本发明涉及一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法。
背景技术：
1、随着生物医药技术的快速发展，病毒培养技术在疫苗生产、病原学研究、抗病毒药物筛选等领域发挥着越来越重要的作用。特别是在疫苗的研发过程中，高效、稳定的病毒培养技术对于加快疫苗的研发速度、提高疫苗的生产效率具有关键意义。vero细胞作为一种广泛使用的宿主细胞系统，在病毒培养方面具有诸多优势，如易于培养、细胞遗传稳定性好、适应性广等。然而，在传统的病毒培养方法中，存在着一些限制和挑战，如病毒产量低、培养效率不高、培养过程中细胞状态难以控制等问题。
2、在传统的平板培养或瓶培养系统中，细胞生长在二维平面上，这限制了细胞生长的空间和病毒的产量。为了提高病毒产量，需要增加培养的体积或数量，这无疑增加了培养成本和操作复杂度。此外，细胞在二维培养系统中的生长状态与其在体内三维生长环境存在差异，可能影响细胞的生物学特性和病毒的复制效率。
3、微载体技术作为一种新兴的三维细胞培养技术，通过提供一个三维的生长平台，使细胞能够在更加接近体内环境的条件下生长和分裂，从而有效地提高细胞的生长效率和病毒的复制能力。然而，如何高效地激活微载体，使其更适合细胞的吸附和生长，以及如何优化细胞的培养条件以提高病毒的产量和培养的稳定性，仍然是当前亟需解决的关键技术问题。
4、目前轮状病毒的培养技术主要采用不含血清的培养基和静态细胞培养方法。虽然这种方法在某些研究和应用中已被证明是可行的，但它存在一系列的局限性和缺点，对轮状病毒生产效率和应用范围产生了影响。
5、首先，不含血清的培养基虽然减少了外源性变量，提高了实验的可重复性，但同时也剥夺了细胞生长所需的多种生长因子和营养素，这可能导致细胞生长速度减慢，细胞状态不佳，进而影响到病毒的复制效率和产量。血清作为传统细胞培养中的重要组分，提供了包括生长因子、粘附因子、激素和矿物质在内的多种营养物质，对细胞的生长和分化至关重要。不含血清的培养条件对细胞的代谢活动和生理状态可能产生不利影响，从而间接影响病毒的生产。
6、其次，静态细胞培养方法限制了细胞生长的空间和交换培养基中溶解氧和营养物质的效率。在静态培养系统中，细胞仅能在容器的底部生长，这限制了细胞增殖的空间，并可能导致细胞过度密集而抑制其生长。此外，静态培养条件下营养和代谢产物的分布不均，容易导致局部环境的营养耗尽或代谢产物积累，对细胞的健康状态和病毒复制产生不利影响。
7、此外，不含血清的培养基和静态培养方法对病毒培养规模的扩展也存在限制。在工业规模的病毒生产中，需要大量的细胞作为宿主以确保足够的病毒产量。然而，不含血清培养条件下细胞生长的限制以及静态培养方法的空间限制，使得大规模扩展生产变得更加困难和成本更高。
8、因此，虽然现有的轮状病毒培养方法在某些方面提供了便利，但其局限性明显，迫切需要开发更高效、稳定且适合大规模生产的病毒培养新技术，以满足生物医药领域对病毒疫苗和治疗药物研发的需求。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法。
2、本发明提供了一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，包括下述步骤：
3、a、微载体前处理：
4、b、vero细胞的培养：
5、c、微载体悬浮培养繁殖轮状病毒。
6、优选地，一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，包括下述步骤：
7、a、微载体前处理：
8、a1、微载体激活；
9、a2、微载体洗涤；
10、a3、微载体灭菌；
11、a4、微载体润洗；
12、a5、微载体重悬；
13、b、vero细胞的培养：
14、b1、vero细胞的复苏；
15、b2、vero细胞的传代；
16、b3、vero细胞的收获；
17、b4、收获的vero细胞计数；
18、b5、转瓶接种培养vero细胞；
19、c、微载体悬浮培养繁殖轮状病毒：
20、c1、病毒激活处理；
21、c2、清洗vero细胞；
