本发明属于生物酶催化合成，具体涉及一种生物酶催化合成水杨酸乙酯及其类似物乙酯的方法。
背景技术：
1、水杨酸乙酯为具有类似冬青特殊芳香气味的无色液体，是一类具有重要工业用途的酯类化合物，广泛应用于日用香料、有机合成与工业溶剂等领域。
2、水杨酸乙酯的类似物如苯甲酸乙酯是一种重要的食品香精成分，它可以为食品增添淡雅的水果和花香味，也可以用于调配其他口味。同时苯甲酸乙酯也是一种常见的有机合成与医药化合物中间体，可用于精细化工生产和药物分子结构修饰。
3、对于其他水杨酸乙酯似物，它们在工业上也有许多用途，如类似物5-甲基水杨酸乙酯，在药物工业和香料工业中具有一定的应用价值，药物工业中它常被用作局部麻醉药物和外用止痛剂的原料，香料工业中由于其芳香气味，常被用于香精香料的制备；再如类似物对甲基苯甲酸乙酯广泛用于溶剂和络合剂的生产，可用于合成树脂、涂料、胶粘剂、油墨等，也被用作医药中间体，用于合成一些药物作为反应中间体等。
4、在工业上，水杨酸乙酯及其类似物乙酯多采用无机催化剂催化水杨酸及其对应的类似物酸和乙醇酯化合成的方式进行规模化生产。对于水杨酸乙酯的合成，常用的催化剂有硫酸、固体超强酸、对甲基苯磺酸、硫酸氢钠等。固体超强酸的制备过程繁冗，耗时长，重复利用率低；对甲基苯磺酸的酯化率偏低，易引入杂质；硫酸氢钠的催化条件苛刻，酯化率不理想。故上述3种催化剂在实际生产过程中不常使用，目前常采用硫酸催化合成生产水杨酸乙酯。但是传统的硫酸催化法存在产率偏低、产品纯度不高、乙醇耗量过大、容易对环境造成污染等缺点。
5、水杨酸乙酯类似物如苯甲酸乙酯的合成也是以无机催化剂如硫酸、氯化铁、对甲基苯磺酸催化苯甲酸和乙醇反应生成。然而这些催化剂仍然存在污染环境、分离纯化困难以及产率低等问题。
6、因此，开发一种反应条件温和，操作简便，污染小，绿色安全，且产品纯度高的生物酶催化合成水杨酸乙酯及其类似物的合成至关重要。
技术实现思路
1、为解决上述技术缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种反应条件温和，操作简便，污染小，绿色安全，且产品纯度高的生物酶催化合成水杨酸乙酯及其类似物的方法。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种生物酶催化合成水杨酸乙酯及其类似物乙酯的方法，其以水杨酸甲酯及其类似物甲酯和乙醇为原料，以sabp2为催化剂，催化水杨酸甲酯及其类似物甲酯转化成水杨酸乙酯及其类似物乙酯。
3、本发明通过如下技术方案来实现：
4、步骤1、提供具有较高转化率和催化活性以及非常广底物谱的水杨酸结合蛋白酶2(sabp2)。
5、进一步地，提供编码sabp2的基因。
6、进一步地，提供携带上述基因的载体。
7、进一步地，提供表达上述基因的微生物细胞。
8、在一种实施方式中，重组菌以pet-21a(+)为表达载体。
9、在一种实施方式中，重组菌以bl21(de3)为宿主菌。
10、步骤2、探究步骤1中得到的sabp2催化水杨酸乙酯合成的最适乙醇浓度，优选为30％。
11、步骤3、探究步骤1中得到的sabp2催化水杨酸乙酯合成的最适温度，优选为30℃。
12、步骤4、探究步骤1中得到的sabp2催化水杨酸乙酯合成的最适ph，优选为7.4。
13、进一步地，得到sabp2催化水杨酸乙酯及其类似物乙酯合成的最适条件为乙醇浓度30％，温度30℃，ph7.4。
14、进一步地，以得到的sabp2催化水杨酸乙酯合成的最适条件为sabp2催化水杨酸乙酯类似物乙酯合成的条件，催化水杨酸乙酯类似物的合成。
15、优选地，sabp2催化水杨酸乙酯及其类似物乙酯合成的具体实施过程如下：在反应容器先加入一定浓度的水杨酸甲酯及其类似物，再加入30％的乙醇和0.1m ph7.4 pb，震荡混匀，最后加入一定浓度的sabp2，立即将反应容器于30℃水浴条件下反应一定的时间，hplc检测转化率。
16、步骤5、高效液相色谱(hplc)测定最适条件下0.067um sabp2在不同时间下催化1mm水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的转化率。
17、步骤6、hplc测定最适条件下0.67um sabp2在不同时间下催化1mm水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的转化率。
18、步骤7、hplc测定最适条件下0.067um sabp2在不同时间下催化30mm水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的转化率。
19、步骤8、不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化水杨酸甲酯类似物转化成水杨酸乙酯类似物。
20、在本发明的一种较佳实例1中，详细说明了细菌培养基于实验室及的配制。
21、在本发明的一种较佳实例2中，详细说明了sabp2重组质粒的获得。
