本发明属于生物医用材料，具体涉及一种用加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料及其制备方法与应用。
背景技术：
1、糖尿病是一种全球患病率不断上升、发病年龄不断年轻化的慢性疾病，对人类健康有重大影响。高血糖负荷导致糖尿病患者血管和神经功能严重受损。一旦化学或物理损伤形成伤口，糖尿病患者面临感染、伤口延迟甚至不愈合，最终截肢的风险显著增加。研究表明，糖尿病创面炎症主要是由活性氧（ros）过量、促炎趋化因子上调、一氧化氮（no）合成受损引起的。具有高保水性和类似于细胞外基质的三维多孔结构的水凝胶作为糖尿病伤口治疗平台具有显著的潜力。特别是，天然生物质水凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性，使其广泛应用于临床实践，作为敷料和支架。
2、透明质酸（ha）由重复双糖β-1,4- d-葡萄糖醛酸-β-1,3- n -乙酰- d-葡萄糖胺的交替单元组成，广泛分布于全身，是ecm的重要组成部分。丰富的羟基和羧基的存在使其易于与其他物质发生化学反应，从而形成多功能水凝胶，用于广泛的生物医学应用。尽管越来越多的透明质酸水凝胶敷料被开发出来，但能够有效抑制炎症过程和促进新生血管形成的理想产品仍然没有实现。
3、异质黑色素来源于无氮前体1,8-萘酚，具有良好的生物相容性和优异的抗氧化活性。此外，它还具有光热抗菌治疗（ptat）能力，在清除过量ros、清除生物膜、减轻炎症和加速伤口愈合方面有广泛的应用。然而，早期研究表明，使用异质黑色素作为ptat试剂实现光热灭菌需要较高的局部温度，这可能对周围健康组织造成不必要的损伤。结合其他治疗方法，在温和的温度下达到温和的ptat是至关重要的。
4、no作为一种能诱导微生物蛋白、dan、代谢酶和细胞膜发生不可逆亚硝化和氧化损伤的强效剂，具有广谱抗菌活性，已被广泛应用于抗菌治疗中。特别是，光热诱导的no释放为气体疗法固有的缺点（如储存和释放时间短，释放模式的时空不可控）提供了有希望的解决方案，并与光热协同实现轻度ptat(<50°c)。然而，糖尿病创面内源性no的产生严重受阻，导致血管生成不足，无法为创面愈合过程提供足够的氧气和营养。
技术实现思路
1、鉴于上述技术问题，本发明致力于提供一种加速糖尿病愈合的水凝胶敷料，该水凝胶以改性的透明质酸为基材，将具有光热性能，抗氧化性能和no释放性能的amnp-bnn6搭载其中，使水凝胶表现出优异的ros清除能力，并在近红外（nir)）照射下按需释放no，实现温和的ptat，在糖尿病伤口治疗的应用中，显示出显著降低氧化应激水平，有效控制感染，促进血管生成，加速伤口愈合。
2、为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种加速糖尿病愈合的水凝胶敷料，该水凝胶敷料是以ha-adh-ta和oha为水凝胶基质，将负载bnn6的amnp纳米颗粒加入其中所得。其中，ha-adh-ta为透明质酸（ha）与己二酸二酰肼（adh）反应后，通过自由基接枝方法与单宁酸（ta）反应得到的产物，oha为透明质酸氧化后的产物。bnn6为no供体n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4-苯二胺。amnp为1，8-萘酚氧化得到的人工异质黑色素纳米颗粒。
4、进一步，其制备过程包括以下步骤：
5、s1、人工异质黑色素纳米颗粒的制备：通过氧化1，8-萘酚合成人工异质黑色素纳米颗粒（amnp）；
6、s2、 n，n'-二仲丁基- n，n'-二亚硝基- 1，4-苯二胺（bnn6）的合成：将 n，n'-二仲丁基-1，4-苯二胺加入无水乙醇中，在n2保护下依次加入亚硝酸钾溶液、盐酸溶液，避光反应，反应结束后，离心洗涤，然后在黑暗中冷冻干燥，得到产物bnn6；
7、s3、amnp-bnn6纳米颗粒的合成：将amnp纳米颗粒悬浮于去离子水中，然后加入bnn6-乙醇溶液，在暗处搅拌，离心收集amnp-bnn6纳米颗粒；
8、s4、ha-adh的合成：将ha溶于去离子水中，并依次加入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc·hcl），羟基琥珀酰亚胺（nhs）和adh反应，并用hcl溶液调节溶液ph，反应结束后，用去离子水透析，然后冷冻干燥得到ha-adh；
9、s5、ha-adh-ta的合成：将ha-adh溶于去离子水中，并依次加入双氧水、抗坏血酸和ta，反应结束后，用去离子水透析，然后冷冻干燥得到ha-adh-ta；
10、s6、oha的合成，通过高碘酸钠氧化法合成oha；
11、s7、将amnp-bnn6纳米颗粒加入oha溶液中，然后与ha-adh-ta溶液混合得到生物适应性的ha-adh-ta/oha/amnp-bnn6水凝胶；
