本发明属于基因检测，具体涉及基于数字pcr平台的egfr基因多位点联合检测的引物探针组合物及试剂盒。
背景技术：
1、肺癌是全球很常见的癌症类型，全球每年新发200万例左右，世界卫生组织(who)将肺癌分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)，其中nsclc占85％以上。在非小细胞肺癌(nsclc)中，尤其是腺癌，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)基因的突变频率非常高，特别是亚裔非吸烟患者，突变率高达40％—60％。egfr主要突变形式集中在18-21号外显子上，突变引起egfr下游通路的激活，细胞的生长不受控制，从而导致肿瘤的发生。其中egfr 19号外显子缺失突变(exon 19deletion，e19del)在所有egfr突变中约占45％，21号外显子l858r点突变约占40％，所以被称为egfr常见突变或egfr经典突变，且这两种突变都会导致酪氨酸激酶域的激活，故而与酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，tkis)的敏感性相关，所以这两种突变又常被称为egfr敏感突变，可作为egfr-tkis靶向药物治疗的有效预测指标。在egfr基因突变nsclc患者中，有2％-4％的患者携带外显子20插入突变(exon 20insertions，e20ins)，是仅次于19外显子缺失突变及21外显子l858r突变的第三常见突变，不同外显子20插入突变对egfr-tkis的耐药性各有不同，目前针对外显子20插入突变也有相应的靶向药物，如阿米万他单抗(amivantamab，jnj-6372)和莫博替尼(mobocertinib，tak-788)。s768i在egfr突变的患者中发生率约为1.5％-3％，多与e19del、g719x、e709x、l861x等位点突变联合出现，有临床研究表明，对s768i突变的患者，临床使用二代egfr-tkis更能使患者生存获益。l861q点突变位于21号外显子，约占egfr突变的2％，属于另一种罕见突变，对二代egfr-tkis高度敏感，对奥希替尼较为敏感。当患者接受第一代/第二代egfr抑制剂治疗耐药后，大约50％-60％的患者能够检测到耐药突变t790m突变。这是患者对于第一代/第二代egfr抑制剂治疗不再获益的主要原因之一，也被称为“关守突变”，故主要以奥希替尼为代表的第三代egfr-tkis进行治疗。然而，于t790m耐药突变后6-17个月，位于20号外显子上的c797s突变发生，为三代egfr-tkis获得性耐药突变。但遗憾的是，目前针对敏感突变/t790m/c797s三联突变的患者仍无有效的靶向药物。
2、当前，美国食品药品监督管理局(fda)及中国国家市场监督管理总局(cfda)明确规定，egfr-tki治疗应根据egfr基因检测结果来选择适宜的治疗对象，只有具有egfr敏感突变的患者才能进行后续的egfr-tki治疗。因此，在判断患者是否适用egfr-tki治疗之前，首先需对egfr基因的突变状态进行检测。目前对于egfr基因的多重突变检测一般是通过荧光定量pcr、arms-pcr、ngs等技术对血液样本或组织样本中的游离核酸分子(cellfreedna，cfdna)进行检测而实现的。相较于pcr法，ngs技术虽然通量高、灵敏度高，但操作流程繁琐，检测周期长，且成本高、对生信分析人员要求高。故针对已知突变位点的序列，可以通过荧光定量pcr、arms-pcr等pcr技术对突变位点进行检测。
3、荧光定量pcr主要使用荧光探针标记pcr产物，利用荧光信号积累从而对pcr反应过程进行实时监测，以反应时间内dna的增量为基础，能够对dna进行定量分析。arms-pcr是一种用来检测已知突变的方法，其基本原理是根据已知点突变设计引物，若引物3’端碱基不与模板完全匹配，引物延伸就会受阻，若引物3’端碱基与突变型模板碱基互补，pcr只扩增突变型模板，从而达到检测点突变的目的。然而，荧光定量pcr和arms-pcr都只能实现对已知突变的定性和定量检测，但无法精准定量突变频率。此外，在进行多位点突变点位联合检测时，由于荧光通道的限制，通常会将反应管分为四到八个反应管，不但降低了检测的通量，而且增加了检测的试剂成本，且需要使用更多的宝贵临床检材，如血液样本或组织样本。