本发明涉及一种超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒及其制备方法与应用，属于生物医药。
背景技术：
1、血栓形成会导致许多危及生命的心血管疾病，如心肌梗死、缺血性中风和肺栓塞等。目前，血栓形成后的主要治疗策略是给予患者rt-pa进行药物溶栓。然而，由于rt-pa循环半衰期短(仅几分钟)、治疗时间窗窄(症状出现后4.5小时内)、靶向能力低(药物到达病变部位的比例<5％)和血栓穿透率低，它所带来的治疗收益也是有限的。同时，使用高剂量的rt-pa来实现提高溶栓效率会增加出血的风险。
2、随着纳米技术的发展，近些年来纳米材料溶栓的例子越来越多，目前有些纳米制剂使用crgd、creka等外源性短肽分子修饰纳米提送系统，提高其对于血栓的靶向性，但这些外源性的短肽分子靶向效率并不高，且有可能激活免疫系统，临床效果并不理想，而血小板膜作为一种天然的、更为高效和安全的生物膜为纳米颗粒给药系统提供了潜在的靶点。
3、超声溶栓，即使用辅助性的连续超声来增强血栓溶解，是一种新型的非侵入性物理溶栓的方法，可提高血再通率。高功率的低频超声可以产生空化作用，辅助流体运动，加速血栓溶。微泡是用于超声检查的对比剂，可以作为空化核，在注入微泡使用超声辅助溶栓，会引起微泡在血液中的非线性振荡及能量的连续吸收，产生爆破作用，释放吸收的能量。因此，超声介导的微泡空化可能进一步加速其溶栓效果。超声溶栓的概念提出后为溶栓治疗提供了新的思路，但仅使用微泡溶栓再通率较低，可能耽误患者的治疗时间，目前尚未有搭载rt-pa的纳米级造影剂。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒及其制备方法与应用。本发明通过合成一种新型的血小板膜仿生纳米粒子，通过共挤出的方式将血小板膜与脂质体杂化，使其具有对血栓的天然的靶向性，并将rt-pa通过化学修饰连于杂化膜表面，同时在其内装载超声响应性材料pfp，集超声溶栓与药物溶栓为一体，双管齐下，能够高效快速地提高血管再通率，探究新的生物纳米技术在缺血性脑卒中中的临床转化与应用。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，包括血小板膜与脂质体杂化的杂化脂质体，以及搭载于杂化脂质体表面的重组组织型纤溶酶原激活酶(rt-pa)和装载于杂化脂质体内的全氟戊烷(pfp)。
4、上述超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒的制备方法，包括步骤如下：
5、(1)将2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰基sn-甘油-3-磷酸乙酰胺-n-[生物素(聚乙二醇)2000](dspe-peg 2000)、1,2-二棕榈酰基sn-甘醇-3-磷酸(dppa)和1,2-双硬脂酰基sn-g甘油-3-磷酸乙醇酰胺-n-]生物素(乙二醇)2000/cooh(dspe-peg2000-cooh)溶于氯仿中，然后在60～70℃下蒸发15～25min，得到薄脂质膜；然后将薄脂质膜用双蒸水重悬，超声混匀15～25min后，通过挤出法制备得到脂质体；
6、(2)将脂质体和血小板膜溶于的双蒸水中，混合均匀后超声处理25～35s，然后通过挤出法制备得到血小板膜与脂质体杂化的杂化脂质体(platelet-liposome，plipo)；向plipo中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)和n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，在室温下反应10～20min，灭活后，继续加入重组组织型纤溶酶原激活酶(rt-pa)，在室温下反应1～3h，将溶液盐析后，得到载有rt-pa的杂化脂质体；最后将载有rt-pa的杂化脂质体与全氟戊烷(pfp)混合，经超声处理，得到超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒(plpa@pfp)。
7、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰基sn-甘油-3-磷酸乙酰胺-n-[生物素(聚乙二醇)2000](dspe-peg 2000)、1,2-二棕榈酰基sn-甘醇-3-磷酸(dppa)和1,2-双硬脂酰基sn-g甘油-3-磷酸乙醇酰胺-n-]生物素(乙二醇)2000/cooh(dspe-peg2000-cooh)的质量比为(15～20)：(3～4)：(0.8～1.2)：(0.4～0.6)。
8、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)和氯仿的质量体积比为(3～4)：1，单位：mg/ml。
9、根据本发明优选的，步骤(1)中，所述挤出法具体为：将超声处理后的薄脂质膜依次通过0.4μm和0.2μm聚碳酸酯膜，得到直径小于200nm的脂质体。
10、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述脂质体和血小板膜的质量比为(40～60)：1；所述脂质体和和双蒸水的质量体积比为(1～2)：1，单位：mg/ml。
11、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述血小板膜按照如下方法制备得到：