12、作为本发明进一步的方案，步骤s1中amnp纳米颗粒的具体制备步骤包括：在带有磁力搅拌子的三口烧瓶中分别加入0.1 ~ 1 g的1，8-萘酚，5 ~ 25 ml乙腈和100 ~ 300 ml的去离子水并在室温下搅拌10 ~ 60分钟；然后加入1 mol/l的高碘酸钠溶液1 ~ 5 ml，在室温下反应15 ~ 30小时；反应结束后，用水离心洗涤1 ~ 9次，得到产物amnp纳米颗粒。
13、作为本发明进一步的方案，步骤s2中bnn6的具体制备步骤包括：将2 ~ 10 g的 n， n'-二仲丁基-1，4-苯二胺和10 ~ 80 ml无水乙醇依次加入250 ml带转子的三颈烧瓶中，在n2保护下加入6 mol/l的亚硝酸钾溶液20 ~ 100 ml；然后在三颈烧瓶中加入10 ~ 80 ml的6 m盐酸溶液，搅拌10 ~ 120分钟，反应在室温下进行2 ~ 8小时；离心得到沉淀，并用乙醇和水溶液洗涤1 ~ 9次；然后在黑暗中冷冻干燥，得到产物bnn6。
14、作为本发明进一步的方案，步骤s3中amnp-bnn6的具体制备步骤包括：将s1制备的amnp纳米颗粒（2 ~ 50 mg）悬浮于2 ~ 100 ml去离子水中，然后在上述溶液中加入浓度为0.2 ~ 4 mg/ml的bnn6-乙醇溶液，在暗处搅拌12 ~ 48小时；离心收集纳米颗粒，用去离子水洗涤1 ~ 9次。
15、作为本发明进一步的方案，步骤s4中ha-adh的具体制备步骤包括：将0.5 ~ 2 g的ha溶于去50 ~ 200 ml去离子水中，并依次加入2 ~ 8 g的edc·hcl，0.6 ~ 2.4 g的nhs和7 ~ 28 g的adh反应；并用0.1 mol/l的hcl溶液调节溶液ph到6，反应12 ~ 48 小时；反应结束后，用去离子水透析2天，然后冷冻干燥3天得到ha-adh；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500 da。
16、作为本发明进一步的方案，步骤s5中ha-adh-ta的具体制备步骤包括：将0.5 ~ 2g ha-adh加入50 ~ 200 ml去离子水中，并依次加入1 mol/l的双氧水1 ~ 4 ml、0.05 ~0.2 g的抗坏血酸和0.5 ~ 4 g的ta，在室温下反应12 ~ 48 小时；反应结束后，用去离子水透析2天，然后冷冻干燥3天得到ha-adh-ta，并存储在-20℃的冰箱中；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为8000 ~ 10000 da。
17、作为进一步的方案，步骤s6中oha的具体制备步骤包括：将0.5 ~ 2 g 的ha溶于去50 ~ 200 ml去离子水中；然后加入 0.2 ~ 2 g的高碘酸钠，在室温黑暗条件下搅拌1 ~ 16小时，然后加入1 ~ 2 ml的乙二醇继续搅拌1小时以停止反应；反应结束后，用去离子水透析2天，然后冷冻干燥3天得到oha；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500 da。
18、作为进一步的方案，步骤s7中用于加速糖尿病伤口愈合的、水凝胶的具体制备步骤包括：将amnp-bnn6加入2 ~ 6 wt%的oha溶液中，并将上述溶液与2 ~ 6 wt%的ha-adh-ta溶液等体积混合，制得ha-adh-ta/oha/amnp-bnn6水凝胶。
19、作为进一步的方案，amnp-bnn6在水凝胶中的最终浓度为0.1 ~ 0.5 mg/ml。
20、本发明还公开了采用上述方法制得一种加速糖尿病创面愈合的水凝胶，并且公开了其作为伤口敷料的应用。
21、与现有技术相比，本发明具有以下的有益技术效果：
22、本发明的有益效果是：
23、（1）本发明中的水凝胶敷料具有良好的可注射性能和优异的自愈合性能，，对各种形状的伤口有较好的适应性，且能有效避免使用过程中材料破损带来的感染问题，延长材料使用寿命。
24、（2）本发明中的水凝胶敷料具有温和的光热杀菌性能，在较低的温度（45℃）与no气体协同作用，实现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌大肠杆菌（ e.coli）和金黄色葡萄球菌（ s. aureus）的温和消融，有效管理伤口感染。
25、（3）本发明中的水凝胶敷料具有良好的抗氧化性能，有效清除体内产生多余的ros。
26、（4）本发明中的水凝胶敷料具有良好的生物相容性，是一种理想的生物材料。
27、（5）本发明的水凝胶在光热条件下释放的no气体能够有效促进血管生成。
28、（6）本发明的水凝胶敷料在糖尿病创面的修复中能够有效管理创面感染，降低体内ros水平，加速血管生成，胶原沉积，在上皮化，实现伤口的快速愈合。
29、实验结果证明：本发明的水凝胶敷料，能够有效管理创面感染，降低氧化应激水平，改善炎症环境，加速血管生成，对糖尿病创面管理有积极有效的作用，为临床糖尿病伤口治疗提供了新的选择。
