本发明一般涉及用于拍摄生物样品或活细胞的高对比度图片的暗场成像系统或方法。具体而言，本发明涉及在用于与生物样品的感兴趣区域交互的应用中用于对组织样品进行成像的暗场成像系统和方法。
背景技术：
1、暗场成像系统通常用于显微镜(暗场显微镜或暗地显微镜)，并且非常适合涉及活的和未染色的生物样品的使用，例如未染色的福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织样品。它可以用于光学显微镜和电子显微镜。由于暗场成像将未散射的光束排除在图像之外，因此产生在标本周围具有暗背景的图片。
2、在某些情况下，希望在显微镜载玻片、细胞培养室、烧瓶、培养皿或微孔板上收获组织或细胞群的精确定义的一小部分，以进行进一步分析。这些分析可以服务于提供组织病理学诊断的目的，以便做出进一步的治疗决策。生物化学和分子生物学的先进技术使该信息能够用于高效的个性化医学。例如，福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)患者组织可以用多种特征的标记物进行脱蜡和染色。当这种诊断程序揭示组织的特定区域(即所谓的感兴趣区域(aoi))的特征或异常时，能够从aoi中分离细胞并提取其核酸、蛋白质、其他亚细胞成分和/或分子以进行进一步鉴定可能是重要的。收获的细胞可以例如用作已知肿瘤风险基因测序的材料。所发现的一个或多个突变将决定治疗的选择，治疗可以是药物或药物组合，和/或可以是对受影响组织或器官的放射。当与生物样品的感兴趣区域交互时，重要的是获得参考组织切片或感兴趣标本本身的高对比度图像。后者(通常是未染色的)最好在暗场配置中成像。
3、us10876933 b2涉及一种用于以自动方式自动解剖显微镜载玻片上制备的生物样品的局部受限感兴趣区域，例如嵌入石蜡中的组织切片的感兴趣区域，的仪器，作为后续分析步骤的准备。序列样品载玻片与参考载玻片对准。
4、光学对准可以通过背景板组装件完成，使用户可以根据载物台上载玻片的类型选择最合适的背景颜色来优化他们的载玻片图像。这优化了参考载玻片图像的对比度，并允许通过使用概要轮廓的模式匹配将序列样品载玻片与参考载玻片对准。
技术实现思路
1、暗场成像的一个限制是在最终图像中看到的低光水平。因此，标本必须受到强烈的照明，这在现有技术中已知的系统中会导致样品后面(包括背景板组装件)的大量光散射。这种漫反射光进入相机并导致标本周围的背景不完全黑暗。这种灰色背景降低了图像的对比度，并从而降低了可以记录的细节的程度。
2、因此，本发明的目的是提供一种在灰度范围内提供更多图像细节的暗场成像系统。
3、这通过根据权利要求1的暗场成像系统来解决，该系统包括至少部分通过镜面反射来反射入射光的平台。附加的有利实施例例如可以从相应的从属权利要求中得出。
4、根据本发明的暗场成像系统包括用于容纳生物组织或细胞的平台，该平台构成形成两个半空间的平面。该暗场成像系统进一步包括产生靶向生物组织或细胞的入射光的光源以及用以检测从生物组织或细胞的漫反射的相机。该光源被置于相对于该平面的第一角度(α)，并且该相机被置于相对于该平面的第二角度(β)，其中该光源、该相机以及生物组织或细胞被布置在由该平面形成的两个半空间中的同一个半空间中。未被生物组织或细胞反射的入射光到达该平台，该平台包括至少部分地通过镜面反射来反射该入射光的镜面反射材料。
5、至少部分通过镜面反射来反射光源的入射光的平台的存在具有以下优点：消除在其他系统中在显微镜载玻片、细胞培养室、烧瓶、培养皿或微孔板上待分析的样品后面发生的漫反射。这导致标本周围出现黑色或近乎黑色的背景，并允许相机以显著提高的对比度捕获图像。另外，从相机散射开的漫射光被镜面反射到相机中，这导致待分析样品的亮度显著增加。这进一步改善了图像的对比度。
