本发明是关于一种核酸脂质纳米载体，具体而言，是关于一种新型脂质纳米载体组合物、载核酸的脂质纳米载体及它们的制备方法与应用。
背景技术：
1、核酸分子是生命活动的基础，核酸药物则是通过将外源基因导入靶细胞或组织，进而替代、补偿、阻断或修正特定基因，以达到治疗和预防疾病的目的。核酸药物的研发生产工艺相对简单，具有研发周期短、临床开发成功率高、改良可塑性好等优势。核酸疫苗在近几年作为预防covid-19的主力军之一，也已经证明了它在市场的巨大潜力。但是普通核酸分子通常在体内循环时间较短、易被降解。因此提高核酸药物的体内递送效率，是提高该类产品有效性的关键研究方向之一。
2、目前，应用最广的核酸药物的递送载体是多脂质组分组成的纳米颗粒，它具有提高基因药物疗效以及靶向递送作用等特点，可以保护核酸在体内不被迅速降解，延长循环时间，增强靶向递送。此类脂质纳米颗粒通常包括2～4个脂质组分：1种可离子化脂质、0～2种辅助脂质和0～1种peg脂质。
3、多脂质组分组成的纳米颗粒根据其中脂质组分和制备方式不同，又可以分为lnp(lipid nanoparticle)、lpx(lipoplex)和lpp(lipolyplex)等。其中，lnp通常由1种可离子化脂质、1种中性磷脂、1种类固醇(如胆固醇)、1种peg脂质构成，zeta电位通常为电中性(-15～+15mv)(nano lett.2017,17,1326-1335)。制备时，将含有脂质的乙醇溶液和含有核酸的水相缓冲液混合在一起，再通过透析等方式除去乙醇，最终得到载核酸的lnp。lpx则通常由1种可离子化脂质(通常为带强正电荷的阳离子脂质)和1种辅助脂质(如胆固醇、dope，或dspc)组成，zeta电位通常偏离电中性(<-20mv或>+20mv)(nature 534(7607)(2016)396-401)。制备时，将含有脂质的有机相蒸发旋干，再加入水相缓冲液，通过超声或挤压法等形成纳米颗粒，再与核酸溶液混合，得到载核酸的lpx。一般说来，与lpx这种偏离电中性的纳米颗粒相比，尤其是与正电荷的lpx(>+20mv)相比，电中性的lnp毒性会略低一些(smallmethods(2018)(2)1700375)。
4、脂质纳米颗粒中，各组分作用不同，其含量配比也会极大地影响纳米颗粒的组织分布和转染效率(us8058069b2)。在mrna-lnp中，可离子化脂质可以在特定ph下带正电荷，承担包载和释放mrna的作用，其用量通常占总脂质组分的50％-65％；中性磷脂一般具有较高的相变温度，可增强lnp的稳定性，有助于包裹核酸，通常占比为4％-10％；胆固醇作为纳米颗粒表面较多的组分，可能会影响其内吞的方式和效率，通常占比30％-40％；peg脂质则对纳米颗粒的血清稳定性、内吞效率有重要影响，通常占比0.5％-2％。
5、虽然以上关于经典配方的现有技术中，已经对各组分作用和配比做出一定解释，但在具体实施案例中，并不能一概而论。zhang等人(biomat sci(2021)(9)1449–1463)报道了通过静脉给药，包含dope中性磷脂的lnp可在肝脏中积累，而包含dspc中性磷脂的lnp则在脾脏中积累，证明了结构脂质对lnp生物分布的影响。sago等人(nat biomed eng 6(2)(2022)157-167)报道，如果按50：38.5：10：1.5(可离子化脂质ckk-e12：胆固醇：dspc：peg脂质)配制lnp，mrna将主要递送至肝脏中进行表达；如果按照80：20(可离子化脂质7c1：peg脂质)配制，mrna将主要被递送至肺部；如果按照60：10：5：25(可离子化脂质7c1：胆固醇：dspc：peg脂质)配制lnp，mrna将主要被递送至脾脏。
6、因此，行业内仍需要研发更多的脂质纳米载体。
技术实现思路
1、本发明的一个目的在于提供一种新的核酸药物纳米载体组合物。
2、本发明的另一目的在于提供所述组合物的应用。
3、本发明的另一目的在于提供一种核酸药物纳米载体。
4、本发明的另一目的在于提供所述核酸药物纳米载体的制备方法。
5、本发明的另一目的在于提供所述核酸药物纳米载体的应用。
6、一方面，本发明提供了一种用于核酸药物的纳米载体组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物包括以下脂质组分：
7、可离子化脂质：大于等于40％，小于等于55％；
8、peg修饰的脂质：大于等于0.5％，小于等于3.0％；
9、类固醇：大于等于40％，小于等于59％；
10、辅助磷脂：大于等于0且小于等于3％。
11、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物包括以下脂质组分：
12、可离子化脂质：大于等于42％，小于等于50％；
13、peg修饰的脂质：大于等于1.2％，小于等于3.0％；
14、类固醇：大于等于45％，小于等于56.6％；
15、辅助磷脂：大于等于0，小于等于2.5％。
16、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物包括以下脂质组分：
17、可离子化脂质：大于等于48％，小于等于50％；
