本发明涉及基因工程，具体地，涉及一种荧光标记核苷酸在dna合成测序以及单分子测序中的应用。
背景技术：
1、人类基因组计划完成后，dna测序技术得到了迅速发展。dna测序(dnasequencing)是指分析特定dna片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)与鸟嘌呤(g)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的dna测序方法对于生物、医学等具有重要意义。
2、基于荧光标记核苷酸的dna合成测序以及单分子合成测序技术已经得到广泛应用，但是现有的核心荧光标记核苷酸在参与dna链延伸并断裂后，均不可避免地在碱基上有一段残基保留，该类残基随着多次测序循环的进行而不断累计，导致dna双链的构型、构象均发生变化，这是dna测序读长受限、错误率偏高的根本原因。发明人在前期工作中，发展了一种还原偶氮连接单元可用于dna合成测序(中国专利公开号cn103539697b)。但是该类连接单元的可逆终止核苷酸参与dna延伸、偶氮键断裂后留在碱基上的残基是一个除了苯氨基之外的很大的基团，在合成测序中，随着多次测序循环的累计，每一次测序循环都会留下这样一个基团，而这些基团的不断累积是导致dna读长受限以及错误率偏高的关键因素。所以设计、合成断裂后残基保留少，并且残基对后续dna延伸影响小的连接单元用于dna测序，具有非常重要的意义。
3、一般情况下，天然核苷酸比碱基修饰核苷酸在参与dna延伸时，是更好的延伸反应物，因此大多dna合成测序技术的研究方向是尽可能降低残基的影响，甚至消除残基，达到无痕测序，从而提高测序读长，降低错误率。
4、michal hocek等研究探讨了天然核苷酸与苯环、炔基或乙烯基等含π-电子基团修饰的核苷酸的延伸效果，最后得出结论和天然核苷酸相比，苯环、炔基或乙烯基等含π-电子基团修饰的核苷酸因为与bst等dna聚合酶有更好位点结合效应，因此延伸效果更好(angew.chem.int.ed.2014,53,7552-7555；acs chem.biol.2016,11,3165-3171)。然而，该文献只是比较了天然核苷酸与苯环、炔基或乙烯基等含π-电子基团结构修饰核苷酸，在参与dna链第一次延伸的结果，而dna测序要求多达几百次延伸才有实际意义，而多次延伸导致的dna链构型、构象的变化，是否仍然与聚合酶有更好的结合位点，是否仍然是更好的dna链延伸反应物，都是未知数的、是不可预料的；并且，其并不涉及偶氮结构，自然也不涉及偶氮相关结构的断裂研究。
技术实现思路
1、针对现有测序技术中的缺点，本发明的目的是提供一种新型荧光标记核苷酸及其在dna合成测序以及单分子测序中的应用。
2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
3、本发明提供了一种荧光可逆终止核苷酸，总的结构式如下所示：
4、
5、在该结构式中，base为u,c,a,g四个不同的碱基；r为苯环；cleavable linker为偶氮连接单元；r1是将偶氮连接单元与荧光素连接在一起的化学分子基团，dye是荧光染料。
6、作为本发明的一个实施方案，所述dye具体包括cy3，cy5，cy2，cy3.5，tamra，fitc，sulfo-cy3，sulfo-cy2，sulfo-cy5，sulfo-cy3.5等。
7、本发明提供了一种新型荧光标记可逆终止核苷酸，按照连接单元的种类可分为如下结构：
8、
9、本发明提供的荧光标记可逆终止核苷酸(结构式1)，r为苯环，r1为其中m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数。
10、作为本发明的一个具体实施方案，所述m为0～10中任一整数，n为0～10中任一整数。优选地，所述m为1～10中任一整数，n为1～10中任一整数。
11、作为本发明的一个具体实施方案，所述m＝1，n为0～10中任一整数。优选地，所述m＝1，n为1～10中任一整数。
12、更优地，结构式1具体结构如下所示：
13、
14、本发明还提供了一种基于偶氮的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，所述方法包括如下步骤：
15、s1、4-氨基苯硼酸频哪醇酯和化合物(m＝0～44)重氮化反应得到化合物
16、s2、化合物和化合物(n＝0～44)反应得到化合物
17、s3、化合物和化合物反应得到化合物
18、s4、化合物和化合物反应得到化合物
19、s5、化合物和cy3、cy5、cy2、cy3.5、tamra、fitc、sulfo-cy3、sulfo-cy2、sulfo-cy5或sulfo-cy3.5反应，即得所述荧光标记可逆终止核苷酸。
20、具体地，步骤s1中，化合物(m＝0～44)的制备路线如下：
21、
22、作为本发明的一个实施方案，步骤s1是在浓盐酸、脂肪醇、亚硝酸钠存在条件下进行重氮化反应的，反应温度为0-5℃。
23、优选地，步骤s1中，反应温度为0℃。
24、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述化合物是通过包括如下步骤的方法制备而得：
25、s2-1、在et3n和溶剂存在条件下，化合物和(boc)2o反应得到化合物其中，n＝0～44；
26、s2-2、在et3n和溶剂存在条件下，化合物和tscl反应得到化合物
