本技术涉及用于使通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质去磷酸化的新型融合蛋白，编码所述融合蛋白的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或载体的组合物，包含所述核酸、载体或组合物或相关药物组合物的宿主细胞。本技术还提供了用于使通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质(例如，依赖于磷酸化作为tcr信号通路中信号传导的活化机制的蛋白质)去磷酸化的方法，其中通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质可包含t细胞的膜结合蛋白(mbp)、激酶和/或支架蛋白的一个或多个亚基或结构域；用于产生在tcr信号通路中具有膜结合蛋白(mbp)的去磷酸化的亚基或结构域的t细胞的方法(例如，在tcr信号通路中具有cd3的去磷酸化的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的car t细胞；可选的，内源性cd3的去磷酸化的itam)；治疗疾病的方法；或减少或预防受试者中与向该受试者施用一种或多种car t细胞相关的gvhd。
背景技术：
1、迄今为止，嵌合抗原受体(car)t细胞疗法已在数种类型的血液恶性肿瘤的治疗中取得了成功，并且随着该领域的发展，预计我们将看到这种类型的免疫疗法在更多种类的癌症的治疗中的更多应用。car是一类设计用于模拟t细胞抗原受体(tcr)活性的合成受体。它们通常由胞外抗原识别基序和cd3ζ的itam信号传导基序组成，该胞外抗原识别基序在大多数形式中来源于抗体结合结构域(scfv)。最近的car形式，包括临床使用的那些，也具有t细胞共受体信号传导结构域，诸如来源于cd28或4-1bb的那些。随着car的疾病应用变得越来越广泛，car的结构变体也变得越来越广泛，从而增加了car形式的多样性。
2、也许采用car t细胞作为更常规的免疫治疗形式的最大障碍是缺乏标准化的、“现货型”治疗形式。目前批准用于临床使用的所有car形式都是自体治疗，这些自体治疗必须以每位患者为基础而产生，这极大地增加了car t细胞疗法的成本，并造成患者之间的高度差异，最终影响治疗结果。可靠的同种异体car t细胞形式的产生可缓解car t细胞领域中遇到的许多挑战。同种异体car t细胞将允许可重复的、可滴定的剂量以降低毒性，并且这些细胞可以替代的、标准化的形式产生，以解决抗原逃逸。特定的同种异体供体的选择对于产生响应于靶抗原的期望的或独特的活化特征谱也是重要的。
3、考虑到同种异体t细胞对于建立car作为前沿癌症疗法的重要性，先前已经描述了产生同种异体car t细胞的几种方法。这些方法主要涉及在染色体水平修饰供体细胞，包括trac基因座的非同源重组以消除tcrα，同时敲入car表达。其他方法包括crispr-cas9或talen介导的对tcr基因座的恒定区的破坏。尽管tcr基因座的基因操作是预防移植物抗宿主识别的一种有吸引力且通常有效的方式，但其工程化效率通常可能较低，并且由于crispr-cas9基因编辑而发生的靶向染色体破碎(chromothripsis)具有尚不清楚的后果，随着最新一代基因疗法在临床上的进展，这些后果可能会被揭示出来。其他人则通过重新利用与大部分宿主相容的病毒特异性t细胞来产生同种异体car t细胞。
4、当来源于同种异体供体的t细胞识别所移植的宿主的非自身pmhc时，发生移植物抗宿主病。供体t细胞对非自身肽配体的识别可导致宿主组织和器官的靶向破坏，并可触发潜在的致命性炎症反应。这种t细胞-靶细胞识别是由于hla匹配不完善而发生的，并且是许多造血干细胞受体必须维持在慢性免疫抑制状态的原因。
5、在最基本的水平上，当tcr抗原受体复合物遇到同源肽结合的主要组织相容性复合物(pmhc)时，发生tcr触发。tcr对pmhc的识别最终导致受体聚集，并最终将信号传导分子在t细胞-靶细胞膜界面处重组为称为“免疫突触”的结构。tcr受体微团簇的形成是t细胞完全活化的关键。这些微团簇形成在t细胞和靶细胞之间的紧密膜附着的区域处，并导致排除具有大的刚性胞外结构域的蛋白质，诸如cd45。这一观察结果产生了t细胞活化的动力学分离模型，该模型指出，在受体聚簇期间，激酶诸如lck和zap70能够接触tcr的itam基序，从而导致磷酸化和下游信号传导的传播。然而，由于这些相同itam基序的大的胞外结构域，这些基序无法与磷酸酶诸如cd45或cd148接触。
6、car t细胞疗法领域中必须解决的主要问题是开发使tcr特异性失活但同时不会使car广泛失活的同种异体技术。使用嵌合磷酸酶，我们已经设计了一种方法，在无需基因敲除、降解或敲低tcr的组分的表达的情况下，使tcr信号传导特异性失活。
技术实现思路
1、本技术提供了用于使调节t细胞活化(例如，通过tcr信号通路)的蛋白质去磷酸化的新型融合蛋白(即，嵌合磷酸酶)，编码所述融合蛋白的核酸，包含所述核酸的融合蛋白表达盒、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或载体的组合物、包含所述核酸、载体或组合物或相关药物组合物的宿主细胞。本技术还提供了用于使调节t细胞活化的蛋白质(例如，依赖于磷酸化作为tcr信号通路中信号传导的活化机制的蛋白质)去磷酸化的方法。通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质可包含选自t细胞的膜结合蛋白(mbp)、激酶和支架蛋白中的一个或多个的蛋白质的一个或多个亚基或结构域。本技术还提供了产生t细胞的方法，该t细胞具有tcr信号通路中的膜结合蛋白(mbp)的去磷酸化的亚基或结构域(例如，具有mbp的去磷酸化的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的car t细胞；可选的，内源性mbp的去磷酸化的itam)，治疗疾病的方法，或减少或预防受试者中与向该受试者施用一种或多种cart细胞相关的gvhd。
2、在本技术中，使通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质去磷酸化(其中优选地，该蛋白质依赖于磷酸化作为tcr信号通路中信号传导的活化机制，诸如选自t细胞的膜结合蛋白(mbp)、激酶和支架蛋白中的一个或多个的蛋白质的一个或多个亚基或结构域)是通过去磷酸化蛋白实现的，其中该去磷酸化蛋白包含磷酸酶(例如，受体样蛋白酪氨酸磷酸酶，优选cd45或cd148)或其变体的一个或多个亚基或结构域。用于通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质的去磷酸化蛋白的靶向特异性由连接蛋白(例如膜结合蛋白(mbp)的一个或多个亚基的跨膜结构域)介导。因此，通过tcr信号通路的t细胞活化可由融合蛋白调节，而无需降解、敲低或基因敲除tcr信号通路的组分。在同种异体car t细胞中，这些融合蛋白使tcr信号传导特异性失活，但不会使tcr信号传导和car信号传导二者广泛失活。这可在无需降解、敲低或基因敲除tcr信号传导的组分的情况下实现；因此，可减少或预防受试者中与施用car t细胞相关的移植物抗宿主病(gvhd)。