6、根据本发明的镜面反射是光或其他波或粒子的非散射的类镜面反射，使得入射光或辐射仅以一个角度反射。只有少数材料才能观察到没有任何漫反射的完全镜面反射，这些材料包括不允许光进入的金属、玻璃和具有类液体无定形微观结构的透明塑料。虽然镜面反射需要平滑的表面，但它不会阻止漫反射。非晶质或非晶态固体(如玻璃、透明塑料、聚合物)产生镜面反射，因为它们没有在表面以下散射所需的任何内部细分。除了抛光的铝或银(通常用于镜子中并且可以高效地镜面反射光)以外，常见的材料即使在完全抛光并因此是类镜面的情况下也只能显示出百分之几的镜面反射。根据本发明的漫反射是光或其他波或粒子从经历散射的表面的反射，使得入射光或辐射在物体表面上以许多角度散射。理想的漫反射表面被称为呈现朗伯反射，这意味着当从位于与表面相邻的半空间中的所有方向观看时具有相等的亮度。
7、取决于材料和表面粗糙度，反射可能主要是镜面反射、漫反射或介于两者之间的任何反射。包括生物组织或细胞在内的许多常见材料呈现镜面反射和漫反射的混合。虽然表面粗糙度在漫反射中起着一定作用，但大多数漫反射来自表面下的散射中心。当入射光通过其膜及其复杂内部结构命中生物组织或细胞时，撞击射线在进入分子结构时在分子结构处被部分反射，在与第二分子结构的界面处再次反射，进入第二分子结构，撞击到第三分子结构，以此类推。这会在随机方向上产生一系列“初级”散射射线，而这些射线又通过相同的机制产生大量“次级”散射射线，而“次级”散射射线产生了“三级”射线，以此类推。正是这种在每个界面处的这种漫散射光、不均匀性或偏离、反射或散射光的不完整性在观察者的眼睛或相机中形成了物体的图像。
8、根据本发明，所述平台容纳要查看的标本。根据本发明的平台可包括载物台和载体。可以是生物组织或细胞的标本通常被放置在载体上。载体可被定位在载物台上。如果载物台或多或少是水平的以使得载体不滑动，则载体将保持在原位而不会被固定。根据一实施例，载体可以可逆地附接到载物台，从而允许载物台相对于地面以任何角度布置，即作为倾斜平面。当载物台基本上水平布置时，可以将具有标本的载体放在下面，而不是将其放在上面，但在这种情况下，载体需要被固定至载物台。
9、根据本发明的平台包括至少部分地通过镜面反射来反射入射光的材料。根据一实施例，该平台包括主要以镜面反射方式反射入射光的材料，即，来自光源的超过50％的光以镜面反射的方式反射，同时以漫反射方式反射的光少于50％。根据一实施例，该平台包括通过镜面反射来反射到达该平台的入射光的至少90％的材料。对于主要以镜面反射方式反射入射光的材料，它必须具有平滑的类镜面表面。
10、根据一实施例，该平台包括金属。当被抛光并因此是类镜面的时候，一些金属主要以镜面反射的方式反射光，例如抛光的铝、银或铬。在一实施例中，该平台包括铝、银、铬、金或任何其它金属，或包括合金，诸如不锈钢。在一实施例中，该平台包括类镜面硬铬。
11、根据一实施例，该平台包括玻璃、透明塑料或陶瓷。
12、至少部分地通过镜面反射来反射入射光的材料可以形成该平台的表面。该材料可以是块或层的形式，其中薄涂层可以是足够的。在其中该材料形成载物台的一部分的实施例中，它面向具有生物组织或细胞的载体。该材料可以是载物台的集成部分或者可以是载物台表面上的一层。在一实施例中，载物台被至少部分地通过镜面反射来反射入射光的材料层覆盖。
13、根据一实施例，镜面反射入射光的材料可以是载体的集成部分或形成载体的表面层。表面上的材料层可面向生物组织或细胞。替代地，它可形成面向载物台的层。根据本发明的这一载体可以是覆盖有金属层的显微镜载玻片，其形成镜面玻璃载玻片，而金属层可以在任一侧或两侧。
14、根据一实施例，镜面反射入射光的材料可以抵抗刮擦或任何其他损伤，包括抵抗清洁剂，例如消毒剂。这可能是重要的，因为镜面反射需要光滑的表面。
15、根据一实施例，该平台包括加热/冷却单元。该加热/冷却单元可提升载物台的表面温度并由此可将载体加热至导致ffpe组织的石蜡融化的温度。