22、在本发明的一种较佳实例3中，详细说明了大肠杆菌原核表达sabp2的过程。
23、在本发明的一种较佳实例4中，详细说明了ni-琼脂糖凝胶6ff(his标签纯化树脂)纯化sabp2的过程。
24、在本发明的一种较佳实例5中，详细说明了sds-page鉴定sabp2纯度的过程。
25、在本发明的一种较佳实例6中，详细说明了sabp2蛋白浓度测定。
26、在本发明的一种较佳实例7中，详细说明了hplc测定sabp2催化水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的最适乙醇浓度。
27、在本发明的一种较佳实例8中，详细说明了hplc测定sabp2催化水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的最适温度。
28、在本发明的一种较佳实例9中，详细说明了hplc测定sabp2催化水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的最适ph。
29、在本发明的一种较佳实例10中，详细说明了hplc测定sabp2催化水杨酸甲酯水解生成sa和转化生成水杨酸乙酯初速度对比。
30、在本发明的一种较佳实例11中，详细说明了hplc测定最适条件下0.067um sabp2在不同时间下催化1mm水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的转化率。在本发明的一种较佳实例12中，详细说明了sabp2蛋白浓度测定。
31、在本发明的一种较佳实例12中，详细说明了hplc测定最适条件下0.67um sabp2在不同时间下催化1mm水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的转化率。
32、在本发明的一种较佳实例13中，详细说明了hplc测定最适条件下0.067um sabp2
33、在不同时间下催化30mm水杨酸甲酯转化成水杨酸乙酯的转化率。
34、在本发明的一种较佳实例14中，详细说明了hplc测定最适条件下0.067um sabp2在不同时间下催化1mm苯甲酸甲酯转化成苯甲酸乙酯的转化率。
35、在本发明的一种较佳实例15中，详细说明了hplc测定最适条件下0.67um sabp2在不同时间下催化1mm苯甲酸甲酯转化成苯甲酸乙酯的转化率。
36、在本发明的一种较佳实例16中，详细说明了hplc测定最适条件下0.067um sabp2在不同时间下催化30mm苯甲酸甲酯转化成苯甲酸乙酯的转化率。
37、在本发明的一种较佳实例17中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化3-甲基水杨酸甲酯转化生成3-甲基水杨酸乙酯。
38、在本发明的一种较佳实例18中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化4-甲基水杨酸甲酯转化生成4-甲基水杨酸乙酯。
39、在本发明的一种较佳实例19中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化5-甲基水杨酸甲酯转化生成5-甲基水杨酸乙酯。
40、在本发明的一种较佳实例20中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化5-甲氧基水杨酸甲酯转化生成5-甲氧基水杨酸乙酯。
41、在本发明的一种较佳实例21中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化5-乙酰水杨酸甲酯转化生成5-乙酰水杨酸乙酯。
42、在本发明的一种较佳实例22中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化邻甲基苯甲酸甲酯转化生成邻甲基苯甲酸乙酯。
43、在本发明的一种较佳实例23中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化邻乙氧基苯甲酸甲酯转化生成邻乙氧基苯甲酸乙酯。
44、在本发明的一种较佳实例24中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化2,3-二甲基苯甲酸甲酯转化生成2,3-二甲基苯甲酸乙酯。
45、在本发明的一种较佳实例25中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化2,4-二羟基苯甲酸甲酯转化生成2,4-二羟基苯甲酸乙酯。
46、在本发明的一种较佳实例26中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化3-甲基苯甲酸甲酯转化生成3-甲基苯甲酸乙酯。
47、在本发明的一种较佳实例27中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化3-乙炔苯甲酸甲酯转化生成3-乙炔苯甲酸乙酯。