3、在一个方面，融合蛋白包括：去磷酸化蛋白和连接蛋白，其中
4、该去磷酸化蛋白包含磷酸酶或其变体的一个或多个亚基或结构域，并且
5、该连接蛋白包含t细胞的膜结合蛋白(mbp)的一个或多个亚基的跨膜结构域，或者该连接蛋白包含t细胞的膜结合蛋白(mbp)的一个或多个亚基的胞外结构域和跨膜结构域。
6、在一个具体实施方案中，作为连接蛋白，该mbp包含tcr和cd3中的一个或多个；优选地，该mbp是哺乳动物来源的mbp，更优选人mbp；并且
7、更优选地，该胞外结构域来源于cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、tcrα或tcrβ中的一个或多个的胞外结构域；
8、更优选地，该跨膜结构域来源于cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、tcrα或tcrβ中的一个或多个的跨膜结构域。
9、在一个具体实施方案中，磷酸酶为受体样蛋白酪氨酸磷酸酶；优选地，去磷酸化蛋白包含受体样蛋白酪氨酸磷酸酶或其变体的胞内磷酸酶结构域；更优选地，受体样蛋白酪氨酸磷酸酶包括cd45或cd148。
10、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)连接蛋白；和(2)去磷酸化蛋白。
11、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)t细胞的膜结合蛋白(mbp)的一个或多个亚基的跨膜结构域；和(2)去磷酸化蛋白。
12、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)t细胞的膜结合蛋白(mbp)的一个或多个亚基的胞外结构域、跨膜结构域；和(2)去磷酸化蛋白。
13、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、tcrα或tcrβ或它们的变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd45或cd148或它们的变体的胞内磷酸酶结构域。
14、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、tcrα或tcrβ或它们的变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、tcrα或tcrβ或它们的变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd45或cd148或它们的变体的胞内磷酸酶结构域。
15、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε或它们的变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd45或cd148或它们的变体的胞内磷酸酶结构域。
16、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε或它们的变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε或它们的变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd45或cd148或它们的变体的胞内磷酸酶结构域。
17、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ζ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd45或其变体的胞内磷酸酶结构域。
18、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ζ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域。
19、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ε或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ε或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域。
20、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3δ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3δ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域。
21、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3γ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3γ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；和(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域。
22、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ζ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ζ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域；和(3)嘌呤霉素选择标记和/或gfp。
23、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3ε或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3ε或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域；和(3)嘌呤霉素选择标记和/或gfp。