18、peg修饰的脂质：大于等于1.2％，小于等于3.0％；
19、类固醇：大于等于45％，小于等于50.8％；
20、辅助磷脂：大于等于0，小于等于2.5％。
21、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物由以下脂质组分组成：
22、可离子化脂质：大于等于42％，小于等于50％；
23、peg修饰的脂质：大于等于1.4％，小于等于3.0％；
24、类固醇：大于等于47％，小于等于56.6％。
25、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物由以下脂质组分组成：
26、可离子化脂质：大于等于48％，小于等于50％；
27、peg修饰的脂质：大于等于1.4％，小于等于3.0％；
28、类固醇：大于等于47％，小于等于50.6％。
29、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述可离子化脂质为含有一个可电离胺基基团的脂质；
30、进一步优选地，所述可离子化脂质为式i所示结构的化合物或其药物可接受的盐、互变异构体或立体异构体：
31、
32、其中：
33、l1、l2为连接键或二价连接基，所述二价连接基各自独立地选自-c(＝o)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)o-、-o-、-s-、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-n(r8)c(＝o)-、-c(＝o)n(r8)-、-n(r8)c(＝o)o-、-oc(＝o)n(r8)-、-sc(＝o)n(r8)-、-n(r8)c(＝o)s-、-c(＝s)-、-sc(＝s)-、和-c(＝s)s-中任一种，所述r8为h或c1-c12烷基；
34、r2和r3独立地为取代或未取代的c1-c18直链亚烷基；
35、r4、r5、r6、r7独立地为氢，或者是取代或未取代的c1-c30脂肪烃基，或者是-r9-l4-r10；所述r9、r10每次出现时独立地为取代或未取代的c1-c18脂肪烃基，l4为o、s、烯基或炔基；
36、r1为h、-r11、-or11、-r11-oh、-r11-or12、-r11-oc(＝o)r12、-r11-nhc(＝o)-r12、
37、-r11-och3或-r11-n(r12)(r13)；r11为c1-c12直链烷基或支链烷基，r12和r13各自独立地分别为h或c1-c12直链烷基，或者，r12与r13和其连接的n原子形成c3-c10杂环烷基。
38、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，式i中：
39、l1、l2为连接键或二价连接基，所述二价连接基各自独立地选自-c(＝o)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-o-、-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-中任意一种。
40、r2和r3独立地为取代或未取代的c3-c9直链亚烷基；
41、r4、r5、r6、r7独立地为氢，或者是取代或未取代的c1-c12脂肪烃基，或者是-r9-l4-r10；所述r9、r10每次出现时独立地为取代或未取代的c1-c10脂肪烃基，l4为o、s、烯基或炔基；
42、r1为h、-r11或-r11-oh，其中r11为c1-c6直链烷基。
43、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述可离子化脂质选自dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dlindma、di((z)-non-2-en-1-yl)9-((4-(dimethylamino)butanoyl)oxy)heptadecanedioate、sm-102、alc-0315、heptadecan-9-yl8-((2-hydroxyethyl)(5-((2-methyl-3-(octylthio)propanoyl)oxy)pentyl)amino)octanoate、heptadecan-9-yl 8-((7-((3-(hexylthio)-2-methylpropanoyl)oxy)heptyl)(2-hydroxyethyl)amino)octanoate、6-((6-((2-hexyldecanoyl)thio)hexyl)(4-hydroxybutyl)amino)hexyl 2-hexyldecanoate、heptadecan-9-yl 8-((2-hydroxyethyl)(6-oxo-6-(undecylthio)hexyl)amino)octanoate或其互变异构体和立体异构体中的一种或多种。
44、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述peg修饰的脂质选自dmg-peg，dspe-peg，dmpe-peg，dppe-peg，peg-cer，dag-peg，dma-peg或alc-0159中的一种或多种。
