本发明涉及牛痘病毒加帽酶加工，具体涉及到一种牛痘病毒加帽酶纯化的方法。
背景技术：
1、真核生物中mrna经转录后修饰在5′端形成一个特殊结构，即帽子结构，如图1所示，该结构对mrna的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。
2、牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由d1和d12两个亚基组成，兼具rna三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性。牛痘病毒加帽酶可应用在mrna生产过程中，在体外合成的mrna添加一些基本结构元件才能达到与真核细胞mrna相似的效果，如在其蛋白编码的开放阅读框(orf)5’端添加m7gpppn结构，即7-甲基鸟苷帽结构和3’端poly(a)尾以促进mrna的稳定性。
3、如图2所示，牛痘病毒加帽酶由两个亚基(d1和d12)组成，蛋白分子量d1为98kda、d12为33kda。d1亚基执行rna三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，d12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的cap0结构m7gppp5′n都是必须的。
4、在现有技术中，重组牛痘病毒加帽酶是指通过基因工程技术将牛痘病毒的加帽酶基因导入宿主细胞，使其在宿主细胞中表达和合成。这一过程旨在利用宿主细胞的生物合成机制来产生大量的牛痘病毒加帽酶蛋白。
5、重组牛痘病毒加帽酶一般利用大肠杆菌发酵表达，其蛋白表达方式为双亚基共同表达的非共价键连接形式。在这个重组过程中，存在如下缺陷：
6、其一，由于牛痘病毒加帽酶蛋白的分子量偏大且极易降解的特性，不利于大肠杆菌的可溶性表达，导致发酵后的表达量低，纯化生产难度增加，最终产品产量低，增加mrna生产成本。
7、其二，发酵后的纯化环节通过菌体破碎、层析、超滤等方式可获得符合质量要求的产品，市面上牛痘病毒加帽酶纯化方法一般包括：菌体破碎澄清、ni亲和层析、超滤换液、阳离子层析、阴离子复合模式层析、阳离子、分子筛，工艺步骤的复杂程度高，纯化收率偏低，生产周期长等缺点。由于工艺步骤的复杂、产品易降解的特性可能会导致纯化回收率很低，从而增加生产成本。
8、因此，存在待改进之处，本发明提供一种牛痘病毒加帽酶纯化的方法。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的不足，本发明目的在于提出一种牛痘病毒加帽酶纯化的方法，具体方案如下：
2、一种牛痘病毒加帽酶纯化的方法，所述方法包括如下步骤：
3、步骤a：将重组表达菌体进行破碎、离心过滤，收集上清；
4、步骤b：将步骤a的过滤上清进行ni亲和层析捕获，得到洗脱样品；
5、步骤c：将步骤b的洗脱样品采用阳离子层析进一步纯化；
6、步骤d：将步骤c的洗脱样品采用疏水层析进一步纯化，sec-hplc纯度符合预期；
7、步骤e：将步骤d的洗脱样品经过超滤换液装置超滤换液后保存至保存液中。
8、其中，所述步骤a的具体过程为：
9、(1)将重组表达菌体与破菌缓冲液按照1：7比例室温重悬1-3h；
10、(2)重悬后的菌体经过高压均质机进行破碎，高压均质机破碎参数为：800bar，3次；
11、(3)对破碎后的菌体进行离心，离心参数为8000rpm、4℃、1h，离心2次；
12、(4)采用0.45μm过滤器对离心上清进行过滤。
13、具体的，所述破菌缓冲液的组分为：20mm pb，50mm nacl，1mm edta·2na·2h2o，10％甘油，ph8.0。
14、需要说明的是，步骤a的作用为将重组表达菌体裂解，释放其内部的细胞器和溶质，从而获得目标蛋白质或其他细胞成分。其中的20mm磷酸盐缓冲液(pb)是用于为破碎后的目标蛋白提供一个缓冲环境，其中的50mm氯化钠(nacl)为了避免ni亲和层析上样过程中，杂质非特异性的吸附在ni亲和层析柱上；1mm edta·2na·2h2o是螯合剂，可以螯合金属离子，有助于防止一些金属依赖的核酸酶(如核酸酶)在细胞破裂过程中活跃，从而保护细胞内的核酸分子；10％甘油的存在在破菌缓冲液中作为保护剂，可以减缓蛋白质的降解，有利于维持蛋白质的完整性；甘油也可以在细胞破裂后提高溶解度，有助于分离和纯化目标蛋白质。
