本发明属于生物药剂领域，具体涉及一种测定脑蛋白水解物对损伤pc12细胞的修复率的方法。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、脑蛋白水解物是从健康的猪脑中提取得到的一种活性肽类水解物，含有多种氨基酸、卵磷脂及脑磷脂等，对于神经系统具有重要的保护作用。脑蛋白水解物能够显著提高使用者的记忆力及注意力，因而临床上常用于阿尔茨海默症（老年痴呆）等神经系统疾病的治疗。目前国内生产复方脑蛋白水解物片的厂家较多，因此需要建立合适的活性检测指标对其进行质量考察。pc12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化的细胞株，其受体及合成的递质均与中脑多巴胺能神经元十分接近，具有典型的神经细胞特征，因此广泛应用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害的研究。目前，在具有神经保护作用的药物筛选中，pc12细胞模型已得到广泛应用。
3、生物活性是药品有效性的用药指标之一，2020年12月30日，《中国药典》2020年版开始实施，新增了脑蛋白水解物的活力测定项目，方法系通过脑蛋白水解物对mpp+损伤的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（低分化pc12细胞）具有修复作用，pc12细胞的生长状况因脑蛋白水解物生物学活性的不同而不同，以此检测脑蛋白水解物的活力。但现有的活力测定方法存在着不适用于复方脑蛋白水解物制剂的活力测定，并且脑蛋白水解物制剂的辅料会严重干扰活力的测定结果等问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定脑蛋白水解物对损伤pc12细胞的修复率的方法。所述方法具有专属性良好及灵敏度高等优点，能够用于快速评价脑蛋白水解物对于pc12细胞损伤的修复能力。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种测定脑蛋白水解物对损伤pc12细胞的修复率的方法，所述方法为在经脑蛋白水解物培养得到的pc12细胞培养液中加入caspase-glo®3/7assay试剂，根据pc12细胞的生物发光值计算得到脑蛋白水解物对损伤pc12细胞的修复率。
4、进一步地，所述方法采用以下步骤：
5、（1）培养pc12细胞至对数增长期，进行消化，得到细胞混悬液；
6、（2）将步骤（1）得到的细胞混悬液接种至96孔细胞培养板上的孔中，以完全培养液作为空白对照组1，进行培养，得到经培养后的细胞培养板；
7、（3）在步骤（2）得到的96孔细胞培养板上分别设置供试品组，损伤细胞组，正常细胞组，空白对照组2；
8、供试品组为向步骤（2）得到的96孔细胞培养板上的细胞液中加入氯化钴溶液和供试品溶液；
9、损伤细胞组为向步骤（2）得到的96孔细胞培养板上的细胞液中加入氯化钴溶液和完全培养液；
10、正常细胞组为向步骤（2）得到的96孔细胞培养板上的细胞液中加入完全培养液；
11、空白对照组2为向步骤（2）得到的培养后的空白对照组1中加入完全培养液；
12、每组设3个复孔；
13、将供试品组，损伤细胞组，正常细胞组和空白对照组2进行培养，分别加入caspase-glo®3/7assay试剂，孵育，测定生物发光值，按照下式进行计算：
14、修复率=（ai-ax）/（ai-ac）×100%；
15、其中，ac为正常细胞组平均生物发光值减去空白对照组2平均生物发光值；
16、ai为损伤细胞组平均生物发光值减去空白对照组2平均生物发光值；
17、ax为供试品组平均生物发光值减去空白对照组2平均生物发光值；
18、所述供试品为脑蛋白水解物或脑蛋白水解物制剂。
19、进一步地，所述方法采用以下步骤：
20、（1）培养细胞至对数增长期，进行消化，加入完全培养液稀释至每1 ml中含2×105个细胞，得到细胞混悬液；
21、（2）将步骤（1）得到的细胞混悬液按照每孔50 μl接种至96孔细胞培养板上，以完全培养液作为空白对照组1，进行培养；
22、（3）在步骤（2）得到的96孔细胞培养板上设置供试品组，损伤细胞组，正常细胞组，空白对照组2；
23、供试品组为向步骤（2）得到的96孔细胞培养板上的细胞液中加入25.00 μl 1.20mmol/l的氯化钴溶液及25.00 μl供试品溶液；
24、损伤细胞组为向步骤（2）得到的96孔细胞培养板上的细胞液中加入25.00 μl氯化钴（cocl2）溶液及25.00 μl完全培养液；
