本发明涉及生物工程，尤其是指一种产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术：
1、2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-fl)是母乳寡糖的重要组成部分，而母乳寡糖占据人体母乳碳水化合物的20％，具有调节婴儿肠道微生物的菌群、刺激免疫系统的成熟及抵御肠道病原微生物的侵袭等方面具有良好的效果。微生物发酵具有环境友好型、生产条件温和等优势，广泛应用于医药、化妆品、食品添加剂等行业。
2、目前，绿色生物制造的一个重要方向是通过合成生物学技术和代谢工程策略来高效合成2’-岩藻糖基乳糖。因此，基于代谢工程和合成生物学方法的微生物制造已成为2’-岩藻糖基乳糖细胞工厂构建的重要手段，其通过对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，显著提升目标产物的合成效率。传统的代谢工程策略主要集中于代谢路径的表达、副产物路径的敲除、基因线路的动态调控方法，这些方法虽然可以显著地提高产物的产量，但易造成代谢途径和代谢网络的失衡，最终引起产物合成效率下降。目前对2’-岩藻糖基乳糖微生物合成的研究缺少酶与底物之间的共定位催化的相关研究。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明在重组大肠杆菌中表达2’-岩藻糖基乳糖补救合成途径相关基因，包括编码gdp-岩藻糖焦磷酸化酶fkp的基因fkp和编码岩藻糖基转移酶futc的基因futc，分别在fkp基因和futc基因上游表达经过促凝标签gcn4修饰的大分子凝聚物蛋白fuslcd，并替换了复制子，实现了对2’-岩藻糖基乳糖补救合成途径的强化。
2、本发明的第一个目的是提供一种产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，将经促凝标签gcn4修饰的大分子凝聚物蛋白fuslcd，分别与在编码gdp-岩藻糖焦磷酸化酶fkp的基因fkp和编码岩藻糖基转移酶futc的基因futc相连得到重组基因，并将重组基因连接到游离表达载体上，转化至宿主中得到重组基因工程菌。
3、进一步地，游离表达载体含有核苷酸序列如seq id no.1-3任一所示的复制子。
4、进一步地，编码fkp基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，编码futc基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码大分子凝聚物蛋白fuslcd的核苷酸序列如seq id no.6所示，编码促凝标签gcn4的核苷酸序列如seq id no.7所示。
5、进一步地，出发菌株敲除lacz和wcaj基因。
6、本发明的第二个目的是提供一种包含上述重组基因工程菌的微生物制剂。
7、本发明的第三个目的是提供一种上述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
8、(1)促凝标签gcn4修饰的大分子凝聚物蛋白fuslcd，分别与在编码gdp-岩藻糖焦磷酸化酶fkp的基因fkp和编码岩藻糖基转移酶futc的基因futc相连得到重组基因；
9、(2)将重组基因连接到游离表达载体上，游离表达载体含有如seq id no.1-3任一所示的复制子，得到重组游离表达载体；
10、(3)将出发菌株的lacz和wcaj基因进行敲除，将重组游离表达载体转化至出发菌株中得到重组大肠杆菌。
11、本发明的第四个目的是提供一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，在发酵体系中加入上述的重组基因工程菌或上述的微生物制剂。
12、进一步地，菌株发酵初始od600为0.04-0.3。
13、进一步地，发酵培养基为dm培养基。
14、进一步地，发酵时间为70-110小时。
15、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
16、本发明以简单的设计方法，通过表达大分子凝聚物蛋白fuslcd以强化李金梅的催化效率，组装2’-岩藻糖基乳糖补救合成途径的相关基因，构建出一株高产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，将丰富和发展调控元件设计与构建的理论和实践，为动态平衡复杂微生物代谢网络提供新思路。将本发明提供的重组菌株应用于发酵生产，2’-岩藻糖基乳糖的产量和生产强度分别达到38.68g/l和0.35g/l/h。具有较好的应用前景，具有工业化应用的潜力。
1.一种产2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是将经促凝标签gcn4修饰的大分子凝聚物蛋白fuslcd，分别与编码gdp-岩藻糖焦磷酸化酶fkp的基因fkp和编码岩藻糖基转移酶futc的基因futc相连得到重组基因，并将重组基因连接到游离表达载体上，转化至出发菌株中得到所述重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述游离表达载体含有核苷酸序列如seq id no.1-3任一所示的复制子。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：编码fkp基因的核苷酸序列如seqid no.4所示，编码futc基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码所述大分子凝聚物蛋白fuslcd的核苷酸序列如seq id no.6所示，编码所述促凝标签gcn4的核苷酸序列如seqid no.7所示。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述出发菌株敲除lacz和wcaj基因。
5.一种包含权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌的微生物制剂。
6.一种权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，在发酵体系中加入权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌或权利要求5所述的微生物制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：菌株发酵初始od600为0.04-0.3。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：发酵培养基为dm培养基。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：发酵时间为70-110小时。
