取代或缺失。
47、适合的带正电荷的氨基酸包括但不限于组氨酸(h)，赖氨酸(k)和/或精氨酸(r)。
48、不带电荷的氨基酸没有净电荷。适合的不带电荷的氨基酸包括但不限于半胱氨酸(c)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、蛋氨酸(m)、天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)。
49、适合的带负电的氨基酸包括但不限于谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)。
50、无侧链氨基酸没有侧链。合适的无侧链氨基酸包括但不限于甘氨酸(g)。
51、非极性氨基酸具有非极性侧链。非极性氨基酸包括但不限于甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、脯氨酸(p)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)或缬氨酸(v)。
52、芳香族氨基酸具有芳香族侧链。适合的芳香族氨基酸包括但不限于组氨酸(h)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)或酪氨酸(y)。
53、较大侧链(r基团)优选地(a)包含增加数量的碳原子(b)具有增加的长度(c)具有增加的分子体积和/或(d)具有增加的范德华体积。较大侧链(r基团)优选(a)；(b)；(c)；(d)；(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(b)和(c)；(b)和(d)；(c)和(d)；(a)，(b)和(c)；(a)，(b)和(d)；(a)，(c)和(d)；(b)，(c)和(d)；或(a)，(b)，(c)和(d)。可以采用本领域中的标准方法对(a)至(d)中的每一个进行测量。
54、引入或取代天然存在的氨基酸的方法是本领域众所周知的。例如，可以通过在编码突变的单体的多核苷酸中的相关位置用精氨酸的密码子(cgt)置换蛋氨酸的密码子(atg)，用精氨酸(r)取代蛋氨酸(m)。引入或取代非天然存在的氨基酸的方法也是本领域众所周知的。保守性取代将氨基酸置换为具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸。引入的氨基酸可以具有与它们所置换的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替代地，保守性取代可以引入另一种芳族或脂肪族氨基酸代替预先存在的芳族或脂肪族氨基酸。保守性氨基酸变化是本领域众所周知的，并且可以根据下表3中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。在氨基酸具有相似极性的情况下，这也可以参考表4中氨基酸侧链的亲水性量表来确定。
55、表3-氨基酸的化学性质
56、 ala,a 脂肪族、疏水性、中性 met,m 疏水性、中性 cys,c 极性、疏水性、中性 asn,n 极性、亲水性、中性 asp,d 极性、亲水性、带电荷(-) pro,p 疏水性、中性 glu,e 极性、亲水性、带电荷(-) gln,q 极性、亲水性、中性 phe,f 芳族、疏水性、中性 arg,r 极性、亲水性、带电荷(+) gly,g 脂肪族、中性 ser,s 极性、亲水性、中性 his,h 芳族、极性、亲水性、带电荷(+) thr,t 极性、亲水性、中性 ile,i 脂肪族、疏水性、中性 val,v 脂肪族、疏水性、中性 lys,k 极性、亲水性、带电荷(+) trp,w 芳族、疏水性、中性 leu,l 脂肪族、疏水性、中性 tyr,y 芳族、极性、疏水性
57、表4-亲水性量表
58、
59、
60、众所周知，性质相似氨基酸彼此之间保守性替换通常不会影响肽序列的活性，保守性替换如表5。
61、表5保守氨基酸替换
62、
63、在本发明的一个具体实施方式中，所述经修饰的dda解旋酶包括：
64、(a)seq id no：1的变体，其包括(1)f98a；(2)w378a；(3)del-279-284；(4)p89a/f98a；(5)e93a/f98a；(6)p89a/f98a/k364a；(7)f98a/k364a；(8)f98a/w378a；(9)f98a/f276a/k364a；(10)p89a/f98a/f276a；(11)279-284-del/k364a；(12)k24a/k25a/k101a/r122a/k123a；(13)k24e/k25e；(14)f98a/k24a/k25a；(15)f98a/k101a/r122a/k123a；(16)f98a/k24e/k25e；或(17)p89a/f98a/q146k；以及
65、(b)seq id no：2到28中任一个的变体，其包括在对应于seq id no：1的(1)到(17)中任一个所限定的位置处的突变。
