本发明属于生物，具体涉及一种生产甘露糖的工程菌株，其构建方法以及将其用于发酵生产甘露糖中的应用。
背景技术：
1、d-甘露糖作为一种功能性糖，广泛应用于食品、化妆品及医药行业中。是d-葡萄糖c2位上的差向异构体，常温下为白色晶体或结晶性粉末，低热量且具有清凉甜味，微苦。d-甘露糖主要存在于植物和细胞壁寡糖中。研究表明d-甘露糖作为添加剂用于畜禽饲料中，可以抑制沙门氏菌的感染，增加免疫力；而且d-甘露糖具有皮肤调理作用；此外，d-甘露糖还可以作为原料用于合成三氟甘露糖、d-甘露醇等药物。
2、目前，d-甘露糖的制备方式主要有化学合成法、植物提取法和生物法化学合成法主要是以钼酸或钼酸盐为催化剂，通过d-葡萄糖的异构化生成d-甘露糖，这种方法产率为32.13％。但是，化学合成法工艺复杂、生产成本较高，不适用于工业化大规模生产。植物提取法是通过对植物寡糖和多糖等进行水解、分离等手段来制备d-甘露糖。例如采用棕树籽经酸水解、碱中和、酶再水解、硅胶柱分离、离子树脂除盐和结晶五步反应得到d-甘露糖晶体，提取纯化后总收率为48.4％。以魔芋为原料，盐酸为催化剂，通过微波辐射技术制备d-甘露糖，产率最高为35.8％。但是，植物提取法能耗大，需要大量植物，生产受季节及地域的影响，且生产过程中有副产物，后续纯化操作工艺复杂。
3、目前具有很大应用潜力的是生物转化法，该方法采用异构酶催化实现单糖到甘露糖的转化。例如以d-果糖为底物，在来苏糖异构酶或者甘露糖异构酶的作用下，生成d-甘露糖，转化率为25％；以葡萄糖为底物，采用纤维二糖2-差向异构酶催化葡萄糖转化为甘露糖，转化率为15％。尽管生物转化法具有反应温和优势，但是转化率低，导致需要复杂的分离过程，造成甘露糖生产过程能耗高，成本昂贵。迫切需要开发具有高转化率的生物转化方法。
技术实现思路
1、基于上述需求，本发明通过筛选得到对甘露糖-6-磷酸具有较强催化活性和底物特异性的磷酸酶，进一步通过调控葡萄糖胞内代谢，通过降低果糖6-磷酸激酶的酶活性，增强甘露糖-6-磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸磷酸酶活性，获得的重组菌株可高效合成甘露糖，由此完成本发明。
2、本发明首先提供一种生产甘露糖的工程菌株，其包括下述任一项基因改造：敲除出妇菌中的果糖-6-磷酸激酶基因；过表达甘露糖-6-磷酸异构酶；过表达磷酸酶基因。
3、优选地，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因和磷酸酶基因来自于谷氨酸棒杆菌。
4、具体地，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因的kegg数据库登录号cgl0748；所述磷酸酶基因的登录号为wp_000106834。
5、更具体地，所述甘露糖-6-磷酸异构酶pmi基因的的核苷酸序列如seq id no:1；所述ynic基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
6、在具体实施方式中，所述过表达甘露糖-6-磷酸异构酶pmi基因和ynic基因是通过过表达质料导入大肠杆菌中实现。
7、所述出发菌选自大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母或解脂耶氏酵母。
8、本发明还提供所述生产甘露糖的工程菌株在合成甘露糖中的应用。
9、本发明进一步提供一种合成甘露糖的方法，其通过发酵所述生产甘露糖的工程菌株以产生甘露糖，任选包括分离所产生的甘露糖。
10、具体地，其以葡萄糖为底物；发酵是在37℃、200rmp条件下进行。
11、本发明也提供一种全细胞转化合成甘露糖的方法，其以所述生产甘露糖的工程菌株培养得到全细胞作为催化剂，以葡萄糖为底物，转化合成甘露糖。
12、具体地，所述全细胞的获得方法是将培养的菌液于以4℃、6000r/min离心10min收集菌体，用去离子水洗涤菌体，再用pbs缓冲液重悬菌体得到；所述转化合成甘露糖的条件是：全细胞的菌体量为od600＝30-80，反应温度为25-35℃，ph是5.0-7.0，底物浓度为30-90g/l。
13、本发明获得的有益效果如下：
14、(1)本发明通过微生物糖代谢路径分析，构建了可以高效表达生产甘露糖过程中关键酶基因的重组工程菌株，实现了发酵法规模化生产甘露糖的新路径。
15、(2)通过本发明所构建的工程菌株生产甘露糖，代谢过程中所产生的糖类副产物可被微生物作为营养成分利用，可实现反应过程中糖类的循环重复利用，有效提高原料转化率。
16、(3)本发明构建的工程菌株发酵生产阿洛酮糖及其衍生物时，由于微生物的代谢作用以及微生物胞内各种酶的表达水平的调控，有效抑制了最终产物中副产物的残留，可以得到组分单一的甘露糖，且具有很高的转化率(在一个具体实例中转化率达到60％以上)，有效解决了传统方法中产物分离成本高的问题。
17、总之，本发明与传统方法相比，转化率高、生产成本低，适合规模化生产甘露糖。
18、术语定义与说明
19、术语“基因”广义上用于指编码多肽或表达的rna的核酸分子(通常是dna，但任选地为rna)的任意片段。因此，基因包括编码表达的rna(其可以包括多肽编码序列或例如功能性rna，例如核糖体rna、trna、反义rna、微小rna、短发夹rna、核酶等)的序列。基因可以进一步包含其表达所需要的或影响其表达的调控序列，以及与其天然状态的蛋白质或rna编码序列相关的序列，例如内含子序列、5′或3′非翻译序列等。在一些实施例中，“基因”可能仅指dna或rna分子的蛋白质编码部分，其可能包含或可能不包含内含子。基因的长度优选为大于50个核苷酸，更优选地长度大于100个核苷酸，并且可以是例如长度为50个核苷酸至500,000个核苷酸，例如长度为100个核苷酸至100,000个核苷酸、或长度为约200个核苷酸至约50,000个核苷酸、或长度为约200个核苷酸至约20,000个核苷酸。基因可以获自多种来源，包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成。
