本发明涉及医药，尤其是涉及一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、肿瘤免疫疗法通过激活或重建机体自身免疫系统产生特异性免疫应答来介导肿瘤的杀伤，具有特异性强、免疫效力高和长期记忆的特点，在抑制肿瘤生长、复发和转移方面具有广阔的应用前景。肿瘤免疫疗法主要包括免疫检查点阻断疗法、细胞因子疗法、肿瘤疫苗疗法、过继性免疫细胞疗法等。然而，临床上只有少数患者(其特征是患者肿瘤微环境中富有浸润的淋巴细胞)才能获得有效的临床反应。因此，促进有利于淋巴细胞浸润的免疫刺激微环境是增强癌症免疫治疗疗效的关键。
2、肿瘤免疫应答的激活涉及到多环节，主要是在化疗或放疗等刺激下杀伤肿瘤细胞，引起免疫原性细胞死亡进而启动肿瘤免疫循环，联合免疫检查点阻断剂、细胞因子、肿瘤疫苗佐剂或过继性免疫细胞等放大抗肿瘤免疫应答效应，促进淋巴细胞在肿瘤微环境的浸润，以形成免疫刺激微环境，从而达到控制或清除肿瘤的目的。在肿瘤的临床治疗中，免疫治疗一般通过静脉注射，然而其免疫相关不良反应，特别是与全身暴露于治疗药物相关的靶向、肿瘤脱靶毒性等大大降低了其疗效和患者顺应性。局部递送药物是提高其生物利用度的有前景的治疗策略，能够提高药物在靶部位的浓度，进而提高其治疗疗效和降低脱靶毒副作用。因此，开发安全和有效的局部递送平台是当下的迫切需求。
3、中国专利cn116271065a公开了一种原位亚单位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用，其包括超分子多肽水凝胶载体和负载在超分子多肽水凝胶载体上的亚单位疫苗组分；所述亚单位疫苗组分包括抗原、佐剂和免疫调节剂。该方案中提供的原位亚单位水凝胶疫苗制剂能够控制疫苗组分缓慢释放，持续激活体内免疫应答效应，从而建立免疫屏障，及时切断病毒传播和阻断病毒感染。设计的多肽可自组装形成带正电荷的纳米纤维，其可以吸附疫苗组分，进一步在生理环境中原位形成亚单位水凝胶疫苗；通过检测药物释放行为，表明其亚单位水凝胶疫苗能够长效缓慢释放疫苗组分，从而提高抗原暴露时间和持续激活体内免疫应答机制。该专利申请公开的原位亚单位水凝胶疫苗制剂主要用于传染病疾病，同时该方案使用的多肽自组装以形成水凝胶。
4、中国专利cn108033996b公开了一种可控制备紫杉醇纳米纤维及其制备方法和用途，前体化合物为紫杉醇与多肽链通过接头进行偶联；其中，接头为丁二酸、戊二酸；多肽为ggge、ggee或geee；丁二酸分别与紫杉醇上的羟基以及甘氨酸上的氨基进行偶联。还公开了一种紫杉醇纳米纤维凝胶，其是通过将紫杉醇纳米纤维前体化合物水解得到的。但是该方案主要是通过改变前体分子中谷氨酸(e)的个数调节紫杉醇多肽前体分子的两亲性，进而影响紫杉醇分子与多肽之间酯键的水解速率，从而实现紫杉醇水凝胶形成的动力学控制，该方案不能使用时直接原位形成水凝胶。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了克服现有肿瘤免疫治疗响应性低和安全性差的问题而提供一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂及其制备方法和应用。
2、本发明提供的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其安全性好、稳定性高、载药量高，作为递释体系可以用于局部递送免疫治疗剂，从而实现单次给药后免疫治疗剂的可控和长效递送，诱导淋巴细胞在肿瘤微环境的浸润和富集，从而提高抗肿瘤免疫治疗疗效，以抑制肿瘤的生长、复发和转移。
3、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本发明提供一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，包括纳米纤维溶液和纳米纤维溶液中添加的免疫治疗剂；
5、所述纳米纤维溶液是将多肽-药物偶联物ptx-irgd溶于溶剂中得到的，多肽-药物偶联物ptx-irgd在溶剂中自组装形成纳米纤维，所述多肽-药物偶联物ptx-irgd由多肽和药物紫杉醇(ptx)组成；
6、所述免疫治疗剂选自细胞因子、toll样受体激动剂、sting激动剂或免疫细胞中的一种或几种的组合。
7、在本发明的一些实施方式中，所述多肽为irgd，其irgd的序列可表示为cg-cyl[crgdrgpdc]，其中c为半胱氨酸，d为天门冬氨酸，g为甘氨酸，p为脯氨酸，r为精氨酸，cyl表述环状。本发明中选择多肽为irgd，该多肽具有肿瘤靶向性和渗透性的作用，机制是先与肿瘤血管表面的αv整合素结合，随后酶解产生crgdr与肿瘤细胞上的神经纤毛蛋白-1相互作用，从而促进ptx的组织渗透，具有靶向肿瘤、肿瘤渗透的作用。
8、在本发明的一些实施方式中，所述细胞因子包括但不限于如下中的一种或几种：il-2、il-12、il-6、il-15、il-21、il-22、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tnf-β、gm-csf、cxcl-9、cxcl-10、cxcl-11、ccl27、ccl28。
9、在本发明的一个更优选的实施方式中，所述细胞因子为gm-csf，当所述多肽-药物偶联物ptx-irgd用量为10-50mg时，所述gm-csf质量为0.01-10mg。
