本发明属于医学检测，具体涉及一种检测血流感染病原体的引物和探针、试剂盒及其用途。
背景技术：
1、脓毒症是由感染引起的全身系统性有害宿主反应，可发展为脓毒性休克(严重脓毒症虽经液体复苏仍存在难以逆转的低血压)和多器官功能衰竭(mof)。脓毒症(sepsis)和脓毒性休克(septic shock)是急危重症医学面临的重要临床问题，全球每年脓毒症患病人数超过1900万，其中有600万患者死亡，病死率超过25％。传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、微生物培养、涂片镜检、抗原抗体检测和核酸检测等等，仍然在临床上广泛应用。然而，这些临床实验室检测方法存在诸多的局限性，比如敏感性低、周期长、病原谱窄、易出现假阴性和假阳性，尤其是无法快速检测罕见或新发病原体等，脓毒症感染病原种类繁多、临床表征类似、复杂的细菌获得性耐药机制以及临床实验室微生物检测手段的局限性使得更多的抗感染治疗陷入困境，影响患者预后。
2、市场上针对大部分临床样本常见致病菌的鉴定大都基于细菌培养，利用阳性培养物再进一步通过pcr、质谱等方法进行菌株鉴定，直接鉴定的方法或者试剂盒极为少见。已有的针对临床感染样本直接鉴定的产品，其检测灵敏度均达不到临床级别的要求。因此，开发一种针对临床感染样本，能够快速、准确、灵敏地鉴定致病菌菌株，指导临床进行抗生素治疗，有重大临床意义。
3、数字pcr(digital pcr，dpcr)技术是一种高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行pcr扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。作为一种新兴的多功能工具，dpcr具有高灵敏度、高准确度和高精密度，越来越多地用于临床场景，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。随着平台的完善，目前dpcr技术逐渐在感染性疾病早期诊断、指导抗感染治疗等方面逐渐得到了认可，但基于pcr原理的技术平台依旧无法解决多重靶点非特异性扩增的技术问题，导致单次同时检测靶点依旧限制在10个以内，无法突破多靶点全面监测的临床应用壁垒。
4、基于上述背景，本发明在技术上解决了高通量pcr引物非特异性扩增的问题，设计得到的引物避免非特异性扩增；在数据分析上，通过荧光编码系统实现多阶信号读取，显著提升可检测位点数，实现对18种血流感染致病菌的联检和定量分析，实现对疑似血流感染所致脓毒症患者病原体的早期诊断和抗感染治疗的临床指导。
技术实现思路
1、本发明的一个目的是提供一种用于血流感染病原体检测的引物和探针以及包含所述引物和探针的试剂盒；本发明的另一个目的是提供所述引物和探针在制备用于检测血流感染病原体的产品的应用。本发明提供的技术方案对疑似血流感染所致脓毒症患者病原体早期诊断和抗感染治疗临床指导具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低采取相应的预防和治疗措施。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种病原体和/或检测病原体的物质在制备用于检测血流感染病原体的产品中的应用。
4、所述病原体选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、艰难梭状芽孢杆菌、流感嗜血杆菌、阴沟肠杆菌、近平滑念珠菌中的一种或两种以上的组合。
5、在本发明的优选实施方式中，所述病原体选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、艰难梭状芽孢杆菌、流感嗜血杆菌、阴沟肠杆菌和近平滑念珠菌的组合。
6、所述产品包括但不限于试剂盒、芯片、试纸、膜条或高通量测序平台。
7、本发明所述的检测病原体的物质为检测上述病原体的引物和探针的组合。
8、第二方面，本发明提供一种检测血流感染病原体的引物和探针的组合，其特征在于，由如下引物和探针组成：
9、用于检测金黄色葡萄球菌的seq id no:1～2所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:3所示核苷酸序列的探针；
10、用于检测大肠埃希氏菌的seq id no:4～5所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:6所示核苷酸序列的探针；
11、用于检测铜绿假单胞菌的seq id no:7～8所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:9所示核苷酸序列的探针；
12、用于检测肺炎克雷伯菌的seq id no:10～11所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:12所示核苷酸序列的探针；
13、用于检测肺炎链球菌的seq id no:13～14所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:15所示核苷酸序列的探针；
14、用于检测鲍曼不动杆菌的seq id no:16～17所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:18所示核苷酸序列的探针；
15、用于检测表皮葡萄球菌的seq id no:19～20所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:21所示核苷酸序列的探针；
16、用于检测屎肠球菌的seq id no:22～23所示核苷酸序列的上下游引物和seq idno:24所示核苷酸序列的探针；
17、用于检测嗜麦芽窄食单胞菌的seq id no:25～26所示核苷酸序列的上下游引物和seq id no:27所示核苷酸序列的探针；
18、用于检测流感嗜血杆菌的seq id no:28～29所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:30所示核苷酸序列的探针；
19、用于检测粪肠球菌的seq id no:31～32所示核苷酸序列的上下游引物和seq idno:33所示核苷酸序列的探针；
20、用于检测阴沟肠杆菌的seq id no:34～35所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:36所示核苷酸序列的探针；
