本发明属于核酸测序，更具体地，本发明涉及一种测定未知rna序列的方法。
背景技术：
1、rna序列信息常规可以通过rna测序方法获得，但目前rna测序需要构建cdna文库后进行二代测序，所需的周期较长且花费较大，不适用于针对特定某段未知序列rna的样品。
2、race技术可以用于获取rna的某一端序列信息。race技术即cdna末端快速扩增技术(rapid amplification ofcdna ends)，是一种基于逆转录pcr从样本中快速扩增cdna的5’端和3’端的技术。利用race可以通过已知的部分cdna序列来获得完整cdna的5’端或3’端。race需根据已知单侧序列可供设计特异性引物时，才能完成扩增。
3、race包括5’race和3’race，5’race是在基因特异性引物完成逆转录获得第一条cdna链，然后用末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)在cdna 3’端加poly(c)尾，再依据poly(c)尾设计特定引物与基因特异性引物完成5’端的扩增。而3’race是根据mrna的3’末端天然存在的poly(a)尾，利用oligo(dt)进行逆转录获得第一条链cdna链，随后以基因特异性引物和正义链3’末端引物为引物对来获得其3’端的扩增。
4、然而现有的3’race技术不适用于3’端不含poly(a)尾的rna，此外对于一段序列完全未知的rna，用目前的race技术也是无法获得其准确序列信息。
技术实现思路
1、基于此，本发明的目的在于提供一种测定未知rna序列的方法，采用本发明的方法，可以获得3’端不含poly(a)尾的rna以及完全未知的rna的序列信息。
2、实现上述发明目的的技术方案包括如下。
3、本发明的第一方面，提供了一种测定未知rna 3’端序列的方法，包括以下步骤：
4、(1)、利用t4 rnaligase2,truncated酶，将5’端腺苷化，3’封闭修饰的linker连接至待测rna的3’端；
5、(2)、采用与步骤(1)所述linker的互补序列作为引物，对步骤(1)的连接有linker的待测rna进行反转录，得到cdna；
6、(3)、以根据待测rna的5’端设计的引物作为反向引物，linker的互补序列+m13r序列作为正向引物，对步骤(2)的cdna进行pcr扩增；
7、(4)、对pcr产物进行sanger测序，即可测定未知rna的3’端序列。
8、本发明的第二方面，提供了一种测定未知rna全长序列的方法，包括以下步骤：
9、(1)、利用t4 rnaligase2,truncated酶，将5’端腺苷化，3’封闭修饰的linker连接至待测rna的3’端；
10、(2)、采用与步骤(1)所述linker的互补序列作为引物，对步骤(1)的连接有linker的待测rna进行反转录，得到cdna；
11、(3)、利用羧基磁珠，对步骤(2)的cdna进行纯化；
12、(4)、借助tdt，在经纯化后的cdna的3’端添加poly(c)尾；
13、(5)、以poly(c)尾的互补序列作为反向引物，linker的互补序列+m13r序列作为正向引物，对步骤(4)的cdna进行pcr扩增；
14、(6)、对pcr产物进行sanger测序，即可测定未知rna的全长序列。
15、本发明具有以下有益效果：
16、在本发明中，发明人经过不断探索，对现有的3’race方法进行了改进，先借助t4rna ligase2,truncated酶在rna的3’端特异性连接5’端腺苷化及3’封闭修饰的linker，再采用与linker互补的引物进行反转录获得cdna，从而可以根据5’端已知序列设计的引物和linker互补序列+m13r序列的引物，进行pcr扩增至rna的3’端，通过sanger测序，即可获得rna的3’端序列信息。
17、更进一步地，发明人将上述改进的3’race方法与现有的5’race方法相结合，并对一些关键步骤的关键工艺参数进行了优化(包括在连接linker之前对rna进行预变性，在连接linker时加入rna酶抑制剂，提高linker的投入量，缩短连接时间，pcr扩增时采用降落pcr等等)，只需要进行一次pcr(现有方法需要通过两轮pcr扩增才能获得目的片段)就可以获得任意一段未知序列rna的全片段pcr产物，进而通过常规sanger测序就可获得其rna全长序列信息。
18、本发明的测定未知rna序列的方法，不受限于特定类型的rna，可广泛应用于各种未知rna序列的研究，为研究者提供了一种灵活而高效的选择，且本发明方法易于操作、经济实惠，适用于各种科研需求。
1.一种测定未知rna 3’端序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的测定未知rna 3’端序列的方法，其特征在于，步骤(1)中所述linker与待测rna的摩尔浓度比为0.5～3:1；所述连接的反应条件为25±2℃孵育30～90min。
3.根据权利要求2所述的测定未知rna 3’端序列的方法，其特征在于，所述linker与待测rna的摩尔浓度比为2～3:1；所述连接的反应条件为25±2℃孵育30～40min。
4.一种测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，步骤(1)前还包括对待测rna进行变性的步骤，所述变性包括：将待测rna置于65±1℃孵育5±1min，取出后放于冰上冷却5±1min。
6.根据权利要求4所述的测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，步骤(1)中所述linker与待测rna的摩尔浓度比为0.5～3:1；所述连接的反应条件为25±2℃孵育30～90min；优选地，所述linker与待测rna的摩尔浓度比为2～3:1；所述连接的反应条件为25±2℃孵育30～40min。
7.根据权利要求4所述的测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，步骤(1)中所述连接的反应体系中加入rna酶抑制剂。
8.根据权利要求4所述的测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，步骤(5)中所述pcr扩增的反应体系包括：pcrmaster mix 25±1μl、正向引物1±0.1μl、反向引物1±0.1μl、cdna 1±0.1μl、无核酸酶水加至50μl；和/或，所述pcr扩增的反应程序为：98℃30sec；98℃10sec、65℃10sec、72℃1min，20pcr cycles，每个循环第二步降0.5℃；98℃10sec；55℃10sec、72℃1min，15pcr cycles；72℃5min。
9.根据权利要求8所述的测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，步骤(5)中所述pcr扩增后，还包括第二轮pcr扩增；所述第二轮pcr扩增的反应程序为：98℃30sec；98℃10sec、60℃10sec、72℃1min，35pcr cycles；72℃5min。
10.根据权利要求4所述的测定未知rna全长序列的方法，其特征在于，