66、优选地，所述解旋酶突变体还包含修饰，以减小多核苷酸结合域中开口的大小，目标多核苷酸可以在至少一个构象状态下穿过所述开口从所述解旋酶上解绑。
67、本发明的解旋酶优选是这样一种解旋酶，其中，至少一个半胱氨酸残基(即，一个或多个半胱氨酸残基)和/或至少一个非天然氨基酸(即，一个或多个非天然氨基酸)被引入i)塔域和/或(ii)销域和/或(iii)1a(reca式马达)域，其中，解旋酶具有控制多核苷酸的移动的能力。这些类型的修饰在申请号为pct/gb2014/052736(wo2015/055981)的国际申请中公开。可以将至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸引入塔域；销域；1a域；塔域和销域；塔域和1a域或者塔域、销域和1a域。
68、为提高本发明所述的解旋酶与多核苷酸结合的稳定性，降低从多核苷酸上解脱的能力，所述引入的半胱氨酸与半胱氨酸之间相互连接、非天然氨基酸与非天然氨基酸之间相互连接之间、引入的半胱氨酸与非天然氨基酸之间相互连接、引入的半胱氨酸与解旋酶上的天然氨基酸之间相互连接、或者引入的非天然氨基酸与解旋酶上的天然氨基酸之间相互连接。
69、可以使任何数目和组合的两个以上引入的半胱氨酸和/或非天然氨基酸相互连接。例如，可以使3，4，5，6，7，8或更多个半胱氨酸和/或非天然氨基酸相互连接。一个或多个半胱氨酸可以与一个或多个半胱氨酸连接。一个或多个半胱氨酸可以与一个或多个非天然氨基酸诸如faz连接。一个或多个非天然氨基酸诸如faz可以与一个或多个非天然氨基酸诸如faz连接。一个或多个半胱氨酸可以与一个或多个解旋酶上的天然氨基酸连接。一个或多个非天然氨基酸诸如faz可以与一个或多个解旋酶上的天然氨基酸连接。
70、其中，所述的连接可以是任何方式，包括直接相连或者间接相连，优选的，所述的连接可以为短暂的接触，也可以为永久的连接。更进一步优选的，所述的连接可以为非共价连接或共价连接。
71、在本发明的一个具体实施方式中，所述的共价连接可以采用化学交联剂、线性分子或催化剂连接。所述的化学交联剂包括但不限于马来酰亚胺，活性酯，琥珀酰亚胺，叠氮化物，炔烃(诸如二苯并环辛炔醇(dibo或dbco)，二氟环炔烃和线性炔烃)等；化学交联剂的长度可以从一个碳(碳酰氯型连接器)到多个埃变化。所述的线性分子包括但不限于聚乙二醇(pegs)，多肽，多糖，脱氧核糖核酸(dna)，肽核酸(pna)，苏糖核酸(tna)，甘油核酸(gna)，饱和的和不饱和的烃，聚酰胺。所述的催化剂包括但不限于tmad等任何可以使得半胱氨酸残基之间、非天然氨基酸之间、半胱氨酸残基与非天然氨基酸之间、非天然氨基酸与天然氨基酸之间、或者半胱氨酸残基与天然氨基酸之间产生共价键的催化剂。
72、进一步优选地，seq id no：1的变体还包括m1g、e94c、c109a、c136a、a360c中的一个或多个的组合；以及
73、seq id no：2到28中任一个的变体还包括在对应于seq id no：1的m1g、e94c、c109a、c136a、a360c中的一个或多个的组合中的任一个所限定的位置处的突变。seq idno：2到28中对应于seq id no：1中的m1、e94、c109、c136、a360中的氨基酸可以使用图8中的比对确定。
74、在本发明的一个具体实施方式中，seq id no：1的变体包含或选自以下：
75、a)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a；
76、b)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/w378a；
77、c)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/del-279-284；
78、d)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/p89a/f98a；
79、e)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/e93a/f98a；
80、f)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/p89a/f98a/k364a；
81、g)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a/k364a；
82、h)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a/w378a；
83、i)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a/f276a/k364a；
84、j)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/p89a/f98a/f276a；
