本发明属于分子生物学，具体涉及一种混合酶随机引物标记方法。
背景技术：
1、目前主要的荧光标记方法依然是切口平移法，随机引物法：
2、切口平移法对dna探针标记，以限量的dnaseⅰ在双链dna的两条链上随机产生多个缺口，再借助dna聚合酶ⅰ的活性在断裂处5’末端切除一个碱基同时在3’末端添加一个碱基，以修补缺口，随着反应连续不断的进行，标记-dntp即掺入到新合成的dna双链中。
3、随机引物法是以dna为模板，在反应中加入随机引物，在该反应中这些引物按照碱基互补配对的原则与模板dna的双链结合，klenow片段在这个过程中从引物的3'-oh末端开始合成互补的dna链，在反应中加入标记-dntp即可获得标记的dna探针。
4、切口平移法和随机引物法，每种方法都各有其优缺点：
5、切口平移法发展最早，最为成熟，标记产物序列短，一般无需片段化，且可直接标记长模板，但标记时间长、得率低、模板dna添加量高。
6、随机引物法模板dna添加量低，但操作复杂、标记大片段时需要片段化及纯化、标记后的探针序列过长也需片段化及纯化；
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的至少一种，本发明提供了一种混合酶随机引物标记方法。该方法可直接标记长模板dna，标记产物序列较短，模板dna添加量少，标记时间相对较短，并且过程中无需片段化及纯化。
2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：
3、本发明提供了一种混合酶随机引物标记方法，方法是采用模板dna，随机引物，含有标记的dntp混合液，dnaseⅰ，dna聚合酶ⅰ以及缓冲液配制随机引物标记体系，置于pcr仪上进行反应即可。
4、在本发明的一些实施方案中，所述随机引物为六至十核苷酸随机引物。
5、在本发明的一些实施方案中，所述反应条件为：37℃4小时，75℃10分钟，4℃保持。
6、在本发明的一些实施方案中，所述随机引物标记体系为：100μm的随机引物15μl，模板dna 25ng，dna聚合酶ⅰ和dnaseⅰ混合物0.3μl，缓冲液2.5μl，含有标记的dntp混合液中datp、dctp、dgtp、dttp或(dttp+dutp)各1μl，用双蒸水补足体积至25μl。
7、随机引物标记体系的体积可以为25μl-50μl，不同总体积的体系中，各物质的比例相同。
8、在本发明的另一些具体实施方案中，所述随机引物标记体系为：100μm的随机引物30μl，模板dna 50ng，dna聚合酶ⅰ和dnaseⅰ混合物0.6μl，缓冲液5μl，含有标记的dntp混合液中datp、dctp、dgtp、dttp或(dttp+dutp)的用量比为1：1：1：1，各2μl，用双蒸水补足体积至50μl。
9、其中，dnaseⅰ为脱氧核糖核酸酶ⅰ，是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。dnaseⅰ对模板dna产生缺口，使其片段化，因而超长片段模板也可直接配制体系进行标记；同时dnaseⅰ还可对延伸标记的新链进行切口片段化，使其达到合适的长度范围而无需进一步超声或酶切。
10、dna聚合酶ⅰ是一种重要的分子马达，它可以沿着dna模板链行走，吸收脱氧核糖核苷酸，合成并延长新的dna子链。dna聚合酶ⅰ在dna的复制和修复中发挥着重要的作用，其在随机引物和荧光素标记dntp存在下，可延伸标记合成子链；也可对新链和模板链的缺口进行修复，引入荧光标记。
11、在本发明的一些实施方案中，所述含有标记的dntp混合液为含标记的dutp与未标记的dntp的混合物。
12、进一步地，当dntp混合液为含标记的dutp时，dttp与dutp质量比为1：4。
13、在本发明的另一些实施方案中，所述含有标记的dntp混合液为标记datp、dctp、dgtp中任一种及其他相应未标记的dntp的混合物。
14、在本发明的一些实施方案中，所述模板dna为＞20kb的长片段。
15、在本发明的一些实施方案中，所述缓冲液为10×buffer或ph 7.4 4mm tris缓冲液。
16、在本发明的一些实施方案中，所述标记为荧光素，在本发明的另一些实施方案中，可选用地高辛、罗丹明中的一种进行标记。
17、本发明的有益效果
18、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种混合酶随机引物标记体系中，dnaseⅰ对模板dna产生缺口，使其片段化，在随机引物和荧光素标记dntp存在下，dna聚合酶ⅰ可延伸标记合成子链，也可对新链和模板链的缺口进行修复，引入荧光标记。
19、因此本发明的混合酶随机引物标记法可以直接标记长模板dna，标记前长模板dna无需片段化及纯化；标记产物序列较短，无需片段化及纯化；模板dna添加量少，节约模板dna；标记时间相对较短，节约实验时间。
1.一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于，方法是采用模板dna，随机引物，含有标记的dntp混合液，dnaseⅰ，dna聚合酶ⅰ以及缓冲液配制随机引物标记体系，置于pcr仪上进行反应即可。
2.根据权利要求1所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述随机引物为六至十核苷酸随机引物。
3.根据权利要求1所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述反应条件为：37℃4小时，75℃10分钟，4℃保持。
4.根据权利要求1所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述随机引物标记体系为：100μm的随机引物15μl-30μl，模板dna 25ng-50ng，dna聚合酶ⅰ和dnaseⅰ混合物0.3μl-0.6μl，缓冲液2.5μl-5μl，含有标记的dntp混合液中datp、dctp、dgtp、dttp或(dttp+dutp)的用量比为1：1：1：1，各1μl-2μl，用双蒸水补足体积至25μl-50μl。
5.根据权利要求4所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述含有标记的dntp混合液为含标记的dutp与未标记的dntp的混合物。
6.根据权利要求5所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：当dntp混合液为含标记的dutp时，dttp与dutp质量比为1：4。
7.根据权利要求4所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述含有标记的dntp混合液为标记datp、dctp、dgtp中任一种及其他相应未标记的dntp的混合物。
8.根据权利要求1所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述模板dna为＞20kb的长片段。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述缓冲液为10×buffer或ph 7.4 4mm tris缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种混合酶随机引物标记方法，其特征在于：所述标记为荧光素、地高辛、罗丹明中的一种。