24、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3δ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3δ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域；和(3)嘌呤霉素选择标记和/或gfp。
25、在一个具体实施方案中，融合蛋白从n末端到c末端包含：(1)cd3γ或其变体中的一个或多个的胞外结构域，cd3γ或其变体中的一个或多个的跨膜结构域；(2)cd148或其变体的胞内磷酸酶结构域；和(3)嘌呤霉素选择标记和/或gfp。
26、在一个具体实施方案中，融合蛋白能够介导调节t细胞活化(例如，通过tcr信号通路)的蛋白质的去磷酸化，并且调节t细胞活化的蛋白质包含选自t细胞的膜结合蛋白(mbp)、激酶或支架蛋白中的一个或多个的蛋白质的一个或多个亚基或结构域；
27、优选地，调节t细胞活化的蛋白质包含tcr或cd3的一个或多个亚基或结构域；更优选地，该tcr或cd3是哺乳动物来源的tcr或cd3，更优选人tcr或cd3；并且更优选内源性tcr或cd3；更优选地，调节t细胞活化的蛋白质包含膜结合蛋白(mbp)的itam结构域，优选cd3的itam结构域，更优选cd3ζ的itam结构域；
28、优选地，激酶包括zap70；并且更优选地，激酶是哺乳动物来源的激酶，更优选人激酶；或者
29、优选地，支架蛋白包括lat和/或slp76；并且更优选地，支架蛋白是哺乳动物来源的支架蛋白，更优选人支架蛋白。
30、在另一个实施方案中，cd3ζ的跨膜结构域包含与seq id no.3所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3ε的跨膜结构域包含与seq id no.28所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3γ的跨膜结构域包含与seq id no.31所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且cd3δ的跨膜结构域包含与seq id no.34所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
31、在另一个实施方案中，cd3ζ的胞外结构域包含与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3ε的胞外结构域包含与seq id no.27所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3γ的胞外结构域包含与seq id no.30所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且cd3δ的胞外结构域包含与seq id no.33所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
32、在另一个实施方案中，cd45的胞内磷酸酶结构域包含与seq id no.4所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或cd148的胞内磷酸酶结构域包含与seq id no.5所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
33、在另一个实施方案中，融合蛋白包含信号肽序列，其中该信号肽序列包含与seqid no:1、26、29或32中任一所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
34、优选地，cd3ζ信号肽序列包含与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3ε信号肽序列包含与seq id no.26所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3γ信号肽序列包含与seq id no.29所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且cd3δ信号肽序列包含与seq id no.32所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
35、在另一个方面，本技术提供了一种核酸，其包含编码本技术的融合蛋白的多核苷酸。
36、在另一个方面，本技术提供了一种融合蛋白表达盒，其包含编码融合蛋白和纯化选择标记两者的核酸；更优选地，该纯化选择标记是嘌呤霉素选择标记；更优选地，该嘌呤霉素选择标记包含与seq id no.25所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
37、在另一个方面，本技术提供了一种载体，其包含编码融合蛋白的核酸或融合蛋白表达盒。
38、在另一个方面，本技术提供了一种组合物，其包含本发明的核酸或载体。
39、在一个具体实施方案中，该组合物包含第一核酸和第二核酸，其中
40、(1)该第一核酸编码本技术的融合蛋白，并且
41、(2)该第二核酸编码嵌合抗原受体(car)，该嵌合抗原受体包含：
42、(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含与预先确定的抗原特异性结合的单链可变片段(scfv)；
43、(b)跨膜结构域，优选cd8α、cd28、4-1bb或il2rβ跨膜结构域，更优选cd8α跨膜结构域；和
44、(c)胞质区段，该胞质区段包含一个或多个信号传导结构域，优选地包含4-1bb信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。
45、本技术还提供了一种组合物，其包含具有第一核酸的第一载体和具有第二核酸的第二载体，其中
46、(1)该第一核酸编码本技术的融合蛋白，并且
47、(2)该第二核酸编码嵌合抗原受体(car)，该嵌合抗原受体包含：
48、(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含与预先确定的抗原特异性结合的单链可变片段(scfv)；
49、(b)跨膜结构域，优选cd8α、cd28、4-1bb或il2rβ跨膜结构域，更优选cd8α跨膜结构域；和
50、(c)胞质区段，该胞质区段包含一个或多个信号传导结构域，优选地包含4-1bb信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。