22、c3、病毒吸附与培养：
23、c4、轮状病毒液收获。
24、优选地，一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，包括下述步骤：
25、a、微载体前处理：
26、a1、微载体激活：用dpbs溶液将微载体水合，进行激活；
27、a2、微载体洗涤：用dpbs溶液洗涤；
28、a3、微载体灭菌：对微载体进行水蒸气灭菌；
29、a4、微载体润洗：用dmem培养基溶液润洗；
30、a5、微载体重悬：用dmem培养基溶液重悬，得到微载体重悬液；
31、b、vero细胞的培养：
32、b1、vero细胞的复苏：用细胞复苏液对vero细胞进行复苏；
33、b2、vero细胞的传代：
34、b21、通过消化液处理实现细胞脱落、收集并转移至新培养瓶中继续培养；
35、b22、通过消化液处理、添加细胞生长液实现消化和重新悬浮过程，实现细胞的扩增和均匀分配至新的培养瓶中继续培养；
36、b3、vero细胞的收获：通过消化液处理和细胞悬浮技术，完成vero细胞的收集和均匀分配；
37、b4、收获的vero细胞计数：通过细胞计数仪进行vero细胞计数；
38、b5、转瓶接种培养vero细胞：通过细胞生长液和微载体重悬液处理，vero细胞经培养后，在微载体上生长并形成致密单层；
39、c、微载体悬浮培养繁殖轮状病毒：
40、c1、病毒激活处理：通过添加tpck胰酶母液和金属离子化合物液，实现病毒液的激活；
41、c2、清洗vero细胞：使用dpbs和dmem溶液清洗vero细胞；
42、c3、病毒吸附与培养：vero细胞中加入病毒液进行吸附，加入病毒生长液进行培养：
43、c4、轮状病毒液收获：收集处理和冷冻保存获得轮状病毒液。
44、优选地，所述消化液为胰蛋白酶和edta-2na的dpbs溶液。进一步优选地，所述消化液为0.15-0.35wt%胰蛋白酶和0.01-0.03wt% edta-2na的dpbs溶液。
45、优选地，所述细胞生长液包括dmem培养基溶液和新生牛血清。进一步优选地，所述dmem培养基溶液和新生牛血清的体积比（7-13）:1。
46、优选地，所述细胞复苏液包括dmem培养基溶液和新生牛血清。进一步优选地，所述dmem培养基溶液和新生牛血清的体积比（3-6）:1。
47、优选地，所述tpck胰酶母液为tpck胰酶的dpbs溶液，进一步优选地，病毒激活处理时tpck胰酶在病毒液中的终浓度为1-2μg/ml。
48、优选地，所述病毒生长液为含tpck胰酶的dmem培养基溶液，tpck胰酶在病毒生长液中的浓度为0.5-2.0μg/ml。
49、优选地，所述金属离子化合物液为金属离子化合物的水溶液，病毒激活处理时金属离子化合物在病毒液中的终浓度为0.5-1.5 g/l，所述金属离子化合物为氯化钙、氯化镁、氯化铜中的至少一种。
50、优选地，所述金属离子化合物液为氯化钙的水溶液，病毒激活处理时氯化钙在病毒液中的终浓度为0.5-1.5 g/l。
51、优选地，所述金属离子化合物液为氯化钙和氯化镁的水溶液，其中病毒激活处理时，氯化钙的终浓度为0.25-0.75g/l、氯化镁的终浓度为0.25-0.75g/l。
52、进一步优选地，所述金属离子化合物液包含氯化钙、氯化镁、谷胱甘肽和/或海美溴铵，其中病毒激活处理时，氯化钙的终浓度为0.25-0.75g/l、氯化镁的终浓度为0.25-0.75g/l，谷胱甘肽和/或海美溴铵的终浓度为0.5mm-1.5mm。
53、优选地，一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，包括下述步骤：
54、a、微载体前处理：
55、a1、微载体激活：将1.5g微载体加入到已硅化的玻璃瓶中，用90mldpbs溶液在37℃下水合3h并搅拌，室温下静置12小时；
56、a2、微载体洗涤：弃去上清液，加入75mldpbs溶液洗涤；弃去上清液；
57、a3、微载体灭菌：加入60mldpbs溶液，121℃水蒸气灭菌30min；
