本发明属于生物医用材料，涉及一种肺靶向可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
1、小干扰rna(sirna)药物利用rna干扰作用诱导目标基因翻译所需mrna降解，从而使相应蛋白质的表达在靶细胞中沉默，在疾病治疗中具有广泛的应用前景。但是，sirna药物自身缺点是其临床应用的最大挑战，主要包括以下几个方面：(1)由于sirna药物是由21-23个核苷酸片段组成，而在组织或细胞中存在大量核酶，自由的sirna药物易被核酶降解失活；(2)sirna药物组织和细胞靶向能力差，在体内循环中主要是被肾脏排出；(3)sirna药物的磷酸骨架使其带有负电荷，与带有负电荷的细胞膜间存在排斥作用，导致sirna药物入胞能力差。由于以上缺点，sirna药物无法有效进入细胞质发挥药效，严重影响其治疗效果。
2、针对sirna药物在应用中的不足，目前主要的应对策略是采用具有良好选择性、安全性和高效性的sirna药物输递系统。2018年，第一款sirna药物patisiran上市，是由四种脂质分子和sirna药物组成的可电离脂质纳米颗粒。sirna药物被包裹在可电离脂质纳米颗粒中，以保护它不被内源性核酶降解，并促进其靶向递送至肝脏。然而，目前尚无肺靶向可电离脂质纳米颗粒sirna药物上市，限制了sirna药物在肺相关疾病治疗方面的应用。
3、综上所述，提供一种肺靶向可电离脂质纳米颗粒，对于sirna药物治疗应用具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种肺靶向可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用，所述可电离脂质纳米颗粒包含可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、磷脂两性离子聚合物衍生物以及sirna药物。该可电离脂质纳米颗粒生物安全性好，可以增强sirna药物在肺部的富集，显著提高sirna药物对肺相关疾病的治疗效果。
2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种肺靶向可电离脂质纳米颗粒，所述可电离脂质纳米颗粒包含可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、磷脂两性离子聚合物衍生物以及sirna药物。
4、本发明中，可电离脂质分子结构含有可电离的氨基，在生理条件(ph＝7.4)不带电，在酸性条件带有正电荷，利用与负电荷sirna药物间的静电作用包裹sirna进行体内递送。在血液中呈电中性，减少与血浆蛋白等生物分子的非特异性吸附，提高生物相容性。在胞质内涵体酸性条件发生质子化带正电荷，与负电荷脂质相互作用，促进可电离脂质纳米颗粒逃离内涵体，将sirna药物释放到细胞质中发挥基因沉默作用。
5、优选地，所述可电离脂质选自4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(dlin-mc3-dma)、1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-o-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯(sm-102)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)之一。
6、本发明中，辅助脂质可以调节可电离脂质纳米颗粒双分子层的流动性，通过增强可电离脂质纳米颗粒与细胞膜的融合来提高递送效率。
7、优选地，所述辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dppc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)之一。
8、本发明中，磷脂两性离子聚合物衍生物利用两性离子聚合物与水分子间的静电相互作用，提高可电离脂质纳米颗粒稳定性，延长可电离脂质纳米颗粒体内半衰期。同时，两性离子聚合物调节可电离脂质纳米颗粒的pka值和表面电荷分布，进而影响可电离脂质纳米颗粒的生物分布，实现sirna药物的肺靶向递送。
9、优选地，所述磷脂两性离子聚合物衍生物选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-聚羧基甜菜碱(dmg-pcb)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-聚磺酸甜菜碱(dmg-psb)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(dmg-pmpc)之一。
10、优选地，所述磷脂两性离子聚合物的聚合度为1～500的任意整数，，优选为5～100的任意整数，进一步优选为10～50的任意整数。
11、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
12、(1)将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和磷脂两性离子聚合物衍生物分别溶解在乙醇中，以一定摩尔比混合，得到总脂质有机相；
13、(2)将sirna药物溶解在depc水中，得到一定浓度的sirna水溶液；
14、(3)将所述sirna水溶液和酸性缓冲液按一定体积比混合，得到sirna水相；
15、(4)按照总脂质分子和sirna一定质量比，将所述总脂质有机相和sirna水相快速混合，混合液静置孵育；
16、(5)上述混合液加入3500da透析袋，以1×磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)为外水相，透析后得肺靶向可电离脂质纳米颗粒。
17、优选地，步骤(1)所述四种脂质分子乙醇溶液总脂质质量浓度为0.1～50μg/μl，优选为0.1～30μg/μl，进一步优选为1～20μg/μl。
18、优选地，步骤(1)所述可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：磷脂两性离子聚合物衍生物的摩尔比为50：10：38.5：(0.1～20)，优选为50：10：38.5：(0.5～15)，进一步优选为50：10：38.5：(1～10)。
19、优选地，步骤(2)所述sirna水溶液质量浓度为0.1～2.0μg/μl，，优选为0.2～1.0μg/μl，进一步优选为0.3～0.8μg/μl。
20、优选地，步骤(3)所述酸性缓冲溶液的ph小于7.4，(前后矛盾)，优选为2～7，进一步优选为2～6，更优选为3～5.5。
21、优选地，所述酸性缓冲溶液包括甘氨酸-盐酸缓冲溶液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液或tris-盐酸缓冲溶液中的任意一种，优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液中的任意一种。
22、优选地，步骤(3)所述sirna水溶液和酸性缓冲液的体积比为1：(1～20)，优选为1：(1～10)，进一步优选为1：(2～8)。
23、优选地，步骤(4)所述总脂质分子与sirna药物的质量比为(1～100)：1，，优选为(5～60)：1，进一步优选为(10～30)：1。