16、在一实施例中，载物台被构造为与容纳生物组织或细胞的载体物理接触的温度适配器，其将温度从加热/冷却单元引导并传导至具有生物组织或细胞的一个或多个载体。载物台的温度由此可被提高以熔化福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织样品的石蜡，并且作为结果，生物组织或细胞周围的光散射大部分被消除。
17、根据一实施例，镜面反射入射光的材料可以传导温度，以使得来自加热/冷却单元的温度被传递到生物组织或细胞。这对于熔化福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织样品的石蜡可能是重要的，这进一步减少了标本周围的光散射，从而产生甚至更大的对比度和改进的图像质量。
18、根据一实施例，加热/冷却单元可以降低载物台的表面温度，并从而可以将载体冷却到使生物组织或细胞冷冻或保持被冷冻的温度。这种冷冻可以应用于新鲜的被冷冻组织，在这种情况下，可以以机械方式移除感兴趣区域(aoi)。
19、根据一实施例，温度适配器具有三维形状，这允许精确定位包括一个或多个载体的支架，例如，容纳具有布置在其上的ffpe组织样品的几个标准显微镜载玻片的支架。
20、根据本发明的生物组织或细胞可以是任何活的或死的生物材料，例如组织样品或切片、平板细胞、原代和继发细胞培养物。用于保存活检标本中蛋白质和重要结构的一种常见方法是将组织固定在甲醛(也称为福尔马林)中。福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织标本是许多研究和治疗应用的基础，包括检查、实验研究、诊断和药物开发。ffpe组织通常在显微镜玻璃载玻片上制备，这允许与生物样品的感兴趣区域交互。未固定的ffpe组织样品可以在暗场配置中成像。然而，硬化的石蜡以散射漫反射的方式反射入射光，这导致图像具有与灰色背景的低对比度。因此，ffpe组织标本最好被加热到石蜡熔点以上，它在液态时显示出低得多的光散射。结果，ffpe组织可以以暗背景和高对比度成像。玻璃载玻片也可以是用于其他应用(例如，固定组织培养细胞的荧光显微镜)的载体选择。另一方面，活细胞可能必须在细胞培养室、烧瓶、培养皿或微孔板中生长，这些培养室、烧瓶、培养皿或微孔板可以是任何材料或材料的组合。
21、根据本发明的载体可以是显微镜载玻片、细胞培养室、烧瓶、培养皿或微孔板。除了容纳固定的组织和细胞外，细胞培养室、烧瓶、培养皿或微孔板也可以容纳活细胞。在一实施例中，载体由对光源发射的波长透明的材料制成。根据本发明的载体可包括玻璃、聚苯乙烯、组织培养聚苯乙烯、聚丙烯、环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、或对光源发射的波长透明的任何其他材料或由这些材料组成。
22、根据一实施例，载物台包括用于保持或可逆地附接一个或多个载体的装置，即紧固件。根据本发明的这种紧固件可包括例如夹子、弹簧、夹子、螺钉、形状闭合件、框架或凹槽、卡口锁、螺纹接头、粘合剂、或本领域已知的任何其他紧固元件。用于保持或可逆地附接一个或多个载体的优选装置可以容易地分离而不被破坏。用于保持或可逆地附接一个或多个载体的装置允许操作者将该一个或多个载体放置在预定位置并且在不移位该一个或多个载体的情况下移动载物台。作为示例，具有显微镜载玻片尺寸的凹部是将显微镜载玻片保持在适当位置的简单方式，而无需用于保持或可逆地附接载玻片的任何附加装置。当根据本发明的载物台或整个暗场成像系统以相对于地平线的一角度或倒置放置时，具有生物组织或细胞的一个或多个载体需要通过用于保持或可逆地附接一个或多个独立于重力的载体的装置被保持在适当位置，这些装置包括诸如夹子、弹簧、夹子、螺钉、形状闭合件、卡口锁、螺纹接头、或粘合剂。在一实施例中，该平台包括用于保持或可逆地附接一个或多个载体的支架形式的装置，该装置保持一个或多个载体并且可以与该一个或多个载体一起与该平台的其他部分分离。根据一实施例，紧固件是支架，并且载物台具有三维形状，该三维形状形成包括一个或多个载体的支架的对应物。由此这允许精确定位支架。在另一实施例中，紧固件是保持其上布置有ffpe组织样品的若干标准显微镜载玻片的支架。根据一实施例，紧固件是可被手动地或通过机械臂(其可以是自动化实验室系统的一部分)放置在载物台上或从载物台移除的支架。