例如专利cn 113755590a与2021年12月公开了一种联合检测egfr基因突变的试剂和试剂盒，该专利在基于荧光pcr技术平台上采用arms技术与tagman探针相结合的方法，可对egfr基因19～21号外显子进行多位点联合检测，但该专利仅能对e19del的19种突变进行检测，覆盖范围较窄；进一步地，该专利在操作上需要将32种突变划分成八个荧光pcr检测反应管，不仅操作复杂，且样本cfdna的总用量在80～160ng。然而，在血浆中cfdna的浓度一般很低，通常不到每毫升血浆10微克；而来源于肿瘤细胞以及肿瘤细胞外排体的circulatingtumor dna(ctdna)在cfdna中的含量仅为1％以下，因此该方法不适用于肿瘤含量偏低的样本以及ctdna样本。因此，专利cn 116751867a于2023年9月公开了一种用于检测egfr突变基因的引物及荧光探针，通过三个pcr管对egfr基因的41种碱基突变形式进行了特异性检测，将样本cfdna的总用量降至30ng；然而，该专利却无法实现对egfr基因20外显子上t790m和c797s的顺/反式突变的检测。研究表明，egfr基因继发性c797s突变与t790m突变存在顺/反式两种不同关系，当t790m和c797s同时于相同等位基因上突变时，即两个突变位于同一条染色体上，这种构型称为顺式；t790m和c797s位于不同等位基因上，即两个突变位于不同染色体上，这种构型称为反式。研究显示t790m和c797s的顺/反式突变与靶向药的疗效有明显的相关性：t790m/c797s反式突变的nsclc患者对三代egfr-tkis耐药，但是对一、三代egfr-tkis联合用药敏感；而t790m/c797s顺式突变的患者对一、三代egfr-tkis单药和联合用药均不敏感。因此，检测t790m和c797s的顺/反式突变对于nsclc的临床治疗及用药指导方面具有重要参考价值。于2023年10月公开的专利cn 116837098 a提供了一种基于数字pcr检测技术用于检测t790m和c797s的顺反式突变的引物和荧光探针，然而，该专利在检测过程中也仍然需要两个pcr试管。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中对egfr基因进行多位点联合检测时存在检测灵敏度低、检测通量低、样本cfdna用量高、检测位点不全面等问题，本发明提供了一种用于egfr基因多位点联合检测的引物探针组合物及其试剂盒，在基于五重通道数字pcr的方法上，只需两管pcr反应管、20ng样本dna即可实现包括t790m和c797s的顺反式突变、未知的e19del突变在内的35种egfr基因多重多位点突变的检测，并且可以精准定量不同突变dna的拷贝数及突变频率，对确定突变在疾病进展、治疗反应和耐药性等临床意义方面具有重要意义，有助医生制定更个体化的治疗策略。
2、为此，本发明提供了一种用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒，所述试剂盒包括第一反应管和/或第二反应管；所述第一反应管包括e19del试剂、l858r试剂、s768i试剂、t790m&c797s试剂中的至少一种；所述第二反应管包括g719x试剂、e20ins试剂、l861q试剂中的至少一种；其中，所述e19del试剂包括碱基序列如seq id no.1～2所示的引物、碱基序列如seq id no.15所示的荧光探针；所述l858r试剂包括碱基序列如seq id no.3～4所示的引物、碱基序列如seq id no.16所示的荧光探针；所述s768i试剂包括碱基序列如seq idno.5～6所示的引物、碱基序列如seq id no.17所示的荧光探针；所述t790m&c797s试剂包括碱基序列如seq id no.7～8所示的引物、碱基序列如seq id no.18～20所示的荧光探针；所述g719x试剂包括碱基序列如seq id no.9～10所示的引物、碱基序列如seq idno.21～24所示的荧光探针；所述e20ins试剂包括碱基序列如seq id no.11～12所示的引物、碱基序列如seq id no.25～29所示的荧光探针；所述l861q试剂包括碱基序列如seq idno.13～14所示的引物、碱基序列如seq id no.30所示的荧光探针。