85、k)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/279-284-del/k364a；
86、l)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/k24a/k25a/k101a/r122a/k123a；
87、m)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/k24e/k25e；
88、n)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a/k24a/k25a；
89、o)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a/k101a/r122a/k123a；
90、p)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/f98a/k24e/k25e；
91、q)m1g/e94c/c109a/c136a/a360c/p89a/f98a/q146k。
92、优选地，所述解旋酶的氨基酸序列为seq id no：1到28所示氨基酸序列或与seqid no:1-28所示氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的同源性。
93、本发明的第二方面，提供了一种核酸，所述核酸编码本发明第一方面的解旋酶。
94、本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面的核酸。
95、优选的，所述核酸可操作的连接至表达载体中的调控元件，其中所述调控元件优选为启动子。
96、在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子选自t7、trc、lac、ara或λl。
97、优选的，所述表达载体包括但不限于质粒、病毒或噬菌体。
98、本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面的核酸。
99、优选的，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。
100、在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞选自bl21(de3)、jm109(de3)、b834(de3)、tuner、c41(de3)、rosetta2(de3)、origami、origami b等。
101、本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面的解旋酶的方法，包括表达本发明第二方面的核酸、用根据本发明第三方面的的表达载体转染细胞，或培养本发明第四方面的宿主细胞。
102、在一个具体的实施方式中，所述方法包括提供野生型解旋酶，然后对所述野生型解旋酶进行修饰，获得本发明的解旋酶。
103、在一个具体的实施方式中，所述方法包括培养本发明所述的宿主细胞并进行诱导表达，纯化后获得本发明的解旋酶。
104、在一个具体的实施方式中，所述方法包括根据本发明的解旋酶的氨基酸序列，获得编码解旋酶的核酸序列，酶切连接至表达载体后转化至大肠杆菌中，诱导表达和纯化，获得本发明的解旋酶。
105、本发明的第六方面，提供了一种构建体，包括本发明第一方面的解旋酶和结合所述解旋酶的装载部，可选地，所述构建体还包含靶分析物，所述靶分析物位于所述解旋酶的预设移动方向上，优选地，所述构建体不包含间隔区。
106、本发明的第七方面，提供了一种控制解旋酶在目标多核苷酸上加载的方法，所述方法包括：
107、(a)提供目标多核苷酸，优选不具有间隔区的目标多核苷酸；以及
108、(b)将本发明第一方面的解旋酶与(a)中提供的所述目标多核酸接触，使得所述解旋酶结合并停滞在所述目标多核苷酸处。
109、本发明的第八方面，提供了一种表征分析物的方法，所述方法包括：
110、(a)将本发明第一方面的解旋酶与分析物以及孔接触，并且在所述分析物移动通过所述孔之前，所述解旋酶结合并停滞在所述分析物处；
111、(b)跨所述孔施加电势，使所述分析物穿过孔移动；以及
112、(c)获取所述目标分析物与所述孔相互作用时的一个或多个特征，以表征所述分析物。
113、优选地，所述分析物选自多核苷酸、多肽、多糖和脂质中的一种或多种，优选为多核苷酸或与多核苷酸连接的多肽、多糖和脂质，更优选为单链多核苷酸、双链多核苷酸或部分双链多核苷酸。
114、进一步优选地，当所述分析物为与多核苷酸连接的多肽、多糖和脂质时，在所述分析物移动通过所述孔之前，所述解旋酶结合并停滞在所述与多核苷酸连接的多肽、多糖和脂质的多核苷酸处。
115、优选地，所述多核苷酸或所述与多核苷酸连接的多肽、多糖和脂质的多核苷酸上不具有间隔区。
116、优选地，所述孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。