45、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述peg修饰的脂质中的peg部分(例如mpeg-nh2)的大小为1000-10000da，优选为1000-5000da，进一步优选为1000-3400da。
46、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述peg脂质的脂质部分长度为c14至c18。
47、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述类固醇为胆固醇。
48、根据本发明的具体实施方案，本发明的用于核酸药物的纳米载体组合物中，所述辅助磷脂选自dspc、dppc、dmpc、dopc、dops、popc或dope中的一种或多种。
49、另一方面，本发明还提供了所述的组合物在制备核酸药物纳米载体中的应用。
50、另一方面，本发明还提供了一种核酸药物纳米载体，其是由本发明所述的组合物负载核酸药物而制备得到的。
51、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体，其粒径大小为50nm-200nm，优选为60nm-160nm；包封率大于80％；电位-15mv～+15mv，优选为-10mv～+10mv；pka为6.0-7.2，优选为6.2-7.0。
52、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体中，所述核酸为mrna。
53、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体中，所述核酸包含100至50000个核苷酸，或者200至20000个核苷酸，或者300至10000个核苷酸，或者500至9000个核苷酸。
54、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体中，可离子化脂质与核酸的氮磷比为3～10，优选为4～8，更进一步优选为5～6.5。
55、另一方面，本发明还提供了一种核酸药物纳米载体的制备方法，该方法包括：
56、配制含有本发明所述脂质组合物的乙醇溶液，与含有核酸药物的水相缓冲液混合，制备得到载有核酸药物的纳米载体。
57、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体的制备方法中，所述水相缓冲液的ph为3～7，优选为3～5，进一步优选为3.5～5。
58、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体的制备方法中，将含有脂质组合物的乙醇溶液与含有核酸药物的水相缓冲液混合的方式采用微流控芯片进行。
59、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体的制备方法中，混合后得到的混合体系中，核酸与可离子化脂质的氮磷比为3～10：1；优选为4～8：1，更进一步优选为5～6.5：1。
60、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体的制备方法中，混合后得到的混合体系进行后续处理；所述后续处理包括将缓冲液中的乙醇置换为水、nacl、pbs、hepes、pb、tris、柠檬酸、醋酸缓冲液中的一种或多种组合；其中，置换后的溶液体系ph为4.5～8，优选为6～7.5。
61、根据本发明的具体实施方案，本发明中，制备得到的载有核酸药物的纳米载体于2～25℃保存，或添加冷冻保护剂后于-80～-20℃保存，或添加冻干保护剂后冻干处理后保存。
62、根据本发明的具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体的制备方法中，所述冷冻保护剂、冻干保护剂各地独立地选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖、精氨酸、葡萄糖、β-环糊精中的一种或多种。
63、另一方面，本发明还提供了所述的核酸药物纳米载体或所述的方法制备的核酸药物纳米载体在制备核酸药物中的应用。
64、根据本发明一些具体实施方案，本发明的核酸药物纳米载体可在实施对象中的肝脏富集，且可诱导高水平的蛋白质表达。
65、根据本发明的具体实施方案，本发明所述的核酸药物是用于在受试者中诱导蛋白质表达。
66、根据本发明的具体实施方案，本发明所述的核酸药物是用于在受试者肝脏中诱导蛋白质表达。
67、根据本发明一些具体实施方案，其中，核酸药物纳米载体的受试者为哺乳动物或人，所述哺乳动物优选为灵长类动物。
68、综上所述，本发明提供了一种新型核酸脂质纳米载体及其制备方法与应用。相比于传统lpx，本发明的核酸脂质纳米载体毒性更小，实现了更高的体内递送效率。尤其是纳米载体如果通过静脉或肌肉注射，会更多地在肝脏处富集，总体蛋白表达升高的同时，降低了全身毒性。