58、a4、微载体润洗：自然沉降后，弃去上清液，加入75ml的dmem培养基溶液润洗；
59、a5、微载体重悬：弃去上清液，用30ml的dmem培养基溶液重悬，得到微载体重悬液，室温放置备用；
60、b、vero细胞的培养
61、b1、vero细胞的复苏：
62、从液氮罐中取出一支装有1ml的vero细胞的冻存管后，放入37℃水浴1分钟，震荡融化；用移液器从冻存管中吸取vero细胞，加入装有5ml细胞复苏液的15ml离心管中，吹打混匀后1000rpm离心10min；弃去上清，再次加入5ml细胞复苏液，重新混悬细胞后转入t75细胞培养瓶中，然后补加细胞复苏液至40ml，盖上瓶塞，放入37℃培养箱中培养72小时；
63、b2、vero细胞的传代：
64、b21、通过倒置显微镜观察，细胞已长成致密单层即铺满整个瓶底，此时弃去培养容器内的旧培养基，加8ml消化液，晃动培养容器，使消化液充分覆盖细胞表面，将t75细胞培养瓶放平等待2分钟，显微镜下观察细胞，待细胞变圆，细胞培养面呈现毛玻璃状即细胞将要脱落时，弃去消化液，用移液管吸取5ml细胞生长液至t75瓶中同时吹打细胞的整个附着面，使细胞完全脱落并分散，动作轻柔避免产生气泡，将上述5ml细胞悬液全部转至t225细胞培养瓶中，再补加细胞生长液至100ml，轻轻摇晃后放入37℃二氧化碳培养箱中培养72小时；
65、b22、通过倒置显微镜观察，细胞已长成致密单层即铺满整个瓶底，此时弃去培养容器内的旧培养基，加20ml消化液，晃动培养容器，使消化液充分覆盖细胞表面，将t225细胞瓶放平等待2分钟，显微镜下观察细胞，待细胞变圆，细胞培养面呈现毛玻璃状即细胞将要脱落时，弃去消化液，用移液管吸取20ml细胞生长液至t225瓶中同时吹打细胞的整个附着面，使细胞完全脱落并分散，即制成20ml细胞悬液，动作轻柔避免产生气泡，然后将上述20ml细胞悬液均分成5份分别加入5个新的t225细胞瓶中，再在每个t225细胞瓶中补加细胞生长液至100ml，轻轻摇晃后放入37℃二氧化碳培养箱中培养72小时；
66、b3、vero细胞的收获：
67、通过倒置显微镜观察，细胞已长成致密单层即铺满整个瓶底，此时弃去培养容器内的旧培养基，加20ml消化液，晃动培养容器，使消化液充分覆盖细胞表面，将t225细胞瓶放平等待2分钟，显微镜下观察细胞，待细胞变圆，细胞培养面呈现毛玻璃状即细胞将要脱落时，弃去消化液，用移液管分别吸取20ml细胞生长液至每个t225细胞瓶中吹打细胞的整个附着面，使细胞完全脱落并分散，即制成20ml细胞悬液，动作轻柔避免产生气泡，将步骤b22的5个t225瓶中的20ml细胞悬液用移液器全都转移至已提前灭菌的蓝盖瓶中，5个t225瓶共收获100mlvero细胞悬液；
68、b4、收获的vero细胞计数：
69、用移液器吸取200μl的vero细胞悬液至ep管中，通过细胞计数仪进行细胞计数，得到细胞密度为1.44×106个/ml，即100mlvero细胞悬液的细胞总数为1.44×108个；
70、b5、转瓶接种培养vero细胞：
71、选用2l的转瓶，其培养体积为500ml，首先在转瓶中加入250ml细胞生长液，同时加入30ml步骤a5得到的微载体重悬液，将转瓶放置脱色摇床上，100rpm，37℃，0.5h；接种vero细胞终密度为2×105个/ml培养体积，即转瓶中要加入1×108个vero细胞，通过计算在转瓶中加入69.44ml的步骤b3中vero细胞悬液，补加细胞生长液至500ml，后置于脱色摇床上培养，100rpm，37℃，培养48h；
72、c、微载体悬浮培养繁殖轮状病毒：
73、c1、病毒激活处理：取出50ml已室温解冻的病毒液，加入0.375ml的tpck胰酶母液，0.167ml氯化钙母液，使tpck胰酶的终浓度为1.5μg/ml，氯化钙的终浓度为1g/l，之后封口放入37℃恒温水浴锅中激活1h，得到已激活的病毒液；
74、c2、清洗vero细胞：将b5所得的细胞进行清洗，具体步骤如下：用200ml的dpbs溶液清洗细胞，静置使微载体沉降弃去上清，后用200ml的dmem培养基溶液清洗细胞，静置使微载体沉降弃去上清；