117、优选地，所述一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行。
118、本发明的第九方面，提供了一种表征分析物的产品，所述产品包含本发明第一方面的解旋酶、本发明第二方面的核酸、本发明第三方面的表达载体或本发明第四方面的宿主细胞，和孔。
119、优选地所述产品选自试剂盒、装置或传感器。
120、本发明的第十方面，提供了本发明第一方面的解旋酶、本发明第二方面的核酸、本发明第三方面的表达载体、本发明第四方面的宿主细胞、本发明第六方面的构建体或本发明第九方面的产品在分析物中的用途。
1.一种解旋酶突变体，与该突变前相比，所述解旋酶突变体具有控制多核苷酸移位的能力且使双链多核苷酸解旋能力降低。
2.根据权利要求1所述的解旋酶突变体，其中与该突变前相比，所述解旋酶突变体具有使双链多核苷酸解旋至多80％、至多75％、至多70％、至多65％、至多60％、至多55％、至多50％、至多45％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、至多0.5％、至多0.1％、至多0.01％的能力或完全失去使双链多核苷酸解旋的能力。
3.根据权利要求1或2所述的解旋酶突变体，其中所述解旋酶突变体在突变前是天然或经修饰的dda解旋酶、pif1-like解旋酶、hel308解旋酶、recd解旋酶、tral解旋酶或xpd解旋酶。
4.根据权利要求3所述的解旋酶突变体，其中所述解旋酶突变体在突变前是天然或经修饰的dda解旋酶，所述突变包括选自以下结构域中的一个或多个结构域上的突变：(i)塔-销互作结构域、(ii)钩结构域、(iii)与置换链互作的结构域和(iv)偶联atp水解和链置换的结构域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶，其中所述解旋酶突变体包括：
6.根据权利要求5所述的解旋酶，其中所述经修饰的dda解旋酶包括：
7.根据权利要求5或6所述的解旋酶，其中所述取代或缺失包括如下情况中的至少一种：带正电的氨基酸被不带正电的氨基酸取代或缺失；带负电的氨基酸被不带负电的氨基酸取代或缺失；p被其他氨基酸取代或缺失；芳香族氨基酸被非芳香族氨基酸或者侧链更小的或更大的氨基酸取代或缺失；无侧链氨基酸被其他氨基酸取代或缺失；非极性不带电的氨基酸被带电的氨基酸取代或缺失；较大侧链的氨基酸被较小侧链的氨基酸取代或缺失；
8.根据权利要求5至7中任一项所述的解旋酶，其中
9.根据权利要求8所述的解旋酶，其中seq id no：1的变体还包括m1g、e94c、c109a、c136a、a360c中的一个或多个的组合；
10.根据权利要求1至9中任一项所述的解旋酶，其中所述解旋酶的氨基酸序列为seqid no：1到28所示氨基酸序列或与seq id no：1-28所示氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的同源性。
11.一种核酸，所述核酸编码权利要求1-10中任一项所述的解旋酶。
12.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求11所述的核酸。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求12所述的核酸。
14.一种制备根据权利要求1至10中任一项所述的解旋酶的方法，包括表达根据权利要求11所述的核酸、用根据权利要求12所述的表达载体转染细胞，或培养根据权利要求13所述的宿主细胞。
15.一种构建体，包括权利要求1至10中任一项所述的解旋酶和结合所述解旋酶的装载部，可选地，所述构建体还包含靶分析物，所述靶分析物位于所述解旋酶的预设移动方向上，优选地，所述构建体不包含间隔区。
16.一种控制解旋酶在目标多核苷酸上加载的方法，所述方法包括：
17.一种表征分析物的方法，所述方法包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述分析物选自多核苷酸、多肽、多糖和脂质中的一种或多种，优选为多核苷酸或与多核苷酸连接的多肽、多糖和脂质，更优选为单链多核苷酸、双链多核苷酸或部分双链多核苷酸；
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行。
21.一种表征分析物的产品，所述产品包含权利要求1-10中任一项所述的解旋酶、权利要求11所述的核酸、权利要求12所述的表达载体或权利要求13所述的宿主细胞，和孔。
22.根据权利要求21所述的产品，所述产品选自试剂盒、装置或传感器。
23.权利要求1-10中任一项所述的解旋酶、权利要求11所述的核酸、权利要求12所述的表达载体、权利要求13所述的宿主细胞、权利要求14、16-20中任一所述方法、权利要求15所述的构建体或权利要求21或22所述的产品在表征分析物或制备表征分析物产品中的用途。