23、根据本发明的光源可以是光或其他波或粒子的发射器。根据本发明，发射的波可以是任何波长，例如可见光和电磁辐射，包括紫外线(uv)和红外线(ir)。
24、在一实施例中，发射的波或粒子在一个方向上被集束或聚焦在生物标本上的感兴趣区域上。
25、从根据本发明的光源发射的光的形状可以是点、线、矩形或圆形(例如，环形光或其片段)，或任何其他几何形状。根据本发明的光分布可以是球形、半球形、斑点、光度网或任何其他光分布模式。
26、光源相对于平面以第一角度(α)放置。根据本发明的这个角度(α)可以针对给定的生物组织或细胞进行优化。对于细胞或组织的薄层，阴影可以忽略不计，并且因此点光源或纵向辐射器可以是光源选择。根据本发明的产生靶向生物组织或细胞的入射光的光源被布置在由载物台形成的平面的与生物组织或生物细胞相同的一侧。光源相对于平面以10到85度的第一角度(α)放置。在一实施例中，光源相对于平面以55度至85度的第一角度(α)放置。在一实施例中，光源相对于平面以65度至75度的第一角度(α)放置。在另一实施例中，光源相对于平面以70度的第一角度(α)放置。
27、在根据本发明的一实施例中，相对于平面的第一角度(α)小于相对于该平面的第二角度(β)。在一实施例中，相对于平面的第一角度(α)大于相对于该平面的第二角度(β)。在另一实施例中，相对于平面的这两个角度(α和β)是相等的。
28、在根据本发明的一实施例中，第一角度(α)和第二角度(β)之间的差大于5度且小于45度。
29、在一实施例中，光源和相机被布置成使得它们都与平面相距相同的距离。在另一实施例中，光源和相机被布置成使得光源与平面的距离比相机大。在另一实施例中，光源和相机被布置成使得相机与平面的距离比光源大。
30、根据本发明的用于检测从生物组织或细胞的漫反射的相机可以是可记录由根据本发明的光源发射的波的任何设备，波可以是任何波长，例如可见光和包括紫外线(uv)和红外线(ir)的电磁辐射。相机可以是照相机、数码相机、红外相机、多波段相机或任何其他相机。在根据本发明的一实施例中，相机被布置成使其相对于平面的角度(β)大于第一角度(α)。
31、在一实施例中，相机垂直于载物台布置，即，相对于平面的第二角度(β)等于90度。该布置的优点在于由于载体的厚度而引起的分散光学效应被最小化。当一些漫反射到达载物台并通过镜面反射来反射时，可能会发生这种分散光学效应。当相机相对于平面以小于90度的角度(β)放置时，这可能会导致第二个移位的图像。通过图像处理和计算方法合并第一图像和移位的第二图像，可以消除这些分散光学效应中的某一些。
32、在根据本发明的一实施例中，相机拍摄在自动化实验室系统中的生物组织或细胞的高对比度图像。
33、根据本发明的自动化实验室系统可以是自动移液系统、用于生物组织或细胞的自动培养箱，或者包括生物组织或细胞的生长或维持的任何其他自动化系统。这样的自动化实验室系统可以包括数据处理器，其用于计算将序列样品载玻片与参考载玻片对准所需的变换。在一实施例中，自动化实验室系统可以是包括暗场成像系统的用于执行ffpe提取的系统。根据本发明的这种系统提高了图像的对比度，并且从而提高了可以在灰度范围中记录到的细节的程度。这允许用户通过x轴、y轴和角度变换将序列样品载玻片(例如，ffpe组织样品)与参考载玻片(例如，苏木精和伊红(h&e)染色的组织样品)对准，其中使用整个灰度范围中的所有图像数据。