21、用于检测粘质沙雷氏菌的seq id no:37～38所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:39所示核苷酸序列的探针；
22、用于检测脑膜炎奈瑟菌的seq id no:40～41所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:42所示核苷酸序列的探针；
23、用于检测白色念珠菌的seq id no:43～44所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:45所示核苷酸序列的探针；
24、用于检测近平滑念珠菌的seq id no:46～47所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:48所示核苷酸序列的探针；
25、用于检测光滑念珠菌的seq id no:49～50所示核苷酸序列的上下游引物和seqid no:51所示核苷酸序列的探针；
26、用于检测艰难棱状芽孢杆菌的seq id no:52～53所示核苷酸序列的上下游引物和seq id no:54所示核苷酸序列的探针；
27、进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
28、所述“信号互不干扰”是指：首先，上述各探针所用的6种荧光基团是不一样，且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、vic、rox、cy7、cy55和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，不同通道的信号不会互相干扰；另外，每一种荧光通道的三个信号可以通过加入不同的探针浓度进行荧光值的区分，从而形成不同的聚类信号，并通过聚类分析软件进行进一步的区分，不会相互干扰。
29、第三方面，本发明提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括本发明第二方面所述的引物和探针的组合。
30、进一步的，所述试剂盒中还包括检测内标的上游引物、下游引物和探针。
31、在本发明的具体实施方案中，所述内标是人源内标基因，包括但不限于rnase p。
32、优选的，所述试剂盒中还包括阴性质控品和阳性质控品。
33、在本发明的具体实施方式中，所述阴性质控品为含有灭活的大肠杆菌菌液；所述阳性质控品为含有目的基因片段的灭活的基因工程菌溶液。
34、优选的，所述试剂盒中还包括pcr预混液，如dntp、pcr缓冲液、mgcl2、dna聚合酶中的至少一种。
35、进一步的，所述试剂盒中还包括本领域常规使用的核酸提取试剂，包括裂解液、蛋白酶k、磁珠悬液、洗涤液、异丙醇、75％乙醇和洗脱液。
36、第四方面，本发明提供一种非疾病诊断目的检测血流感染病原体的方法，包括如下步骤：
37、(1)提取待测样本的核酸；
38、(2)使用本发明第三方面所述的试剂盒对核酸进行数字pcr；
39、(3)获得检测结果并分析。
40、本发明所述的样本包括但不限于血液、血浆、肺泡灌洗液、痰液、尿液、脑脊液、穿刺组织、脓液、伤口分泌物。
41、本发明提供的技术方案具有如下技术优势：
42、高通量pcr技术的一个技术难题是非特异性扩增，非特异性扩增会导致检测准确性下降，且限制扩增靶点数，本发明针对多重信号检测的需求，针对引物设计和扩增体系进行一系列优化实现在单管反应体系中同时实现对18种血流感染相关的病原体的检测和区分，可以全面获得疑似血流感染所致脓毒症感染患者病原体谱的信息特征，判断受试者是否患有、或者判断受试者是否存在患有疑似血流感染所致脓毒症，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，可作为下一代的创新分子诊断技术。
43、本发明通过检测不同病原体的靶点，对不同病原体进行检测和分析，从而能够动态监测患者体内上述病原体的种类或目标核酸片段拷贝数变化，实现对病原体的早期诊断，及时辅助评估治疗效果，为医生临床方案的优化提供参考。
44、本发明通过一项全国多中心诊断试验证明，本发明提供的高通量pcr检测技术具有无培养、dna绝对定量、单管检测广、覆盖多种类型病原体的特点，相较于传统血培养检测病原体的方法，在对疑似血流感染所致脓毒症患者病原体早期诊断方面具有更高的灵敏性和特异性，能够指导抗感染治疗。
45、本发明所述的“疑似血流感染所致脓毒症患者病原体早期诊断”既包括判断受试者是否已经患有疑似血流感染所致脓毒症、也包括判断受试者是否存在患有疑似血流感染所致脓毒症的风险。所述的“指导抗感染治疗”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈，还包括对于疾病治疗效果的评价。
1.病原体和/或检测病原体的物质在制备用于检测血流感染病原体的产品中的应用，所述病原体选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、艰难梭状芽孢杆菌、流感嗜血杆菌、阴沟肠杆菌、近平滑念珠菌中的一种或两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、膜条或高通量测序平台。
3.检测血流感染病原体的引物和探针的组合，其特征在于，由如下引物和探针组成：
4.根据权利要求3所述的引物和探针的组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
5.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求3-4任一所述的引物和探针的组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测内标的上游引物、下游引物和探针，以及阴性质控品和阳性质控品。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括pcr预混液，如dntp、pcr缓冲液、mgcl2、dna聚合酶中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括本领域常规使用的核酸提取试剂，包括裂解液、蛋白酶k、磁珠悬液、洗涤液、异丙醇、75％乙醇和洗脱液。
9.非疾病诊断目的检测血流感染病原体的方法，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样本包括血液、血浆、肺泡灌洗液、痰液、尿液、脑脊液、穿刺组织、脓液或伤口分泌物。
