本发明涉及遗传转化，具体是指一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法。
背景技术：
1、杨树是杨柳科杨属树种的统称，适应能力强且分布较广泛，是重要的工业用材和园林绿化树种。因其具有生长速度快、基因组小等特点而成为林木分子遗传学研究的模式植物。但是基因功能研究目前多以84k杨为主要研究对象，大部分杨树优良品种的遗传转化仍然存在转化效率低、不稳定、转化周期长等问题。欧美杨107杨(populus×euramericanacv.‘neva’)是由中国林业科学研究院于1984年引自意大利的“美洲黑杨×欧洲黑杨”无性系中选育出的优良无性系，具有材性优良、速生优质、适应性强、容易繁殖等优点，是我国用材林和防护林的主要造林树种之一。然而，关于107杨的遗传转化研究进展相对缓慢，遗传转化多以叶片为外植体，转化不稳定，周期较长，成功获得转基因植株的报道也较少。因此，建立以107杨新生嫩茎为外植体的稳定遗传转化体系，对杨树基因功能研究及优良新品种创制具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的欧美杨107杨遗传转化不稳定的问题，本发明所要解决的技术问题在于提高107杨的遗传转化稳定性。本发明提供了一种以欧美杨107杨新生嫩茎为外植体的新的遗传转化方法，具有较高的遗传转化稳定性，为杨树基因功能研究及新品种创制提供技术支持。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
3、一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，包括以下步骤：
4、(1)外植体消毒，取欧美杨107杨当年新生嫩茎为初始外植体材料，去掉顶端过于幼嫩的茎段和末端木质化严重的茎段，将中间部位的茎段截成小段，用75％酒精溶液清洗外植体表面灰尘和杂质，再用超净水冲洗；
5、将处理好的茎段放入无菌操作台中，先用无菌水冲洗，然后用75％的酒精溶液消杀，之后立即用无菌水冲洗外植体，并重复此过程；
6、再将外植体放入20％的次氯酸钠溶液中消毒，之后立即倒掉次氯酸钠溶液，将外植体用无菌水冲洗，将消杀完成的外植体用无菌纸吸干水分，用手术刀截掉茎段两端接触消毒液的部分，然后接入分化培养基中进行培养；
7、(2)外植体消毒后进行观察，挑选状态良好且无污染的茎段去掉两端，剔除腋芽，将茎段切成小段，接入分化培养基中预培养；
8、(3)重悬液制备，将已经鉴定的含有目的基因载体的农杆菌菌液接种到含有相应筛选抗生素、利福平的液体lb培养基中，进行振荡培养，合格后，将摇好的菌液放入离心管中进行离心，在离心完成后倒掉上清液，加入侵染液重悬，加入as，制备成侵染液用于侵染；
9、(4)将预培养后的无菌茎段浸入预先配置好的侵染液中浸泡15min，在浸染过程中不断轻微摇晃菌液；
10、(5)将侵染后的茎段取出用滤纸吸干菌液，平铺在共培养培养基上，黑暗环境下放置3天，直至茎段边缘出现小范围菌斑；
11、(6)分化筛选培养，将共培养完成后将茎段转移到添加有筛选抗生素和抑菌剂特美汀的分化筛选培养基中进行分化培养，观察一周后将无污染的外植体转移到组培瓶中继续分化培养，直至长出抗性芽，期间两周更换一次筛选培养基；
12、(7)抽茎筛选培养，待茎段长出大量不定芽时，将整株分化苗移至添加有筛选抗生素和抑菌剂特美汀的抽茎筛选培养基中进行抽茎培养；两周更换一次筛选培养基；3～4周抽茎；
13、(8)生根筛选培养，将抽茎的小苗剪下，接种于添加有筛选抗生素和抑菌剂特美汀的生根筛选培养基中，等待其生根，做生根筛选的同时以ck做生根对照；
14、(9)根据目的基因序列设计引物，选取生根良好的植株提取dna进行pcr检测；
15、(10)转化效率统计分析每个茎段外植体分化出的小苗按一个株系计算，抗性苗的株系数与预培养的外植体数量之比为转化效率。
16、进一步的，所述步骤(1)中，所述截成小段的长度为3～5cm；所述超净水冲洗次数为3次；所述无菌水冲洗次数为1次；所述酒精溶液消杀时间为30s；所述无菌水冲洗外植体的时间为30s，并重复2次；所述次氯酸钠溶液中消毒时间为8～10min；所述倒掉次氯酸钠溶液后用无菌水冲洗外植体4次，时间为1min；所述手术刀截掉茎段两端接触消毒液的部分的长度为0.5cm。