12、用0.2μm毛细管从c57bl/6j小鼠的眶静脉获得全血，并用浓度为5×10-3m的乙二胺四乙酸(edta)进行抗凝；然后将血液在室温下以100g离心20min，获得上层富含血小板的血浆，将其收集并转移到另一试管中；在收集的血浆中加入浓度为1×10-6m的前列腺素e1，以850g离心20min；去除上清液后，将血小板重悬于含有浓度为1×10-3m的乙二胺四乙酸(edta)和浓度为1×10-3m的蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲液(pbs)中；随后使用液氮对悬浮液进行快速冷冻，然后解冻至室温，重复三次，并用超声仪破碎仪在功率70w，20khz下超声处理45s，以4000g离心5分钟得到血小板膜，并用含有1×10-3m的蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲液(pbs)洗涤三次，得到血小板膜。
13、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述挤出法具体为：将混合的血小板膜与脂质体通过200nm聚碳酸酯膜，得到直径小于200nm的plipo。
14、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述edc和sulfo-nhs添加后的终浓度分别为2×10-3m和5×10-3m。
15、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述rt-pa与脂质体的质量比为1：(1～2)。
16、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述pfp和脂质体的体积质量比为50：(1～2)，单位：μl/mg。
17、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述超声处理在超声破碎仪中进行，具体参数为：于70w，20khz的功率下超声处理30s。
18、上述超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒在制备治疗血栓药物中的应用。
19、本发明的有益效果在于：
20、1、本发明提供的血小板膜仿生纳米颗粒是将脂质体与血小板膜杂化，形成杂化脂质体，利用血小板膜上的各种受体蛋白，使得该仿生纳米颗粒对血栓具有极强的靶向性。
21、2、本发明提供的血小板膜仿生纳米颗粒将rt-pa通过化学修饰与脂质体中的dspe-peg2000-cooh连接，搭载在杂化脂质体表面。同时在仿生纳米颗粒内装载具有超声响应性的pfp，在超声的作用下pfp产生空化作用，从而在血栓表面产生爆破力，使得纳米粒子的穿透性更强。即本发明提供的仿生纳米颗粒集超声溶栓与药物溶栓为一体，两种作用双管齐下，能够快速溶解血栓，提高血管再通率。
22、3、本发明提供的血小板膜仿生纳米颗粒安全无毒，生物相容性高，合成方式简单便利，有利于临床转化。并且在未注射入动物体内时仍属于液态的纳米粒子，形态更加稳定，更容易储存。
23、4、本发明提供的血小板膜仿生纳米颗粒的制备方法具有操作方便，可行性高，便于工业化生产的优点。
1.一种超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，包括血小板膜与脂质体杂化的杂化脂质体，以及搭载于杂化脂质体表面的重组组织型纤溶酶原激活酶(rt-pa)和装载于杂化脂质体内的全氟戊烷(pfp)。
2.权利要求1所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
3.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(1)中，所述2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰基sn-甘油-3-磷酸乙酰胺-n-[生物素(聚乙二醇)2000](dspe-peg 2000)、1,2-二棕榈酰基sn-甘醇-3-磷酸(dppa)和1,2-双硬脂酰基sn-g甘油-3-磷酸乙醇酰胺-n-]生物素(乙二醇)2000/cooh(dspe-peg2000-cooh)的质量比为(15～20)：(3～4)：(0.8～1.2)：(0.4～0.6)。
4.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(1)中，所述2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)和氯仿的质量体积比为(3～4)：1，单位：mg/ml；所述挤出法具体为：将超声处理后的薄脂质膜依次通过0.4μm和0.2μm聚碳酸酯膜，得到直径小于200nm的脂质体。
5.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(2)中，所述脂质体和血小板膜的质量比为(40～60)：1；所述脂质体和和双蒸水的质量体积比为(1～2)：1，单位：mg/ml。
6.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(2)中，所述血小板膜按照如下方法制备得到：
7.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(2)中，所述挤出法具体为：将混合的血小板膜与脂质体通过200nm聚碳酸酯膜，得到直径小于200nm的plipo；所述edc和sulfo-nhs添加后的终浓度分别为2×10-3m和5×10-3m。
8.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(2)中，所述rt-pa与脂质体的质量比为1：(1～2)。
9.如权利要求2所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒，其特征在于，步骤(2)中，所述pfp和脂质体的体积质量比为50：(1～2)，单位：μl/mg；所述超声处理在超声破碎仪中进行，具体参数为：于70w、20khz的功率下超声处理30s。
10.权利要求1所述的超声响应性的血小板膜仿生纳米颗粒在制备治疗血栓药物中的应用。