75、c3、病毒吸附与培养：加入50ml步骤c1的已激活的病毒液，然后放置脱色摇床上，100rpm，37℃吸附1.5h，吸附完成后补加病毒生长液至500ml，放置脱色摇床上，100rpm，37℃培养72h；
76、c4、轮状病毒液收获：静置使微载体沉降，收集上清液，放-20℃冰箱12小时，再将其放置室温下直至完全溶解，离心8000rpm、25min，收获得到所述轮状病毒液。
77、本发明通过转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，提高了轮状病毒的生产效率和病毒培养的稳定性。通过精心设计的微载体前处理步骤激活、洗涤、灭菌、润洗和重悬，本方法有效地优化了微载体表面，为vero细胞的吸附和生长创造了理想条件，同时模拟细胞外液环境，保证了细胞的健康状态和生长活性。vero细胞的培养过程中，从细胞复苏到传代、收获、计数及转瓶接种培养，每一步骤都保证了细胞的最佳生长条件和高效的病毒复制，特别是在转瓶接种培养步骤中，通过细胞生长液和微载体的共同作用，显著提升了细胞在三维空间中的生长效率和病毒的产量。此外，病毒的激活、吸附和培养过程经过精确设计，确保了高效的病毒感染和复制，而轮状病毒液的收获过程则通过先进的分离和纯化技术，为后续的研究和应用提供了高纯度的病毒样本。整体而言，本发明不仅提升了轮状病毒生产的效率和稳定性，而且通过优化培养条件和操作流程，显著提高了病毒培养的安全性和可靠性。
1.一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述消化液为0.15-0.35wt%胰蛋白酶和0.01-0.03wt% edta-2na的dpbs溶液。
3.如权利要求1所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述细胞生长液包括dmem培养基溶液和新生牛血清，所述dmem培养基溶液和新生牛血清的体积比（7-13）:1。
4.如权利要求1所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述细胞复苏液包括dmem培养基溶液和新生牛血清，所述dmem培养基溶液和新生牛血清的体积比（3-6）:1。
5.如权利要求1所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述tpck胰酶母液为tpck胰酶的dpbs溶液，病毒激活处理时tpck胰酶在病毒液中的终浓度为1-2μg/ml。
6.如权利要求1所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述病毒生长液为含tpck胰酶的dmem培养基溶液，tpck胰酶在病毒生长液中的浓度为0.5-2.0μg/ml。
7.如权利要求2所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述金属离子化合物液为金属离子化合物的水溶液，控制病毒激活处理时所述金属离子化合物在病毒液中的终浓度为0.5-1.5 g/l，所述金属离子化合物为氯化钙、氯化镁、氯化铜中的至少一种。
8.如权利要求7所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述金属离子化合物液为氯化钙和氯化镁的水溶液，其中病毒激活处理时，氯化钙的终浓度为0.25-0.75g/l、氯化镁的终浓度为0.25-0.75g/l。
9.如权利要求7所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，所述金属离子化合物液包含氯化钙、氯化镁、谷胱甘肽和/或海美溴铵，其中病毒激活处理时，控制氯化钙终浓度为0.25-0.75g/l、氯化镁终浓度为0.25-0.75g/l，谷胱甘肽和/或海美溴铵终浓度为0.5mm-1.5mm。
10.如权利要求7所述的一种转瓶用微载体悬浮培养vero细胞接种轮状病毒的方法，其特征在于，包括下述步骤：
