本发明属于生物工程领域，具体涉及一种荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006及其作为生物抗菌剂在低温保鲜、贮藏环境中的抑菌应用。
背景技术：
1、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)是一种好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，无菌毛，有数根极端鞭毛，广泛存在于乳制品、肉制品、水产品等高蛋白和高脂食品中，致腐能力极强，且能在低温条件下繁殖代谢，是原料乳及其乳制品中的优势腐败菌。其分泌的耐热性蛋白酶和脂肪酶难以被巴氏杀菌和瞬时高温灭菌(uht)灭活，从而会导致冷藏食品的风味等理化性质发生劣变。因此，荧光假单胞菌被认为是冷藏温度下引起食品品质劣变的重要腐败菌，对全球乳品工业造成重大经济损失。
2、当前乳品生产加工过程中用于控制生产环境中细菌生长的抑菌方法主要为依赖于强酸和强碱的cip清洗，该方法中使用的化学试剂残留对人畜健康有危害并会对环境造成污染。荧光假单胞菌在适应cip清洗的过程中，极易在乳品储存容器及加工设备的表面，尤其是弯角、垫圈、管材连接处等难清洗之处形成生物被膜，被膜态的细菌对常规杀菌剂的抵抗能力提高数百倍，极难被清除，从而引起持续性的微生物污染。此外，处生物被膜状态的荧光假单胞菌所分泌腐败酶的量是对应浮游态微生物产生的数倍，腐败酶的耐热性也显著提高，这将大大增加腐败酶在原料奶运输、加工过程中出现并最终导致乳品品质劣变的几率。
3、近年来，出于对食品绿色抗菌的迫切需求，已经从动植物、微生物中提取出大蒜素、茶多酚、溶菌酶、乳酸链球菌素等天然抗菌物质作为生物抑菌剂。上述抗菌剂虽能满足绿色环保需求，但存在制造成本昂贵、易引起食品风味和品质改变、杀菌效果不佳等缺点，因此亟待开发新型生物抑菌剂。
4、噬菌体作为一类细菌依赖性病毒，广泛存在于自然界中，制备成本低，且对人畜健康无害。近年来，新型噬菌体抑菌剂研发已受广泛关注，世界各国在噬菌体资源、生物学特性以及在不同基质中的减/控菌展开大量研究，在美国和欧洲国家已经形成沙门氏菌、李斯特菌等病原菌的商品化生物抑菌剂，在控制食品及生产环境中的致腐/致病菌污染与传播中表现出高效、廉价、安全等优势。荧光假单胞菌是原料乳及乳制品中的优势腐败菌，开发以荧光假单胞菌噬菌体作为主要组分的生物控制剂或保鲜剂，可对减少乳制品的低温腐败，提升乳品品质具有潜在价值。
技术实现思路
1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种对荧光假单胞菌生长具有强烈裂解作用的噬菌体，该噬菌体可用于食品生产和冷藏保鲜中，尤其是能抑制冷链流通过程中由荧光假单胞菌增殖引起的乳制品以及冷鲜食品腐败变质，从而延长产品货架期。
2、本发明还提供所述噬菌体的应用，该噬菌体能单独或复配制备保鲜剂或生物控制剂，能有效抑制冷藏条件下乳制品以及冷鲜食品中由荧光假单胞菌繁殖与代谢引起的腐败和品质劣变，为乳品以及冷鲜食品保鲜和货架期延长提供一种安全、高效、廉价的生物制剂。此外，本发明还提供该噬菌体在乳品以及冷鲜食品加工过程中作为生物被膜抑制剂中的应用。
3、技术方案：为实现上述目的，本发明所述的一种荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)噬菌体yzu-pf-006，经鉴定具有独特的基因组结构特征，属于一种新型噬菌体，本发明的噬菌体是从江苏省扬州市污水样品中分离获得，具有高效裂解荧光假单胞菌功能的荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006(pseudomonas fluorescens phage yzu-pf-006)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：cctccno:m 2024152；保藏日期：2024年1月22日。
4、本发明中荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006具有以下生物学特征：
5、(1)形态学特征：通过透射电镜观察，yzu-pf-006头部对称，直径约为58nm，尾部长5nm，形态学特征归属短尾噬菌体科。
6、(2)核酸类型：yzu-pf-006为dsdna噬菌体。
7、(3)基因组结构特征：yzu-pf-006基因组全长为40307bp，gc含量为59.93％。其中orfs 37500bp，平均长度为797bp，占总长的93.0％。gc含量为57.3％。含有45个开放阅读框(orfs)，包括17个假设蛋白(hypothetical protein)和23个已知蛋白功能的序列。不含有任何已知的毒力基因。经ncbi数据库全基因组比对发现，与噬菌体yzu-pf-006接近的噬菌体的同源性均低于95％，根据目前的命名法则，yzu-pf-006为一种新型噬菌体。(4)在4-37℃温度下具有强烈裂解荧光假单胞菌功能。
8、(5)在4-37℃温度下能够抑制荧光假单胞菌生物被膜形成。
9、(6)在4-37℃温度下能够延缓荧光假单胞菌对牛奶品质的影响。
10、本发明所述的噬菌体yzu-pf-006在抑制荧光假单胞菌中的应用。
11、其中，所述噬菌体yzu-pf-006在抑制食品或者环境中荧光假单胞菌中的应用。
12、其中，所述噬菌体yzu-pf-006在抑制原料乳中荧光假单胞菌中的应用。
13、其中，所述噬菌体yzu-pf-006在抑制冷鲜食品荧光假单胞菌中的应用。
14、其中，所述噬菌体yzu-pf-006在用于原料乳保鲜及其乳品生产环境或保藏运输器具中清除荧光假单胞菌及其生物被膜中的应用。
