本发明属于生物医学，具体涉及一种用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物、载体及其应用。
背景技术：
1、基因编辑是一种通过片段敲除、片段插入和片段编辑等手段来精确改变生物体特定基因组dna从而改变其特性和功能的技术。主要基因编辑技术包括锌指核酸酶(znf)技术、转录激活因子样效应核酸酶(talen)技术和成簇的规律间隔短回文重复序列(crispr)技术，crispr/cas9基因编辑技术的发现和广泛应用，使基因组能够更简单、高效地完成碱基的删除、插入和替换。相较另外znf和talen技术，crispr/cas9系统的构建和使用克服了试验周期长和应用范围小的问题，并且具有同时对多个基因进行编辑修饰的巨大潜力。
2、猪繁殖与呼吸综合征是重点防治的一类传染病，又名蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的妊娠母猪流产、仔猪和育肥猪肺炎的急性传染病。cd163分子是prrsv生命周期中最重要、最关键的分子，cd163基因位于5号染色体上，包含18个外显子，编码1096个氨基酸。它由9个富半胱氨酸清道夫受体(srcr1～9)组成，蛋白结构域srcr5是prrsv感染所必需的。通过基因编辑敲除第七外显子所包含的功能域，能有效地抵御对prrsv的感染。
3、mstn基因位于15号染色体，包含3个外显子，编码375个氨基酸，mstn是由动物肌细胞产生的一种蛋白，对肌细胞的生长能产生抑制作用，它不仅抑制肌肉细胞的增殖和分化，而且决定了肌肉纤维的数量，是肌肉生长速度和瘦肉率的负调节因子。在mstn信号肽区域引入突变，可显著下调mstn基因的表达，增加肌纤维数量，促进肌肉生长。
4、因此，对猪cd163基因和mstn基因进行敲除在猪的经济性状改良中具有重要意义。但目前基因编辑对于多个基因同时敲除时，还存在不精准、效率较低等问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物、载体及其应用，用于解决现有基因编辑对于多个基因同时敲除时，还存在不精准、效率较低等问题。
2、在第一方面，本发明提供了一种用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物，sgrna组合物包括sgrna1、sgrna2、sgrna3、sgrna4；其中，sgrna1的核苷酸序列如seq idno:5-6所示，sgrna2的核苷酸序列如seq id no:7-8所示，sgrna3的核苷酸序列如seq idno:9-10所示，sgrna4的核苷酸序列如seq id no:11-12所示。
3、进一步地，猪cd163基因的编辑位点包括如seq id no:1-2所示的核苷酸序列，猪mstn基因的编辑位点包括如seq id no:3-4所示的核苷酸序列。
4、在第二方面，本发明提供了一种用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子trna-sgrna，多顺反子trna-sgrna由包括如下所示的片段：trna-上述sgrna1-sgrna scaffold、trna-上述sgrna2-sgrna scaffold、trna-上述sgrna3-sgrna scaffold、trna-上述sgrna4-sgrna scaffold进行可操作地连接得到；其中，trna的核苷酸序列如seq id no:13所示。
5、进一步地，多顺反子trna-sgrna的核苷酸序列如seq id no:14所示。
6、在第三方面，本发明提供了一种用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子载体，多顺反子载体是以pspcas9(bb)-2a-puro载体为骨架，并与上述任一项多顺反子trna-sgrna进行可操作地连接得到。
7、在第四方面，本发明提供了一种猪cd163、mstn双基因突变细胞系的制备方法，包括如下步骤：1)将上述多顺反子载体转化至宿主菌中，筛选阳性宿主菌，并提取质粒；2)将质粒转染猪体细胞，筛选阳性细胞后，得到猪cd163、mstn双基因突变细胞系。
8、进一步地，步骤2)中，猪体细胞包括猪肾成纤维细胞。
9、在第五方面，本发明提供了上述任一项制备方法制备得到的cd163、mstn双基因突变细胞系。
10、进一步地，cd163基因突变和mstn基因突变均为双位点编辑致片段缺失。
11、在第六方面，本发明提供了上述任一项用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物、上述任一项用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子trna-sgrna、上述用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子载体、上述猪cd163、mstn双基因突变细胞系在猪种质改良中的应用。
12、本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明通过分别对猪cd163、mstn基因设计基因编辑双靶位点，该靶位点均能被cas9核酸内切酶特异性识别，从而介导双链断裂，在自我修复系统的作用下通过非同源末端连接的方式使基因发生突变，然后设计sgrna组合物，并且以trna-sgrna-sgrna scaffold为最小重复单元，利用ptg/cas9策略构建cas9-cd163-mstn多顺反子载体，从而实现了高效、精准地敲除靶基因，因此，在猪种质改良中具有较好的应用前景。
1.一种用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物，其特征在于，所述sgrna组合物包括sgrna1、sgrna2、sgrna3、sgrna4；
2.根据权利要求1所述的用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物，其特征在于，所述猪cd163基因的编辑位点包括如seq id no:1-2所示的核苷酸序列，所述猪mstn基因的编辑位点包括如seq id no:3-4所示的核苷酸序列。
3.一种用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子trna-sgrna，其特征在于，所述多顺反子trna-sgrna由包括如下所示的片段：trna-权利要求1所述的sgrna1-sgrna scaffold、trna-权利要求1所述的sgrna2-sgrna scaffold、trna-权利要求1所述的sgrna3-sgrnascaffold、trna-权利要求1所述的sgrna4-sgrna scaffold进行可操作地连接得到；
4.根据权利要求3所述的用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子trna-sgrna，其特征在于，所述多顺反子trna-sgrna的核苷酸序列如seq id no:14所示。
5.一种用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子载体，其特征在于，所述多顺反子载体是以pspcas9(bb)-2a-puro载体为骨架，并与权利要求3或4所述的多顺反子trna-sgrna进行可操作地连接得到。
6.一种猪cd163、mstn双基因突变细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求7所述的cd163、mstn双基因突变细胞系的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述猪体细胞包括猪肾成纤维细胞。
8.权利要求6或7所述的制备方法制备得到的cd163、mstn双基因突变细胞系。
9.根据权利要求8所述的cd163、mstn双基因突变细胞系，其特征在于，所述cd163基因突变和所述mstn基因突变均为双位点编辑致片段缺失。
10.权利要求1或2所述的用于敲除猪cd163、mstn基因的sgrna组合物、权利要求3或4所述的用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子trna-sgrna、权利要求5所述的用于敲除猪cd163、mstn基因的多顺反子载体、权利要求9所述的猪cd163、mstn双基因突变细胞系在猪种质改良中的应用。