3、作为优选，所述第一反应管还包括碱基序列如seq id no.31所示的内参探针；所述第二反应管还包括碱基序列如seq id no.32和/或seq id no.33所示的内参探针。其中，所述的碱基序列如seq id no.31所示的内参探针为e19de-ref，所述碱基序列如seq idno.32所示的内参探针为e20-ref，所述碱基序列如seq id no.33所示的内参探针为e21-ref。
4、在本发明一个或多个实施方案中，所述荧光探针和/或内参探针的端点序列或非端点序列具有或不具有修饰，所述修饰选自锁核酸修饰、肽核酸修饰、mgb修饰中的一种。在这里，所述的锁核酸(lockednucleic acid，lna)修饰、肽核酸(peptide nucleic acid，pna)修饰、mgb(minor groove binder，小沟结合蛋白)修饰可提高探针的tm值，当具有修饰的探针序列与模板不匹配时很难与模板互补退火，从而提高探针与模板结合的特异性。
5、作为优选，所述荧光探针和所述内参探针的5’端连接有荧光基团和/或3’端连接有猝灭基团。作为优选，所述荧光基团选自fam、vic、rox、cy5、cy5.5中的至少一种。作为优选，所述猝灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、nfq中的至少一种。其中，连接有猝灭基团nfq的荧光探针其3’端一般修饰有mgb基团，以提高探针与模板结合的特异性。
6、本发明针对egfr基因的多种突变设计了包括引物、荧光探针、内参探针在内的用于多位点联合检测的试剂盒，该试剂盒仅需两管pcr反应管、总计20ng样本量即可同时对egfr基因的35种突变进行快速、准确、灵敏的联合检测，其中还包括t790m和c797s的顺反式突变，以及对未知的e19del突变进行检测。具体地，本发明所涉及的35种egfr基因突变的检测位点见表1。
7、表1.egfr基因突变的检测位点
8、
9、
10、注：表1中列出了33种突变类型，t790m和c797s的顺式和反式作为2种突变类型没有统计在表1内。
11、为实现上述目的，发明人团队根据cosmics数据库公布的人类egfr基因18外显子、19外显子、20外显子、21外显子的野生型基因序列和各突变序列为基础，创造性地设计了特异性引物和探针。具体而言，首先分别对8种egfr突变位点，即e19缺失突变、l858r突变、s768i突变、t790m突变、c797s突变、e20ins突变、l861q突变、g719x突变，设计引物及荧光探针，再使用sybr法对引物进行初步筛选，对筛选得到的引物组合与荧光探针组合后进行再次筛选，对筛选得到的引物及荧光探针组合进行调整设计，得到最优引物及荧光探针组合，并以野生型样本或突变型样本为模板进行数字pcr验证。进一步地，将以上筛选得到引物及荧光探针组合进行不同位点体系的逐步组合，先两个位点组合，测试各位点的特异性和准确性，如若组合后的体系特异性或准确性或荧光图分区差，则进行引物探针浓度或者序列的调整。两个位点组合确定后加入第三个位点的检测体系，继续测试各位点的特异性和准确性，同理，如若组合后的体系特异性或准确性或荧光图分区差，则进行引物探针浓度或者序列的调整。如经调整后未形成良好的检出效果，则考虑反应管分布的调整。初步确定各反应管的多重体系后则进行多重体系的优化，系统地对反应体系中各引物探针的浓度、扩增程序进行优化。经多次调整后最终形成的反应管的分布见表2，最终确定的引物、探针序列以及反应体系、反应程序见表3、表4、表5、表6。
12、如表2所示，将最终筛选确认的33条包括引物、荧光探针、内参探针在内的序列科学合理地分配至两管pcr反应管，即所述的第一反应管、第二反应管。其中，第一反应管中同时检测egfr基因多种e19缺失突变、l858r突变、s768i突变、t790m突变、c797s突变，同时确定t790m和c797s突变的顺/反式连锁方式；第二个反应管同时检测多种e20ins突变、l861q突变、g719x突变(包括g719c、g719a、g719s三种突变)，总共至少检测35种egfr突变，并且可以精准定量不同突变dna的拷贝数及突变频率。需要说明的是，所述试剂盒中用于检测e19del突变的荧光探针并不仅针对表1中提及的e19del突变进行设计的，从检测方法的原理上可以理解，本发明提供的用于检测e19del突变的荧光探针理论上可以检测到e19del的其余未知突变，进一步扩大了检测范围。