1.一种用于核酸药物的纳米载体组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物包括以下脂质组分：
2.根据权利要求1所述的组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物包括以下脂质组分：
3.根据权利要求1所述的组合物，以该组合物中脂质的总摩尔量为100％计，该组合物由以下脂质组分组成：
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中，所述可离子化脂质为含有一个可电离胺基基团的脂质；
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，式i中：
6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述可离子化脂质选自dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dlindma、di((z)-non-2-en-1-yl)9-((4-(dimethylamino)butanoyl)oxy)heptadecanedioate、sm-102、alc-0315、heptadecan-9-yl 8-((2-hydroxyethyl)(5-((2-methyl-3-(octylthio)propanoyl)oxy)pentyl)amino)octanoate、heptadecan-9-yl 8-((7-((3-(hexylthio)-2-methylpropanoyl)oxy)heptyl)(2-hydroxyethyl)amino)octanoate、6-((6-((2-hexyldecanoyl)thio)hexyl)(4-hydroxybutyl)amino)hexyl 2-hexyldecanoate、heptadecan-9-yl 8-((2-hydroxyethyl)(6-oxo-6-(undecylthio)hexyl)amino)octanoate或其互变异构体和立体异构体中的一种或多种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其中，所述peg修饰的脂质选自dmg-peg，dspe-peg，dmpe-peg，dppe-peg，peg-cer，dag-peg，dma-peg或alc-0159中的一种或多种；
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其中，所述类固醇为胆固醇。
9.根据权利要求1-8任一项所述的组合物，其中，所述辅助磷脂选自dspc、dppc、dmpc、dopc、dops、popc或dope中的一种或多种。
10.权利要求1-9任一项所述的组合物在制备核酸药物纳米载体中的应用。
11.一种核酸药物纳米载体，其是由权利要求1-9任一项所述的组合物负载核酸药物而制备得到的。
12.根据权利要求11所述的核酸药物纳米载体，其粒径大小为50nm-200nm，优选为60nm-160nm；包封率大于80％；电位-15mv～+15mv，优选为-10mv～+10mv；pka为6.0-7.2，优选为6.2-7.0。
13.根据权利要求11或12所述的核酸药物纳米载体，其中，所述核酸为mrna；
14.根据权利要求11-13任一项所述的核酸药物纳米载体，其中，核酸与可离子化脂质的氮磷比为3～10，优选为4～8，更进一步优选为5～6.5。
15.一种核酸药物纳米载体的制备方法，该方法包括：
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述水相缓冲液的ph为3～7，优选为3～5，进一步优选为3.5～5。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，将含有脂质组合物的乙醇溶液与含有核酸药物的水相缓冲液混合的方式采用微流控芯片进行；
18.根据权利要求15-17任一项所述的方法，其中，制备得到的载有核酸药物的纳米载体于2～25℃保存，或添加冷冻保护剂后于-80～-20℃保存，或添加冻干保护剂后冻干处理后保存。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述冷冻保护剂、冻干保护剂各地独立地选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖、精氨酸、葡萄糖、β-环糊精中的一种或多种。
20.权利要求11-14任一项所述的核酸药物纳米载体或权利要求15-19任一项所述的方法制备的核酸药物纳米载体在制备核酸药物中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述核酸药物是用于在受试者中诱导蛋白质表达，优选地，所述核酸药物是用于在受试者肝脏中诱导蛋白质表达。
22.根据权利要求20或21所述的应用，其中所述受试者为哺乳动物或人，所述哺乳动物优选为灵长类动物。