51、本技术还提供了一种组合物，其包含具有第一核酸和第二核酸的载体，其中
52、(1)该第一核酸编码本技术的融合蛋白，并且
53、(2)该第二核酸编码嵌合抗原受体(car)，该嵌合抗原受体包含：
54、(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含与预先确定的抗原特异性结合的单链可变片段(scfv)；
55、(b)跨膜结构域，优选cd8α、cd28、4-1bb或il2rβ跨膜结构域，更优选cd8α跨膜结构域；和
56、(c)胞质区段，该胞质区段包含一个或多个信号传导结构域，优选地包含4-1bb信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。
57、在一个具体实施方案中，该预先确定的抗原是肿瘤相关抗原。
58、在另一个实施方案中，该肿瘤相关抗原选自以下组：cea、claudin 18.2(即cldn18.2)、gpc3、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、cd38、cd19、cd20、cd22、bcma、caix、cd446、cd133、egfr、egfrviii、epcam、gd2、epha2、her1、her2、icam-1、il13ra2、间皮素、muc1、muc16、nkg2d、psca、ny-eso-1、mart-1、wt1、mage-a10、mage-a3、mage-a4、ebv、nkg2d、pd1、pd-l1、cd25、il-2和cd3。
59、在另一个实施方案中，该肿瘤相关抗原是cea，更优选ceacam5。
60、在另一个实施方案中，由第二核酸编码的嵌合抗原受体(car)从n末端到c末端包含：
61、mn14op scfv-cd8α铰链-cd8αtm-4-1bb-cd3ζint；
62、841scfv-cd8α铰链-cd8αtm-4-1bb-cd3ζint；或
63、cd8α信号肽-mn14op scfv-cd8α铰链-cd8αtm-4-1bb-cd3ζint-p2a-gfp。
64、在另一个实施方案中，本技术提供了从具有第一核酸和第二核酸的载体获得的ac7构建体，该构建体从n末端到c末端包含：
65、sp-cd3ζex/tm–cd148 int-p2a-sp-ceacam-5scfv-cd8α铰链-cd8αtm-4-1bb-cd3ζint。
66、在另一个实施方案中，car的n末端还含有前导序列，并且car的c末端还含有p2a-gfp序列，其中，
67、该前导序列包含与seq id no.11所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，
68、cd8α铰链包含与seq id no.:14所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，
69、cd8αtm包含与seq id no.:15所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，
70、4-1bb胞内结构域包含与seq id no.:16所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，
71、cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:17所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，
72、gfp包含与seq id no.:23所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且
73、该p2a包含与seq id no.22所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
74、在另一个实施方案中，mn14op scfv(即ceacam-5scfv)包含与seq id no.12所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
75、841scfv包含与seq id no.13所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。。
76、在另一个方面，本技术还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的核酸、或载体、或组合物。
77、在另一个实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物t细胞，优选人t细胞。
78、在另一个实施方案中，该宿主细胞是jurkat细胞、原代t细胞、γδt细胞或nk t细胞。
79、在另一个实施方案中，该宿主细胞是同种异体t细胞。
80、在一些实施方案中，该宿主细胞是同种异体car t细胞。该同种异体car t细胞具有tcr/cd3复合物的内源性cd3的去磷酸化的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，以及如上所述的car。
81、在另一个方面，本技术还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的核酸、载体、组合物或宿主细胞。
82、在一个具体实施方案中，该组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
83、在另一个方面，本技术提供了一种用于使通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质去磷酸化的方法，其中优选地，这些蛋白质依赖于磷酸化作为该tcr信号通路中信号传导的活化机制，优选地，这些蛋白质是t细胞的tcr信号通路中的膜结合蛋白(mbp)的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，包括将本技术的核酸、载体或组合物引入t细胞中。
84、在一个具体实施方案中，该t细胞是哺乳动物t细胞，优选人t细胞。
85、在一个具体实施方案中，该t细胞是jurkat细胞、原代t细胞、γδt细胞或nkt细胞。
86、在另一个实施方案中，该t细胞是同种异体t细胞。
87、在另一个方面，本技术提供了一种产生t细胞的方法，该t细胞具有通过tcr信号通路调节t细胞活化的去磷酸化的蛋白质，其中优选地，这些蛋白质依赖于磷酸化作为该tcr信号通路中信号传导的活化机制，优选地，这些蛋白质是t细胞的tcr信号通路中的膜结合蛋白(mbp)的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，包括将本技术的核酸、载体或组合物引入t细胞中。