34、在一替代实施例中，自动化实验室系统可以是包括根据本发明的暗场成像系统的用于对生物组织或细胞进行成像的系统。光源和相机可以安装在自动化实验室系统上。自动化实验室系统可以包括一个或多个可移动机械臂。可以构造一个或多个机械臂，使得可以手动或自动地安装夹具或任何其他工具。替代地或附加地，一个或多个机械臂可以包括用于移液的装置。光源和/或相机可以安装在一个或多个机械臂上。
35、在一实施例中，自动化实验室系统包括数据处理器，其用于计算将序列样品载玻片与参考载玻片对准所需的变换。相机因此可以通过一个或多个输出设备和接口来连接到中央处理单元。
36、尽管为了说明的目的已经对前述发明进行了一些细节描述，但是显而易见的是，本领域普通技术人员可以在所附权利要求的范围内实施改变和修改。
37、至少在优选实施例中，根据本发明的解决方案尤其实现了以下优点：
38、入射光的镜面反射使相机只能检测从生物组织或细胞的漫反射，从而产生对比度大大提高的图像。此外，从相机散射开的散射光被镜面反射回生物组织或细胞上，并在反复散射到达相机后，导致待分析样品的亮度显著增加。这进一步改善了图像的对比度。
39、此外，在载物台与毗邻生物组织或细胞的载体直接接触的情况下，可以以可控的方式熔化福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织样品的石蜡，并且从而进一步减少标本周围的光散射。这导致甚至更大的对比度以及改进的图像质量。结果，图像的提高的对比度和暗背景在整个灰度范围内提供足够的图像细节，这使得能够通过x轴、y轴和角度变换或通过任何其他数学变换将序列样品载玻片与参考载玻片对准。
40、另一个优点是结构简单，所有部件都置于在载物台的一侧。当集成在例如自动化实验室系统中时，这允许节省空间的紧凑设计。此外，在光源和相机被放置在载物台上方的情况下，通过例如飞溅或滴落而污染两者中的任一者的风险显著降低。
41、总之，根据本发明的暗场成像系统将因此产生更好的暗场图像，从而允许更多的过程被自动化，并因此导致更少的工作和更低的操作成本。
42、此外，本发明的优点和便利性源自以下基于附图的实施例的描述。
1.一种暗场成像系统(10)，包括：
2.根据权利要求1所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
3.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
4.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
6.根据权利要求4或5所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
8.根据权利要求6所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
9.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
10.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
11.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
12.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
13.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)，其特征在于，
14.根据任一前述权利要求所述的暗场成像系统(10)在用于与自动化实验室系统(100)中的生物样品的感兴趣区域交互的应用中的用途。
15.一种自动化实验室系统(100)，包括：