13、表2.不同反应管检测的突变类型设置
14、
15、发明人团队对于不同突变位点设计的荧光探针针对性地匹配了不同的荧光基团，在同一个反应体系(即同一个反应管)中借助带有不同荧光修饰的针对不同突变位点的探针即可同步并行地检测多个基因位点突变。如表2所示，每一个反应管中包括了5种不同的荧光基团分别用于报告不同点位上探针与模板的结合信号。需要说明的是，为了实现对egfr基因各检测位点突变频率的精准定量检测，发明人团队对18、19、20、21四个外显子分别设计了总拷贝数的定量体系。在19、20、21外显子上均设有内参基因的检测，在计算e19del、l858r、t790m、e20ins、l861q、s768i、g797s位点的突变频率时，19、20、21外显子各自的总拷贝数为内参的检出拷贝数，而18外显子采用野生型竞争探针的设计，18外显子的总拷贝数为野生型拷贝数加突变型拷贝数。由此看出如果给每个点位的检测分派一种荧光信号的话，对于目前数字pcr荧光通道有限的情况下，利用常规方法无法做到通过两个反应管实现35种突变检测。因此发明人团队巧妙地利用了数字pcr荧光图中四个象限分布的特点，如表2所示，在反应管1中e19del-wt的检测与l858r-mu的检测共用了荧光通道rox，而完全不影响各自的检出。在此将其中的原理解释如下：首先，用于检测e19del突变的e19del试剂仅设置了一对引物、一条内参探针(vic信号)和一条野生型探针(rox信号)，这种设置方式不仅简化了反应体系，理论上还可以检测e19del的未知突变，与数字pcr技术完美契合。当检测e19del野生型模板时，内参探针和野生型探针都会和模板结合，扩增后产生vic+rox双荧光信号，双荧光信号的散点分布在荧光图(x轴rox、y轴vic)中的第一象限(右上角)；当检测e19del纯合突变模板时，只有内参探针与模板结合，扩增后产生vic荧光信号，单vic信号的散点分布在荧光图(x轴rox、y轴vic)中的第四象限(左上角)；当检测e19del杂合突变模板时，内参探针会和每一条模板结合，野生型探针只会和野生型模板结合，扩增后会产生两种荧光信号，单vic信号和vic+rox双荧光信号，阳性信号的散点分布在荧光图中的第一象限(右上角)和第四象限(左上角)。由此看出，e19del检测体系在rox和vic的二维荧光图中单rox信号位置是闲置的，因此发明人团队利用这一点，将l858r突变信号的检测荧光信号设置成rox，当出现单rox信号时则为l858r突变。在反应管2中e20ins-mu的检测与l861q-mu的检测共用了荧光通道fam，而完全不影响各自的检出，其原理同上述反应管1。在本发明的一个优选实施方案中，所述试剂盒经筛选确认的特异性引物以及修饰有不同荧光/猝灭基团的荧光探针、内参探针的详细序列见表3。
16、表3.用于检测egfr基因35种突变类型的引物探针
17、
18、
19、注：表3中，“+”表示“+”右侧碱基带有锁核酸修饰。
20、本发明还提供了所述的试剂盒在制备用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒中的应用。可以理解的是，所述的试剂盒不局限于上述35种egfr基因突变位点的联合检测，所述试剂盒中的第一反应管或第二反应管可单独应用于相应突变位点的检测，可根据需求选择其中任意管进行实验、结果分析、出具报告；也可通过对现有引物、探针设计方法进行改进使得同一个反应管还适用于单碱基缺失、短片段插入或缺失等其他突变类型的检测。同样可以理解的是，所述第一反应管或第二反应管可包括一种或多种用于不同突变位点检测的引物探针组合物试剂，用于一个突变位点的检测或多个突变位点的联合检测。
21、本发明还提供了体外非诊断目的的egfr基因多位点联合检测的方法，包括以下步骤：从待测样本中提取dna作为模板，利用上述的用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒进行pcr反应，根据荧光pcr扩增结果进行判断。