1.一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料，其特征在于，该水凝胶敷料是以ha-adh-ta和oha为水凝胶基质，将负载bnn6的amnp纳米颗粒加入其中所得；其中，ha-adh-ta为透明质酸（ha）与己二酸二酰肼（adh）反应后，通过自由基接枝方法与单宁酸（ta）反应得到的产物，oha为透明质酸氧化后的产物；bnn6为no供体n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4-苯二胺；amnp为1，8-萘酚氧化得到的人工异质黑色素纳米颗粒。
2.根据权利要求1 所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s1中amnp纳米颗粒的具体制备步骤包括：在带有磁力搅拌子的三口烧瓶中分别加入0.1 ~ 1 g的1，8-萘酚，5 ~ 25 ml乙腈和100 ~ 300 ml的去离子水并在室温下搅拌10 ~60分钟；然后加入1 mol/l的高碘酸钠溶液1 ~ 5 ml，在室温下反应15 ~ 30小时；反应结束后，用水离心洗涤1 ~ 9次，得到产物amnp纳米颗粒。
4.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s2中bnn6的具体制备步骤包括：将2 ~ 10 g的n，n'-二仲丁基-1，4-苯二胺和10 ~ 80ml无水乙醇依次加入250 ml带转子的三颈烧瓶中，在n2保护下加入6 mol/l的亚硝酸钾溶液20 ~ 100 ml；然后在三颈烧瓶中加入10 ~ 80 ml的6 m盐酸溶液，搅拌10 ~ 120分钟，反应在室温下进行2 ~ 8小时；离心得到沉淀，并用乙醇和水溶液洗涤1 ~ 9次；然后在黑暗中冷冻干燥，得到产物bnn6。
5.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s3中amnp-bnn6的具体制备步骤包括： 将s1制备的amnp纳米颗粒（2 ~ 50 mg）悬浮于2~ 100 ml去离子水中，然后在上述溶液中加入浓度为0.2 ~ 4 mg/ml的bnn6-乙醇溶液，在暗处搅拌12 ~ 48小时；离心收集纳米颗粒，用去离子水洗涤1 ~ 9次。
6.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s4中ha-adh的具体制备步骤包括：将0.5 ~ 2 g 的ha溶于去50 ~ 200 ml去离子水中，并依次加入2 ~ 8 g的edc·hcl，0.6 ~ 2.4 g的nhs和7 ~ 28 g的adh反应；并用0.1 mol/l的hcl溶液调节溶液ph到6，反应12 ~ 48 小时；反应结束后，用去离子水透析2天，然后冷冻干燥3天得到ha-adh；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500 da。
7.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s5中ha-adh-ta的具体制备步骤包括：将0.5 ~ 2 g ha-adh加入50 ~ 200 ml去离子水中，并依次加入1 mol/l的双氧水1 ~ 4 ml、0.05 ~ 0.2 g的抗坏血酸和0.5 ~ 4 g的ta，在室温下反应12 ~ 48 小时；反应结束后，用去离子水透析2天，然后冷冻干燥3天得到ha-adh-ta，并存储在-20℃的冰箱中；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为8000 ~ 10000da。
8.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s6中oha的具体制备步骤包括：将0.5 ~ 2 g 的ha溶于去50 ~ 200 ml去离子水中；然后加入 0.2 ~ 2 g的高碘酸钠，在室温黑暗条件下搅拌1 ~ 16 小时，然后加入1 ~ 2 ml的乙二醇继续搅拌1小时以停止反应；反应结束后，用去离子水透析2天，然后冷冻干燥3天得到oha；其中，透析时所用透析袋的截留分子量为3500 da。
9.根据权利2所述的一种加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤s7中用于加速糖尿病伤口愈合水凝胶敷料的制备方法的具体制备步骤包括：将amnp-bnn6加入2 ~ 6 wt%的oha溶液中，并将上述溶液与2 ~ 6 wt%的ha-adh-ta溶液等体积混合，制得ha-adh-ta/oha/amnp-bnn6水凝胶；其中，amnp-bnn6在水凝胶中的最终浓度为0.1~ 0.5 mg/ml。
10.根据权利要求1 所述的加速糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料在治疗糖尿病伤口中的应用。