17、进一步的，在步骤(2)中，所述消毒后观察的时间为5～7天；所述状态良好且部无污染的茎段挑选标准为不长菌、不发蔫、不发黑；所述小段的长度为0.5～1cm；所述分化培养基中预培养的时间为1天。
18、进一步的，在步骤(3)中，所述农杆菌菌液的含量为100μl；所述抗生素选取卡那霉素、潮霉素中的一种或多种，所述利福平的浓度选取为25mg/l；所述培养基的含量为40ml；所述震荡培养的参数为温度28℃，转速160rpm；所述震荡培养的合格条件为od600为0.4～0.6、菌液呈淡黄色；所述离心步骤的参数为转速4500rpm、时间10min；所述侵染液的质量为100ml，所述as的质量为100μl。
19、进一步的，在步骤(6)中，所述分化筛选培养基中筛选抗生素和抑菌剂特美汀的含量为400mg/l。
20、进一步的，在步骤(7)中所述抽茎筛选培养基中筛选抗生素和抑菌剂特美汀的含量为400mg/l。
21、进一步的，在步骤(8)中所述生根筛选培养基中筛选抗生素和抑菌剂特美汀的含量为400mg/l；所述抽茎的小苗长度为2～3cm，所述转化成功的植株生根的时间为5～9天。
22、相较于现有技术，本发明的优势在于：本发明通过以欧美杨107杨新生嫩茎为外植体进行农杆菌侵染，通过分别转化三种类型的过表达载体，结合pcr检测证明均获得了转基因株系，转化效率分别为16.7％、10％和6.7％，而与组培苗叶片转化方法相比，本发明遗传转化更加稳定，并且前期无需连续组培，直接以新生嫩茎为外植体，极大的克服了现有技术的不足，为107杨新品种的创制及重要性状基因的功能验证提供了重要工具，在杨树分子育种中具有重要的应用价值；
1.一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述截成小段的长度为3～5cm；所述超净水冲洗次数为3次；所述无菌水冲洗次数为1次；所述酒精溶液消杀时间为30s；所述无菌水冲洗外植体的时间为30s，并重复2次；所述次氯酸钠溶液中消毒时间为8～10min；所述倒掉次氯酸钠溶液后用无菌水冲洗外植体4次，时间为1min；所述手术刀截掉茎段两端接触消毒液的部分的长度为0.5cm。
3.根据权利要求1所述的一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述消毒后观察的时间为5～7天；所述状态良好且部无污染的茎段挑选标准为不长菌、不发蔫、不发黑；所述小段的长度为0.5～1cm；所述分化培养基中预培养的时间为1天。
4.根据权利要求1所述的一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述农杆菌菌液的含量为100μl；所述抗生素选取卡那霉素、潮霉素中的一种或多种，所述利福平的浓度选取为25mg/l；所述培养基的含量为40ml；所述震荡培养的参数为温度28℃，转速160rpm；所述震荡培养的合格条件为od600为0.4～0.6、菌液呈淡黄色；所述离心步骤的参数为转速4500rpm、时间10min；所述侵染液的质量为100ml，所述as的质量为100μl。
5.根据权利要求1所述的一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述分化筛选培养基中筛选抗生素和抑菌剂特美汀的含量为400mg/l。
6.根据权利要求1所述的一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于：在步骤(7)中所述抽茎筛选培养基中筛选抗生素和抑菌剂特美汀的含量为400mg/l。
7.根据权利要求1所述的一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于：在步骤(8)中所述生根筛选培养基中筛选抗生素和抑菌剂特美汀的含量为400mg/l；所述抽茎的小苗长度为2～3cm，所述转化成功的植株生根的时间为5～9天。