22、作为优选，所述方法使用荧光pcr仪和/或数字pcr仪进行pcr反应。相较于常规pcr，数字pcr将样品分离成大量分区使得每个分区中可单独进行pcr反应，可实现对样品中突变体的绝对定量。所述数字pcr仪一般包括芯片式数字pcr仪、微滴式数字pcr仪、磁珠式数字pcr仪。微滴式数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)技术如伯乐公司(bio-rad)，提供的油包水乳液微滴系统，微滴在水-油乳液中形成以分离模板dna分子的分区，样品被分成20000纳升大小的微滴，这种划分使得能够在单个样品内测量数千个独立的扩增事件，避免了pcr资源在靶标核酸之间的竞争，以实现对样品的灵敏测量以及对突变体的绝对定量。在本发明优选的实施方案中，所述方法使用微滴式数字pcr仪进行pcr反应，检测周期仅需6～8小时，并且可以精准定量不同突变dna的拷贝数及突变频率。其中，各位点突变频率的计算方法如下：
23、e19del突变频率＝(vic拷贝数(管1)-rox拷贝数(管1))/vic拷贝数(管1)×100％；l858r突变频率＝(rox拷贝数(管1)-vic拷贝数(管1))/cy5.5拷贝数(管2)×100％；e20ins突变频率＝fam&vic双突变拷贝数(管2)/vic拷贝数(管2)×100％；
24、t790m突变频率＝fam拷贝数(管1)/vic拷贝数(管2)×100％；
25、g719x突变频率＝cy5拷贝数(管2)/(cy5拷贝数(管2)+rox拷贝数(管2))×100％；s768i突变频率＝cy5.5拷贝数(管1)/vic拷贝数(管2)×100％；
26、l861q突变频率＝单突变fam拷贝数(管2)/cy5.5拷贝数(管2)×100％；
27、式中，管1指第一反应管，管2指第二反应管。
28、作为优选，所述待测样本选自体液、组织、体外细胞培养物、质粒中的至少一种。在这里，所述待测样本应理解为含有或推测含有核酸的任何物质，包括从个体分离的组织或流体，或其纯化部分，例如体液、组织、体外细胞培养物。所述体液包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、痰液、胆汁、滑液、尿液、泪液、精液、乳腺分泌物、唾液、关节液、腹水、胸膜积液、羊水等。所述组织包括全血、正常组织、肿瘤组织，还包括石蜡包埋组织或术后冰冻组织。
29、在本发明一个或多个实施方案中，pcr反应体系一般包括上述的用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒、pcr反应预混液、待测样本中提取的dna。其中，所述待测样本中提取的dna一般可以是指从石蜡包埋组织(ffpe)样本中提取的dna，或血浆样本中提取的cfdna，或突变细胞系dna，或质粒dna。所述pcr反应预混液一般包括pcr缓冲液、dntp和taqdna聚合酶等本领域技术人员所熟知的反应试剂。在单个反应管中，即所述的第一反应管或第二反应管，所述待测样本的上样量不少于10ng，优选为10～150ng，具体可以是10ng、11ng、12ng、13ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、120ng、140ng、150ng。
30、在本发明一个优选实施方案中，所述pcr反应包括：将所述的用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒、pcr反应预混液与待测样本中提取的dna按照表4、表5提供的经反复优化后的pcr反应体系进行混合，在表6提供的pcr反应程序下进行数字pcr反应。在基于五重荧光信号通道的情况下，本发明提供的方法可以快速、准确、灵敏地对egfr基因的35种突变进行联合检测，检测过程只需两管pcr反应管、20ng样本dna，实现了dna样本用量低至10ng/反应管，相较于现有技术不仅通量高，检测成本低，还大幅减少了宝贵临床检材的用量。
31、表4.第一反应管的多重反应体系
32、
33、
34、表5.第二反应管的多重反应体系
35、 试剂名称 上样体积(ul) 2xpcr反应预混液 15 g719x-f(20um) 1.2 g719x-r(20um) 1.2 g719x-wp(10um) 0.3 g719a-mp(10um) 0.5 g719c-mp(10um) 0.3 g719s-mp(10um) 0.3 e20ins-f(20um) 1.2 e20ins-r(20um) 1.2 e20ins-ref-p(10um) 0.5 e20ins-mt1-p(10um) 0.2 e20ins-mt2-p(10um) 0.2 e20ins-mt3-p(10um) 0.3 e20ins-mt4-p(10um) 0.3 e20ins-mt5-p(10um) 0.5 l861q-f(20um) 1.2 l861q-r(20um) 1.2 l861q-mp(10um) 0.75 e21-ref-p(10um) 0.75 dna(10ng) 1 <![cdata[h<sub>2</sub>o]]> to30ul