10、在本发明的一些实施方式中，所述toll样受体激动剂包括但不限于如下中的一种或几种：pam3csk4、pam2csk4、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、gpi膜锚定物、酵母多糖、poly(i:c)、单磷酸脂a、咪喹莫特、咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡咯嘧啶、苯并咪唑、cpg 1826、odn 1018、odn 2006、odn 2216、odn 2395或odn 1668。
11、在本发明的一些实施方式中，所述sting激动剂包括但不限于如下中的一种或几种：c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp、msa-2、adu-s100、mk-1454、sr-717lithium、mavu-140、mk-1454、imsa-101、gsk3745417、sb11285、bms-986301、hg381。
12、在本发明的一个更优选的实施方式中，所述sting激动剂为adu-s100(cda)，当所述多肽-药物偶联物ptx-irgd用量为10-50mg时，所述cda质量为0.01-10mg。
13、在本发明的一些实施方式中，所述免疫细胞包括但不限于如下中的一种或几种：自然杀伤细胞(nk)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)、树突状细胞(dc)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、细胞毒t淋巴细胞(ctl)、t细胞受体嵌合t细胞(tcr-t)、嵌合抗原受体t细胞(car-t)、嵌合抗原受体巨噬细胞(car-m)、嵌合抗原受体自然杀伤细胞(car-nk)。
14、本技术方案的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂中，溶剂、多肽-药物偶联物ptx-irgd、免疫治疗剂的用量关系为1ml：10-50mg：0.01-10mg。
15、本发明还提供紫杉醇免疫调节水凝胶制剂的制备方法，步骤如下：
16、s1、将多肽-药物偶联物ptx-irgd溶于溶剂中，自组装得到纳米纤维溶液；
17、s2、将免疫治疗剂添加到步骤s1中得到的纳米纤维溶液中孵育，所得含有免疫治疗剂的纳米纤维溶液，即为紫杉醇免疫调节水凝胶制剂。
18、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述溶剂选自水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。
19、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述多肽-药物偶联物在溶剂中的浓度为10-50mg/ml。
20、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述孵育温度为4-50℃，所述孵育时间为0-7天。
21、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述免疫治疗剂包括但不限于：细胞因子、toll样受体激动剂、sting激动剂、免疫细胞。
22、本发明还进一步提供紫杉醇免疫调节水凝胶制剂在抑制肿瘤生长、复发和转移中的应用。
23、在本发明的一些实施方式中，紫杉醇免疫调节水凝胶制剂在促进淋巴细胞在肿瘤微环境中的浸润及高效抑制肿瘤生长、复发及转移中的应用。
24、药物所述淋巴细胞包括但不限于：t细胞、b细胞、自然杀伤细胞。
25、药物所述肿瘤或癌症包括但不限于：脑胶质瘤、黑色素瘤、内分泌肿瘤、腺瘤、母细胞瘤、硬纤维瘤、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、肾母细胞瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌或头颈癌中的一种或几种。
26、本发明提供的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂使用时，可以直接以纳米纤维溶液注射后在生理环境中原位触发迅速形成凝胶，例如将本发明的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂以溶液态皮下接种后可原位触发迅速形成凝胶。
27、水凝胶是一类能实现可控递送免疫治疗剂的极具潜力的“智能”递送载体，具有可调节的机械性能和良好的生物相容性，本发明中，将多肽-药物偶联物ptx-irgd溶于溶剂中，自组装得到纳米纤维溶液，该纳米纤维溶液在生理环境中即可原位触发迅速形成凝胶，因此，本技术方案将多肽-药物偶联物ptx-irgd制备成可直接原位形成水凝胶的体系，其具有生物降解性，易制备及功能性，能够作为药物储库，实现免疫治疗剂的可控递送，控制有效载荷的释放并防止不希望的免疫副作用的发生。
28、本发明涉及一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，通过局部递送可以增加免疫治疗剂在体内的滞留，并控制和持续释放免疫治疗剂，在提高药物(包括免疫治疗剂和紫杉醇)浓度和生物利用度同时，大大降低其在血液中的暴露时间，减少其毒副作用。