88、在另一个方面，本技术提供了一种治疗疾病的方法，其中将治疗有效量的本技术的组合物施用于有需要的受试者。
89、在另一个方面，本技术提供了一种治疗疾病的方法，其中将治疗有效量的本技术的宿主细胞施用于有需要的受试者。
90、在另一个方面，t细胞是jurkat细胞、原代t细胞、γδt细胞或nkt细胞。
91、在另一个方面，受试者引起减少的移植物抗宿主病(gvhd)。
92、在另一个方面，本技术提供了一种减少或预防受试者中与向该受试者施用一种或多种car t细胞相关的gvhd的方法，该方法包括
93、(1)用本技术的核酸或载体或组合物转导一种或多种car t细胞，以及
94、(2)向该受试者施用转导的car t细胞。
95、本技术的技术方案具有以下优点：
96、1.通过tcr信号通路的t细胞活化可由融合蛋白调节，而无需降解、敲低或基因敲除tcr信号传导的组分。
97、2.在无需降解、敲低或基因敲除tcr信号通路的组分的情况下，获得使tcr信号传导特异性失活但并未使tcr信号传导和car信号传导二者广泛失活的同种异体car t细胞，并且可减少或预防受试者中与car t细胞的施用相关的gvhd。
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：去磷酸化蛋白和连接蛋白，其中
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述磷酸酶为受体样蛋白酪氨酸磷酸酶；优选地，所述去磷酸化蛋白包含所述受体样蛋白酪氨酸磷酸酶或其变体的胞内磷酸酶结构域；更优选地，所述受体样蛋白酪氨酸磷酸酶包括cd45或cd148。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白从n末端到c末端包含：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中cd3ζ的所述跨膜结构域包含与seq id no:3所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3ε的所述跨膜结构域包含与seq id no.:28所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3γ的所述跨膜结构域包含与seq id no.:31所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，cd3δ的所述跨膜结构域包含与seq id no.:34所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：
7.一种核酸，所述核酸包含编码根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。
8.一种融合蛋白表达盒，所述融合蛋白表达盒包含编码权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白和纯化选择标记两者的核酸；更优选地，所述纯化选择标记是嘌呤霉素选择标记，更优选地，所述嘌呤霉素选择标记包含与seq id no.:25所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
9.一种载体，所述载体包含根据权利要求7所述的核酸或根据权利要求8所述的融合蛋白表达盒。
10.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求7所述的核酸或根据权利要求9所述的载体。
11.一种包含第一核酸和第二核酸的组合物，所述组合物包含具有第一核酸和第二核酸的载体，或者包含具有第一核酸的第一载体和具有第二核酸的第二载体，其中
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述预先确定的抗原是肿瘤相关抗原，
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求7所述的核酸、或根据权利要求9所述的载体、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物；其中
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求9所述的载体、根据权利要求10至12中任一项所述的组合物、或根据权利要求13所述的宿主细胞；其中优选地，所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
15.一种用于使通过tcr信号通路调节t细胞活化的蛋白质去磷酸化的方法，其中优选地，所述蛋白质依赖于磷酸化作为所述tcr信号通路中信号传导的活化机制，优选地，所述蛋白质是t细胞的所述tcr信号通路中的膜结合蛋白(mbp)的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)；可选的，所述mbp是内源性mbp，包括将根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求9所述的载体、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物引入t细胞中；其中
16.一种产生t细胞的方法，所述t细胞具有通过tcr信号通路调节t细胞活化的去磷酸化的蛋白质，其中优选地，所述蛋白质依赖于磷酸化作为所述tcr信号通路中信号传导的活化机制，优选地，所述蛋白质是所述tcr信号通路中的膜结合蛋白(mbp)的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)；可选的，所述mbp是内源性mbp，包括将根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求9所述的载体、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物引入t细胞中；其中
17.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求10至12中任一项所述的组合物、或治疗有效量的根据权利要求13所述的宿主细胞；其中
18.一种减少或预防受试者中与向所述受试者施用一种或多种car t细胞相关的移植物抗宿主病(gvhd)的方法，所述方法包括：