36、表6.反应程序
37、
38、在利用多重微滴式数字pcr仪进行pcr反应后，根据荧光pcr扩增结果进行判断，所述判断的标准为：阴阳性质控在控的前提下：(1)存在连续阳性微滴(单荧光值)≥3，判定为阳性；(2)若阳性微滴≤2，需要增加投入量提高检出后判读；(3)阳性微滴数＝0，判定为阴性。其中，判断t790m和c797s突变的顺/反式连锁的方法为：通过第一反应管的数字pcr荧光图判断，当样本为t790m和c797s突变的顺式连锁时，fam-cy5二维荧光图中只有fam+cy5的双突变；当样本为t790m和c797s突变的反式连锁时，fam-cy5二维荧光图中只有单fam突变和单cy5突变；当样本为t790m和c797s突变的顺式+反式连锁时，fam-cy5二维荧光图中既有单fam突变，也有fam+cy5的双突变。
39、本发明的有益效果：本发明提供的用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒，基于五重荧光通道数字pcr的方法，只需两个pcr反应管即可检测至少35种egfr突变，并且可以检测t790m和c797s突变的顺/反式连锁以及未知的e19del的突变，同时精准定量不同突变dna的拷贝数及突变频率，提升了检测的方便性，降低了检测成本，同时保证了检测的灵敏度和准确性。其次，本发明将样本dna总用量降低至20ng，使其不仅可应用于组织样本的检测，也可适用于cfdna样本的检测，解决了临床cfdna样本量少的难题。该检测技术基于数字pcr平台，其具有检出丰度低，特异性高、操作简单、时间快、判读简单直观的优点，可以提高基因突变位点的检出性能，从而更好地辅助科研及临床检测需求，对于指导医生用药具有重要意义。
1.用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒，其特征在于，
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一反应管还包括碱基序列如seq idno.31所示的内参探针。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二反应管还包括碱基序列如seq idno.32和/或seq id no.33所示的内参探针。
4.如权利要求1～3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针和所述内参探针的5’端连接有荧光基团和/或3’端连接有猝灭基团。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自fam、vic、rox、cy5、cy5.5中的至少一种；所述猝灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、nfq中的至少一种。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下表所示的第一反应管、第二反应管：
7.权利要求1～6任一所述的试剂盒在制备用于egfr基因多位点联合检测的试剂盒中的应用。
8.体外非诊断目的的egfr基因多位点联合检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：从待测样本中提取dna作为模板，利用权利要求1～6任一所述的试剂盒进行pcr反应，根据荧光pcr扩增结果进行判断。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，使用荧光pcr仪和/或数字pcr仪进行pcr反应。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本选自体液、组织、体外细胞培养物、质粒中的至少一种。