24、优选地，步骤(4)所述混合的时间为1～60min，优选为5～40min，进一步优选为10～30min；
25、优选地，步骤(5)所述透析的时间为0.5～24h，优选为1～12h，进一步优选为2～8h；
26、优选地，步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)所述的混合温度、步骤(2)所述的溶解温度、步骤(5)所述的透析温度均为10～60℃。，优选为20～50℃，进一步选为25～40℃。
27、作为优选的技术方案，所述肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
28、(1)在10～60℃温度下将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和磷脂两性离子聚合物衍生物按照总质量浓度0.1～50μg/μl，以可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：磷脂两性离子聚合物衍生物的摩尔比为50：10：38.5：(0.1～20)溶解在乙醇中，得到总脂质有机相；
29、(2)在10～60℃温度下将sirna药物按照质量浓度为0.1～2.0μg/μl溶解在depc水中，得到sirna水溶液；
30、(3)在10～60℃温度下将所述sirna水溶液和ph小于7.4酸性缓冲液按体积比为1：(1～20)混合，得到sirna水相；
31、(4)在10～60℃温度下按照总脂质分子和sirna药物质量比为(1～100)：1，将所述总脂质有机相和sirna水相快速混合，混合液静置孵育1～60min；
32、(5)上述混合液加入3500da透析袋，以1×磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)为外水相，于10～60℃透析0.5～24h，得到肺靶向可电离脂质纳米颗粒。
33、第三方面，本发明提供了第一方面所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒在肺相关疾病方面的治疗应用，包括但不限于肺癌、肺炎、急性肺损伤、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等。
34、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
35、(1)本发明的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，可电离脂质与sirna药物产生静电相互作用，形成高效包载sirna药物的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，可以增强sirna药物的稳定性，且生物安全性好；
36、(2)本发明的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，将sirna药物高效递送至肺部，实现sirna药物肺靶向递送；
37、(3)本发明的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，sirna药物高效进入细胞，下调致病蛋白表达，在肺相关疾病治疗领域具有广阔的发展前景。
1.一种肺靶向可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，包含可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、磷脂两性离子聚合物衍生物以及sirna药物。
2.根据权利要求1所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，所述可电离脂质选自4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(dlin-mc3-dma)、1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-o-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯(sm-102)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)之一。
3.根据权利要求1所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，所述辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dppc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)之一。
4.根据权利要求1所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，所述磷脂两性离子聚合物衍生物选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-聚羧基甜菜碱(dmg-pcb)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-聚磺酸甜菜碱(dmg-psb)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(dmg-pmpc)之一。
5.根据权利要求4所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，所述磷脂两性离子聚合物的聚合度为1～500的任意整数。
6.根据权利要求1所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述四种脂质分子乙醇溶液总脂质质量浓度为0.1～50μg/μl；
8.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述sirna水溶液质量浓度为0.1～2.0μg/μl。
9.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酸性缓冲溶液的ph小于7.4；所述酸性缓冲溶液包括甘氨酸-盐酸缓冲溶液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液或tris-盐酸缓冲溶液中的任意一种。
10.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述sirna水溶液和酸性缓冲液的体积比为1：(1～20)。
11.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述总脂质分子与sirna药物的质量比为(1～100)：1，所述混合的时间为1～60min。
12.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述透析的时间为0.5～24h。
13.根据权利要求6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)所述的混合温度、步骤(2)所述的溶解温度、步骤(5)所述的透析温度均为10～60℃。
14.根据权利要求1或6所述的肺靶向可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