25、正常细胞组为向步骤（2）得到的96孔细胞培养板上的细胞液中加入50.00 μl完全培养液；
26、空白对照组为向步骤（2）得到的培养后的空白对照组中加入50.00 μl完全培养液；
27、每组设3个复孔；
28、将供试品组，损伤细胞组，正常细胞组和空白对照组2进行培养，加入100.00 μlcaspase-glo®3/7assay试剂，孵育，测定生物发光值，按照下式进行计算：
29、修复率=（ai-ax）/（ai-ac）×100%；
30、其中，ac为正常细胞组平均生物发光值减去空白对照组2平均生物发光值；
31、ai为损伤细胞组平均生物发光值减去空白对照组2平均生物发光值；
32、ax为供试品组平均生物发光值减去空白对照组2平均生物发光值；
33、所述供试品为脑蛋白水解物或脑蛋白水解物制剂。
34、进一步地，步骤（1）中，所述消化使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠（edta-2na）消化液进行。
35、进一步地，步骤（2）中，所述培养在5%二氧化碳饱和水汽的环境中进行，温度为37℃，时间为24 h。
36、进一步地，步骤（3）中，所述脑蛋白水解物制剂为复方脑蛋白水解物片。
37、进一步地，步骤（3）中，所述培养在5%二氧化碳饱和水汽的环境中进行，温度为37℃，时间为20 h。
38、进一步地，步骤（3）中，所述孵育在室温避光下进行，时间为90 min。
39、caspase是半胱氨酸蛋白酶家族，caspase-3和caspase-7属于caspase家族的凋亡效应子，位于级联反应下游，能被上游的始动子激活，激活后作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变，导致细胞凋亡。caspase-glo®3/7是一种能够实现均相发光，用于检测caspase-3和caspase-7活性的试剂，其产生的生物发光的强度与caspase-3和caspase-7的活性成正比，可以通过检测细胞产生的生物发光强度来表现细胞的损伤程度。基于该原理，本发明新建立一种适用于脑蛋白水解物或脑蛋白水解物制剂的活力测定方法。
40、有益效果：（1）caspase-glo®3/7试剂能够实现均相发光，可以通过检测细胞产生的生物发光强度来表现细胞的损伤程度，基于此原理本发明通过在pc12细胞的细胞培养液中加入caspase-glo®3/7assay试剂，根据pc12细胞的生物发光值计算得到的修复率来评价脑蛋白水解物或脑蛋白水解物制剂的生物活性。
41、（2）本发明的测定方法具有专属性良好及灵敏度高等优点，能够用于快速评价脑蛋白水解物或脑蛋白水解物制剂对于pc12细胞损伤的修复能力，并且克服了《中国药典》2020年版中的活力测定方法不适用于复方脑蛋白水解物制剂的活力测定及脑蛋白水解物制剂的辅料会严重干扰测定结果等缺点。
1.一种测定脑蛋白水解物对损伤pc12细胞的修复率的方法，其特征在于，所述方法为在经脑蛋白水解物培养的pc12细胞损伤模型中加入caspase-glo®3/7assay试剂，根据pc12细胞的生物发光值计算得到脑蛋白水解物对损伤pc12细胞的修复率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑蛋白水解物为脑蛋白水解物制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法采用以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述进行消化后，还需加入完全培养液稀释至每1 ml中含2×105个细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述消化使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液进行。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养在5%二氧化碳饱和水汽的环境中进行，温度为37℃，时间为24 h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养在5%二氧化碳饱和水汽的环境中进行，温度为37℃，时间为20 h。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述孵育在室温避光下进行，时间为90 min。