20、术语“野生的”在本文中用于指在宿主中天然存在的核酸序列或氨基酸序列，或者在自然界中天然存在的未经人工基因改造或重组的宿主细胞。术语“非天然的”、“基因重组”在本文中用于指不在宿主中天然存在或不以其在宿主中天然构造的方式构造的核酸序列或氨基酸序列。如本文在提及基因片段或核酸分子时所使用的术语“重组”或“改造的”是指通过人为干预已被改变的核酸分子。作为非限制性实例，cdna是重组dna分子，如为通过体外聚合酶反应已经产生的或已经连接了接头或已经整合到载体(例如克隆载体或表达载体)中的任意核酸分子。
21、当应用于生物体时，本文中可互换使用的术语“转基因的”或“重组的”或“经改造的”或“经遗传改造的”或“工程菌”是指通过将外源或重组核酸序列引入生物体中而被操纵的生物体。通常，异源多核苷酸被稳定地整合到基因组中，使得多核苷酸被传递到后代，但其也可以存在于附加体上，并且可以存在于转基因生物体的合成染色体上。非天然多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分。在另一些实施例中，转基因微生物可以包括可操作地连接至转基因微生物的内源基因的引入的外源调控序列。非限制性实例包括基因敲除、靶向突变和基因置换、启动子置换、缺失或插入，以及将转基因引入生物体中。重组或经遗传改造的生物体也可以是引入了用于基因“敲除”的构建体的生物体。如本文所使用的“重组微生物”或“重组宿主细胞”、“工程菌”包括本发明重组微生物的后代或衍生物。
22、术语“载体”是指包含可选择的标记基因或允许载体在宿主细胞中复制的复制起点或自主复制序列(ars)中的至少一个的核酸分子，并且在一些实施例中包括可选择的标记基因和至少一个复制起点或ars两者。各种实施例中的“载体”、“重组载体”、“重组质粒”包含一个或多个表达序列和/或可以包含用于介导重组的至少一个序列。
23、本文中所引入的基因可以“来源于”指定的来源，其包括从指定来源分离(全部或部分)核酸区段，例如通过直接克隆、pcr扩增或从指定的多核苷酸来源或基于与指定的多核苷酸来源相关的序列人工合成，其可以是例如生物体种属。来源于特定来源或种属的基因或核酸分子或序列(例如，启动子)也包括相对于源核酸分子具有序列修饰的基因或核酸分子或序列。
24、如本文所使用的基因片段或序列的“连接”旨在表示两个或更多个序列之间的功能性连接，使得一个序列处或一个序列的活性影响其它序列处或其它序列的活性。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如，启动子)之间的可操作的连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。更进一步的，本文中基因片段的“连接”是指调控区和待转录的编码序列的定位，使得调控区对于调控目标编码序列的转录或翻译是有效的。
1.一种生产甘露糖的工程菌株，其特征在于，至少包括下述任一基因改造：
2.如权利要求1所述的生产甘露糖的工程菌株，其特征在于，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因和磷酸酶基因来自于谷氨酸棒杆菌。
3.如权利要求1所述的生产甘露糖的工程菌株，其特征在于，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因的kegg 数据库登录号cgl0748；所述磷酸酶基因的登录号为wp_000106834。
4.如权利要求1所述的生产甘露糖的工程菌株，其特征在于，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因的核苷酸序列如seq id no:1；所述磷酸酶基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
5.如权利要求1所述的生产甘露糖的工程菌株，其特征在于，所敲除采基因编辑如crispr-cas9基因编辑工具实现；
6.如权利要求1至5任一项所述生产甘露糖的工程菌株在合成甘露糖中的应用。
7.一种合成甘露糖的方法，其特征在于，通过发酵如权利要求1至5任一项所述生产甘露糖的工程菌株以产生甘露糖，任选包括分离所产生的甘露糖。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其以葡萄糖为底物；发酵是在37℃、200rmp条件下进行。
9.一种全细胞转化合成甘露糖的方法，其特征在于，以如权利要求1至5任一项所述生产甘露糖的工程菌株培养得到全细胞作为催化剂，以葡萄糖为底物，转化合成甘露糖。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞的获得方法是将培养的菌液于以4 ℃、6000 r/min离心10 min收集菌体，用去离子水洗涤菌体，再用pbs缓冲液重悬菌体得到；所述转化合成甘露糖的条件是：全细胞的菌体量为od600=30-80，反应温度为25-35℃，ph是5.0-7.0，底物浓度为30-90g/l。
