本发明属于生物，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a的ndm-1耐药基因快速检测方法。
背景技术：
0、技术背景
1、ndm-1酶是由270个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为27.5kd，基因长度约800bp，主要包括肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肝肠菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等。ndm-1通过质粒介导，质粒可在细菌之间传递从而使获得ndm-1质粒的细菌产生多重耐药性。
2、重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,rpa)是一种基于重组酶、聚合酶、单链结合蛋白以及引物对靶标进行扩增的一种高灵敏等温扩增技术。与传统的聚合酶链式反应(pcr)相比，rpa设备简单，在37～42℃就能实现少量样本的快速扩增，与目前研究较多的环介导等温扩增技术(lamp)相比，rpa扩增仅需要两条引物，并且不容易出现非特异性扩增的情况，出现假阳性的概率较小。基于上述优势，rpa扩增逐渐成为近年来现场快检的重要选择。
3、crispr是一种广泛存在于细菌和古菌中的规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)，能够识别并抵御外源性核酸，cas12a蛋白与crrna结合后形成二元复合体，不仅能精准切割靶序列，同时还能激发反式切割，切割游离在环境内的其余底物，基于此原理可设计单链dna探针即信号报告子，激发反式切割的cas12a蛋白切割完信号报告子后释放报告子两端不同的修饰基团，与胶体金法试纸条结合后，当有目标序列存在时，试纸条的检测线会显色，以此达到实时快速检测目标序列的效果。
技术实现思路
1、本发明的目的在于建立一种操作简单、检测速度快，灵敏度高、可即时检测ndm-1耐药基因的方法，将其运用于携带ndm-1耐药基因的细菌检测中。
2、本发明具体技术方案如下：
3、一种ndm-1耐药基因的检测试剂，包括rpa-crispr-cas检测体系，所述crispr-cas检测体系包括：crrna、ndm-1耐药基因的rpa扩增引物、cas12a蛋白和单链dna分子探针，所述单链dna分子探针两端携带信号报告分子。
4、本发明所述检测试剂的检测靶标为ndm-1耐药基因cds区域的保守序列，能检测包括ndm-1在内的60种ndm亚型耐药基因，序列如seq id no：1所示。
5、本发明所述ndm-1耐药基因的rpa扩增引物选自如下引物对中的一种：
6、(1)rpa-f1：seq id no：2，rpa-r1：seq id no：3；
7、(2)rpa-f2：seq id no：4，rpa-r2：seq id no：5；
8、(3)rpa-f3：seq id no：6，rpa-r3：seq id no：7；
9、(4)rpa-f4：seq id no：8，rpa-r4：seq id no：9；
10、(5)rpa-f5：seq id no：10，rpa-r5：seq id no：11。
11、所述cas12a蛋白选自lbacas12a、ascas12a、fncas12a中的一种或几种。优选lbacas12a。
12、本发明所述crrna核苷酸序列如seq id no：12所示。
13、优选的，本发明所述单链dna分子探针核苷酸序列如seq id no：13所示，信号报告分子选自fam和biotin。
14、本发明涉及的所有序列如下：
15、
16、
17、进一步的，所述检测试剂还包括rt-rpa的阳性对照ndm-1扩增引物和阴性对照，阴性对照为除ndm-1之外的金属-β-内酰胺类耐药基因，如dim、slb、vim等。
18、本发明另一目的在于提供一种非诊断治疗目的ndm-1耐药基因的检测方法，采用本发明所述的检测试剂，具体包括以下步骤：
19、(1)样本提取：取待测样本，提取dna；
20、(2)rpa扩增：以ndm-1耐药基因的rpa扩增引物，通过rpa方法扩增步骤(1)提取得到的待测样本dna，得扩增产物；
21、(3)crispr反应检测：取步骤(2)扩增产物，加入信号报告探针、cas12蛋白和crrna，进行crispr反应检测，读取检测信号，即得。
22、优选的，可利用信号报告分子的特异性结合抗体捕获cas12a蛋白切割完单链dna分子探针后释放的信号报告分子。
23、本发明另一目的在于提供一种ndm-1耐药基因的胶体金检测试纸，所述试金标垫上喷涂有单克隆抗体，胶体金标记颗粒大小为20～40nm，所述单克隆抗体为本发明所述的信号报告分子的抗体。
24、一个具体的示例，采用商业质粒dna提取试剂盒提取待检细菌的质粒dna，吸取部分dna模板，加入rpa rehydration buffer、starter、去离子水，在金属浴37～42℃加热扩增，吸取部分扩增产物加入cas12a蛋白、信号报告子、crrna进行crispr反应，将反应产物滴加于胶体金试纸的样品垫上反应10-15min.当有ndm-1耐药基因存在时，试纸条上的检测线(t线)与质控线(c线)显色，若样品中的ndm-1耐药基因过多导致单链信号报告子全部被切割也会出现仅有检测线显色的情况，若无ndm-1耐药基因存在时，质控线显色而检测线不显色。
25、本发明有益效果：
26、1)与耐药基因定量检测金标准rt-pcr法比，本发明提供的rt-rpa法无需复杂仪器与设备即可完成ndm-1耐药基因的快速、高效扩增。
27、2)本发明建立的rt-rpa与胶体金试纸联用检测法检测速度快、特异性强、灵敏度高，可实现ndm-1耐药基因多种亚型、多类菌种的即时、原位检测。
28、3)目前对于耐药基因的关注更多的集中于耐药基因的水平转移与测序鉴别，对于已经明确具有广泛传播风险的ndm-1耐药基因的快检方法开发亟待加强，本发明为ndm-1耐药基因的环境行为及监控提供重要技术支持。
29、4)本发明提供的“dna提取-恒温扩增-快速检测”的提取-检测模式也可适用于其他耐药基因的检测，为耐药基因的监测与防控提供有效解决方案。
1.一种ndm-1耐药基因的检测试剂，其特征在于包括rpa-crispr-cas检测体系，所述crispr-cas检测体系包括：crrna、ndm-1耐药基因的rpa扩增引物、cas12a蛋白和单链dna分子探针，所述单链dna分子探针两端携带信号报告分子。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述检测试剂的检测靶标为ndm-1耐药基因cds区域的保守序列，如seq id no：1所示。
3.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述ndm-1耐药基因的rpa扩增引物选自如下引物对中的一种：
4.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述cas12a蛋白选自lbacas12a、ascas12a、fncas12a中的一种或几种。
5.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述crrna核苷酸序列如seq id no：12所示。
6.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述单链dna分子探针核苷酸序列如seqid no：13所示，信号报告分子选自fam和biotin。
7.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述检测试剂还包括rt-rpa的阳性对照ndm-1扩增引物。
8.一种非检测治疗目的ndm-1耐药基因的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的检测试剂，具体包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于利用信号报告分子的特异性结合抗体捕获cas12a蛋白切割完单链dna分子探针后释放的信号报告分子。
10.一种ndm-1耐药基因的胶体金检测试纸，其特征在于所述试金标垫上喷涂有单克隆抗体，胶体金标记颗粒大小为20～40nm，所述单克隆抗体为权利要求1-7任一项所述的信号报告分子的抗体。