48、在本发明的一种较佳实例28中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化3-乙酰苯甲酸甲酯转化生成3-乙酰苯甲酸乙酯。
49、在本发明的一种较佳实例29中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化3,5-二甲基苯甲酸甲酯转化生成3,5-二甲基苯甲酸乙酯。
50、在本发明的一种较佳实例30中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化对甲基苯甲酸甲酯转化生成对甲基苯甲酸乙酯。
51、在本发明的一种较佳实例31中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化对叔丁基苯甲酸甲酯转化生成对叔丁基苯甲酸乙酯。
52、在本发明的一种较佳实例32中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化4-乙烯苯甲酸甲酯转化生成4-乙烯苯甲酸乙酯。
53、在本发明的一种较佳实例33中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化对4-乙炔苯甲酸甲酯转化生成4-乙炔苯甲酸乙酯。
54、在本发明的一种较佳实例34中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化4-甲酸甲酯苯基乙酸甲酯转化生成对4-甲酸乙酯苯基乙酸乙酯。
55、在本发明的一种较佳实例35中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化4-羟基异邻苯二甲酸二甲酯转化生成对4-羟基异邻苯二甲酸二乙酯。
56、在本发明的一种较佳实例36中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化间苯二甲酸二甲酯转化生成间苯二甲酸二乙酯。
57、在本发明的一种较佳实例37中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化对苯二甲酸二甲酯转化生成对苯二甲酸二乙酯。
58、在本发明的一种较佳实例38中，详细说明了不同酶浓度(0.067um、0.335um、0.67um)sabp2催化1,3,5-苯三甲酸三甲酯转化生成间1,3,5-苯三甲酸三乙酯。
1.一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于以水杨酸甲酯及其类似物甲酯为原料，在有乙醇存在的条件下，以水杨酸结合蛋白酶2(sabp2)作催化剂，催化酯交换反应，将水杨酸甲酯及其类似物甲酯转化成水杨酸乙酯及其类似物乙酯；
2.根据权利要求1的水杨酸甲酯及其类似物甲酯结构通式，所述水杨酸甲酯及其类似物甲酯选自：水杨酸甲酯、苯甲酸甲酯、3-甲基水杨酸甲酯、4-甲基水杨酸甲酯、5-甲基水杨酸甲酯、5-甲氧基水杨酸甲酯、5-乙酰水杨酸甲酯、邻甲基苯甲酸甲酯、邻乙氧基苯甲酸甲酯、2,3-二甲基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、3-甲基苯甲酸甲酯、3-乙炔苯甲酸甲酯、3-乙酰苯甲酸甲酯、3,5-二甲基苯甲酸甲酯、对甲基苯甲酸甲酯、对叔丁基苯甲酸甲酯、4-乙烯苯甲酸甲酯基、4-乙炔苯甲酸甲酯基、4-甲酸甲酯苯基乙酸甲酯、4-羟基异邻苯二甲酸二甲酯、对苯二甲酸二甲酯、间苯二甲酸二甲酯、1,3,5-苯三甲酸三甲酯。
3.根据权利要求1所述的一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于，所述水杨酸结合蛋白酶2(sabp2)的基因序列为：
4.根据权利要求1所述的一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于，所述sabp2以pet-21a(+)为表达载体在大肠杆菌中表达合成。
5.根据权利要求1所述的一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于，所述反应温度优选为30℃。
6.根据权利要求1所述的一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于，所述反应ph优选为7.4。
7.根据权利要求1所述的一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于，所述反应乙醇浓度优选为30％。
8.根据权利要求1所述的一种生物酶催化合成水杨酸乙酯类化合物的方法，其特征在于，具体实施过程如下：在反应器先中加入水杨酸甲酯或其类似物、30％乙醇和0.1m ph7.4pb缓冲液，震荡混匀，加入sabp2开始反应，hplc检测转化率。