29、本发明基于多肽-药物偶联物自组装体可以实现其在生理条件下的即时“溶液-凝胶”转变，以液体状态直接皮下接种，然后在生理环境中发生相转变，形成紫杉醇免疫调节水凝胶。
30、本发明提供的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂能够作为药物储库，控制药物缓慢释放，单次给药后激活体内长效免疫应答效应，从而高效抑制肿瘤的生长、复发和转移。多肽-药物偶联物ptx-irgd可自组装形成带正电的纳米纤维，其可以通过静电作用负载免疫治疗剂，进一步在生理环境中形成紫杉醇免疫调节水凝胶；通过检测药物释放行为，表明其紫杉醇免疫调节水凝胶能够长效缓慢释放药物，从而持续激活体内免疫应答机制，增加肿瘤微环境中淋巴细胞的浸润以有效抑制肿瘤的生长、复发和转移。
31、与现有技术相比，本发明有益效果如下：
32、(1)本发明运用多肽-药物偶联物自组装体“溶液-凝胶”转变特性，以溶液态注射后，在注射部位原位触发形成紫杉醇免疫调节水凝胶，构建原位药物储库，单次给药实现免疫治疗剂的长效释放并减少其在血液中的含量，降低毒副作用；
33、(2)本发明制备的紫杉醇免疫调节水凝胶能够调控肿瘤免疫循环，激活抗肿瘤特异性免疫应答，诱导淋巴细胞在肿瘤微环境的浸润和富集，从而高效抑制肿瘤的生长、复发和转移；
34、(3)本发明制得的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂制备简易、给药便捷且易于运输和保存，为免疫治疗剂的运输及储存提供了有利条件。
1.一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其特征在于，包括纳米纤维溶液和纳米纤维溶液中添加的免疫治疗剂；
2.根据权利要求1所述的一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其特征在于，所述细胞因子选自如下中的一种或几种：il-2、il-12、il-6、il-15、il-21、il-22、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tnf-β、gm-csf、cxcl-9、cxcl-10、cxcl-11、ccl27、ccl28。
3.根据权利要求1所述的一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其特征在于，所述toll样受体激动剂选自如下中的一种或几种：pam3csk4、pam2csk4、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、gpi膜锚定物、酵母多糖、poly(i:c)、单磷酸脂a、咪喹莫特、咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡咯嘧啶、苯并咪唑、cpg 1826、odn 1018、odn 2006、odn 2216、odn 2395、odn 1668。
4.根据权利要求1所述的一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其特征在于，所述sting激动剂选自如下中的一种或几种：c-di-gmp、c-di-amp、3',3'-cgamp、2',3'-cgamp、msa-2、adu-s100、mk-1454、sr-717lithium、mavu-140、mk-1454、imsa-101、gsk3745417、sb11285、bms-986301、hg381。
5.根据权利要求1所述的一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其特征在于，所述免疫细胞选自如下中的一种或几种：自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、细胞毒t淋巴细胞、t细胞受体嵌合t细胞、嵌合抗原受体t细胞、嵌合抗原受体巨噬细胞、嵌合抗原受体自然杀伤细胞。
6.根据权利要求1所述的一种紫杉醇免疫调节水凝胶制剂，其特征在于，紫杉醇免疫调节水凝胶制剂中，溶剂、多肽-药物偶联物ptx-irgd、免疫治疗剂的用量关系为1ml：10-50mg：0.01-10mg。
7.权利要求1-6中任一项所述的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
8.根据权利要求7所述的紫杉醇免疫调节水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述溶剂选自水、生理盐水或磷酸盐缓冲液；
9.权利要求1-6中任一项所述紫杉醇免疫调节水凝胶制剂在抑制肿瘤生长、复发和转移中的应用，其特征在于，紫杉醇免疫调节水凝胶制剂在促进淋巴细胞在肿瘤微环境中的浸润及高效抑制肿瘤生长、复发及转移中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述淋巴细胞选自t细胞、b细胞、自然杀伤细胞；所述肿瘤或癌症选自脑胶质瘤、黑色素瘤、内分泌肿瘤、腺瘤、母细胞瘤、硬纤维瘤、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、肾母细胞瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌或头颈癌中的一种或几种。