15、其中，所述噬菌体yzu-pf-006在在抑制冷鲜食品加工、低温冷链过程中荧光假单胞菌繁殖、代谢及其生物被膜中的应用。
16、本发明所述的噬菌体yzu-pf-006在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
17、其中，所述噬菌体yzu-pf-006分离物或培养物单独或者与现有抑菌剂混合在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
18、其中，纯化的噬菌体btpyzu01噬菌体yzu-pf-006制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中荧光假单胞菌污染；或者将纯化的噬菌体作为保鲜剂，在配料和贮藏时加入，用于抑制冷鲜食品加工、低温储存过程中荧光假单胞菌代谢和繁殖。
19、本发明将上述荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006制备成一种微生态制剂，用作食品冷藏保鲜中的保鲜剂，制备方法特征在于：分别取100μlyzu-pf-006噬菌体液与相应对数生长期的荧光假单胞菌菌液100μl混合，室温放置10min，然后加到10ml tsb液体培养基中，28℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经8000×g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加peg 8000，nacl，摇匀至溶解，4℃过夜；于4℃下10000×g离心20min，去上清液；加0.5ml sm(1l：nacl5.8g，mgso47h2o 2.0g，1m tris-hcl(ph 7.4)50ml)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；于4℃下3000×g离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的yzu-pf-006噬菌体颗粒与sm缓冲液按1：10比例混合形成噬菌体制剂母液。
20、有益效果：与现有技术相比较，本发明具有如下优点：
21、本发明分离获得能够高效裂解荧光假单胞菌的噬菌体yzu-pf-006，具有独特的形态和功能特征，是一种全新的有效抑制荧光假单胞菌的噬菌体，该噬菌体yzu-pf-006可应用于制备绿色、廉价的荧光假单胞菌抑制剂中。
22、由于本发明的噬菌体yzu-pf-006通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行除菌，能有效控制各种基质中荧光假单胞菌的生长及生物被膜形成，从而降低生产环境中荧光假单胞菌对冷鲜产品的污染风险；本发明涉及的噬菌体属于天然生物材料，具有宿主专一性，基因组中不含任何毒力基因，没有毒副作用，可作为冷鲜食品及其储放设备、器皿、环境、原料固体表面的专用保鲜剂或生物控制剂。
23、本发明提出了一种低温致腐菌-荧光假单胞菌噬菌体，其作为生物抑菌剂乳制品冷藏保鲜中的应用。本发明的荧光假单胞菌噬菌体yzu-pf-006可运用在低温保鲜中，其制剂能够抑制原料乳储运及冷藏乳制品及其环境中荧光假单胞菌的生长，有效降低荧光假单胞菌致病和引发乳制品品质劣化的风险，从而延长产品货架期。
1.一种荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)噬菌体yzu-pf-006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2024年1月22日，保藏编号为cctcc no:m 2024152。
2.一种权利要求1所述的噬菌体yzu-pf-006在抑制荧光假单胞菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述噬菌体yzu-pf-006在抑制食品或者环境中荧光假单胞菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体yzu-pf-006在抑制原料乳中荧光假单胞菌中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体yzu-pf-006在抑制冷鲜食品荧光假单胞菌中的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体yzu-pf-006在用于原料乳保鲜及其乳品生产环境或保藏运输器具中清除荧光假单胞菌及其生物被膜中的应用。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述噬菌体yzu-pf-006在在抑制冷鲜食品加工、低温冷链过程中荧光假单胞菌繁殖、代谢及其生物被膜中的应用。
8.一种权利要求1所述的噬菌体yzu-pf-006优选在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述噬菌体yzu-pf-006分离物或培养物单独或者与现有抑菌剂混合在制备抑制荧光假单胞菌的喷洒液、淋洗液、保鲜剂或生物控菌剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，纯化的噬菌体btpyzu01噬菌体yzu-pf-006制成喷洒液或淋洗液，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中荧光假单胞菌污染；或者将纯化的噬菌体作为保鲜剂，在配料和贮藏时加入，用于抑制冷鲜食品加工、低温储存过程中荧光假单胞菌代谢和繁殖。