27、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中所选溶剂包括ch2cl2。
28、作为本发明的一个实施方案，所述化合物的制备路线如下：
29、
30、步骤s2中，化合物的制备路线如下：
31、其中，
32、m＝0～44。
33、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述反应是在k2co3存在以及惰性气氛保护条件下进行的。
34、步骤s3中，化合物的制备路线如下：
35、其中，
36、m＝0～44，n＝0～44。
37、作为本发明的一个实施方案，步骤s3中反应是在pd(oac)2、tppts、cs2co3存在条件下进行的。
38、步骤s4中，所述化合物(m＝0～44，n＝0～44)的制备路线如下：
39、
40、作为本发明的一个实施方案，步骤s4中，所述化合物的制备包括如下步骤：
41、s4-1、化合物脱保护基得到化合物
42、s4-2、化合物和三氟乙酸乙酯反应得到化合物
43、s4-3、化合物和三正丁胺焦磷酸盐、化合物反应得到化合物
44、步骤s4-1中，所述脱保护基是在二氯甲烷和三氟乙酸存在条件下进行。
45、步骤s4-2中，所述反应是在三乙胺、有机醇条件下进行的。
46、本发明还提供了该类荧光标记核苷酸在dna合成测序和/或单分子测序中的应用。
47、本发明提供的偶氮荧光标记可逆终止核苷酸，在参与dna链延伸、断裂去除荧光基团后，残留于碱基上的基团仅为苯胺基。
48、中国专利cn117567536a中的荧光标记核苷酸，其核心断裂结构为具有三个连续氮原子的三氮烯结构，在酸性条件下断裂为芳基重氮盐和仲胺两个部分，其中芳基重氮盐部分经过nah2po2等还原剂还原释放一分子氮气后，变为芳基，如下为断裂反应机理：
49、
50、而本发明中荧光标记核苷酸的核心断裂结构为包含两个氮原子的偶氮苯，其在连二亚硫酸钠等还原剂处理下，断裂为两个苯胺基团，断裂反应机理如下所示：
51、
52、因为核心断裂结构不同，三氮烯和偶氮为不同基团，具有不同的化学性质，且断裂条件不同，cn117567536a中测序时三氮烯结构断裂残基为苯基，而本发明中偶氮结构断裂残基为苯胺。
53、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
54、1、本发明提出的基于偶氮连接单元的四色荧光标记可逆终止核苷酸，在参与dna链延伸、偶氮键断裂去除荧光基团后，在碱基上仅留下苯胺基。
55、2、本发明提供的基于偶氮连接单元的可逆终止核苷酸在dna合成测序及单分子测序的实践中发现，不论是延伸反应还是断裂实验，反应干净彻底，没有观察到副产物生成。
56、3、本发明所述基于偶氮连接单元的四色荧光标记可逆终止核苷酸，单分子测序实验结果表明，该类可逆终止核苷酸在dna测序的条件下，试剂结构稳定，多次测序循环后形成的dna双链的构型、构象仍然接近天然dna链的性质，单分子成像结果表明固定于flowcells表面的dna没有明显减少，即使经过多次延伸后的dna链，如果继续延伸，错误率并没有明显增加。这些性质表明本发明所述可逆终止核苷酸有望发展为长读长、低错误率单分子测序系统以及二代合成测序系统。
57、4、本发明所述可逆终止核苷酸，其中核苷三磷酸的碱基通过苯基连接的偶氮荧光标记核苷酸，合成所需原料已经商业化，非常容易获得，且反应过程、反应方法简单、高效，合成效率高，产物纯度高，最终产物只需要一次制备hplc纯化，即可得到高纯度(>99.9％纯度)可逆终止核苷酸，并且可大量合成，所以该类可逆终止核苷酸可用于更多的实验验证，从而可得到更多的实验数据，具有更大的实用价值和推广应用开发价值。
1.一种荧光标记可逆终止核苷酸，结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，所述dye选自cy3、cy5、cy2、cy3.5、tamra、fitc、sulfo-cy3、sulfo-cy2、sulfo-cy5或sulfo-cy3.5。
3.根据权利要求1所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，其结构式为：
4.根据权利要求3所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，所述m为0～10中任一整数，n为0～10中任一整数。
5.根据权利要求1所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，其结构式为：
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的荧光标记可逆终止核苷酸在dna合成测序和/或单分子测序中的用途。
7.一种根据权利要求1-5中任一项所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤s1是在浓盐酸、脂肪醇、亚硝酸钠存在条件下进行重氮化反应的，反应温度为0-5℃。
9.根据权利要求7所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤s2中，所述化合物是通过包括如下步骤的方法制备而得：
10.根据权利要求7所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤s4中，所述化合物的制备包括如下步骤：