15、其中，所述步骤b的具体过程为：
16、采用纯化水和0.5m naoh溶液清洗层析系统和层析柱，再用0.1m niso4溶液对层析柱进行挂镍处理，随后用ni亲和层析结合缓冲液平衡层析柱，上样，上样结束后先用ni亲和层析结合缓冲液清洗层析柱，再用ni亲和层析洗涤缓冲液清洗层析柱，最后用ni亲和层析结合缓冲液和ni亲和层析洗脱缓冲液等度洗脱，梯度设置为5％、10％、25％、50％、100％。
17、具体的，在步骤b中，层析柱采用ni-nta-hp的层析柱；
18、ni亲和层析结合缓冲液的组分为20mm pb，50mm nacl，1mm edta·2na·2h2o，10％甘油，ph8.0；
19、ni亲和层析洗涤缓冲液组分为20mm pb，500mm nacl，1mm edta·2na·2h2o，10％甘油，ph8.0；
20、ni亲和层析洗脱缓冲液组分为20mm pb，1mm edta·2na·2h2o，1m咪唑，10％甘油，ph8.0。
21、需要说明的是，步骤b主要是ni亲和层析捕获，亲和层析是一种分离和纯化生物分子的技术，其中通过目标分子与特定亲和配体之间的选择性相互作用来实现分离。该步骤使用了镍(ni)离子作为亲和配体，使用纯化水和0.5m naoh溶液清洗层析系统和层析柱，目的是准备层析系统，并确保层析柱表面没有杂质；再使用0.1m niso4溶液对层析柱进行挂镍处理，目的是在层析柱上引入镍离子，以便与目标分子发生亲和相互作用；使用ni亲和层析结合缓冲液平衡层析柱，平衡的过程是为了确保层析柱内的镍离子准备好与目标分子结合；上样是为了向层析柱中添加待分离的样品；之后是清洗层析柱，先使用ni亲和层析结合缓冲液清洗层析柱，然后使用ni亲和层析洗涤缓冲液进一步清洗，目的是去除结合不牢固的杂质；最后，采用结合缓冲液和洗脱缓冲液等度洗脱，使目标分子从层析柱中洗脱，这一步是分离和纯化目标分子的关键步骤。
22、与步骤a中的破菌缓冲液不同的是，ni亲和层析洗脱缓冲液还用到了咪唑，咪唑在ni亲和层析中的主要作用是能够与目标蛋白竞争性的结合层析介质(通常是镍柱)，起到竞争性解离作用，1m咪唑的高浓度还能够有效地洗脱与层析介质结合的蛋白。这种洗脱条件是通过调整咪唑浓度，从而影响蛋白质与镍柱之间的相互作用，使蛋白质从层析柱上解吸和洗脱。
23、咪唑的加入还可以用来调整洗脱缓冲液的条件，以确保洗脱是特异性和高效的。通过优化咪唑的浓度和其他洗脱缓冲液的组成，可以达到最佳的洗脱效果。
24、其中，所述步骤c的具体过程为：
25、采用阳离子层析酸性调节液对步骤b中的洗脱样品调节ph至7.0±0.1，同时监测样品电导率，0.45μm过滤，用纯化水和0.5m naoh溶液清洗层析系统和层析柱，随后用阳离子层析结合缓冲液平衡层析柱，上样，再用阳离子层析结合缓冲液平衡层析柱，最后采用阳离子层析洗脱缓冲液0-100％洗脱。
26、具体的，阳离子层析采用rigose-sp-hp的层析柱；
27、阳离子层析酸性调节液组分为1m枸橼酸；
28、阳离子层析结合缓冲液组分为20mm pb，1mm edta·2na·2h2o，ph 7.0；
29、阳离子层析洗脱缓冲液组分为20mm pb，1mm edta·2na·2h2o，1m nacl，ph 7.0。
30、需要说明的是，阳离子层析基于目标蛋白与带有负电荷的层析介质之间的相互作用，借助ph和离子强度的调节来控制洗脱条件，实现目标蛋白的分离和纯化。这种层析技术使用阳离子层析酸性调节液对洗脱样品进行ph调节至7.0±0.1，可以确保上样过程中样品处于适当的ph范围，以最大限度地提高目的蛋白的层析上样载量，在调节ph的过程中，监测样品的电导率，使用0.45微米的过滤器对样品进行过滤，均是为了避免阳离子层析上样过程出现样品流穿现象。使用纯化水和0.5m naoh溶液对层析系统和层析柱进行清洗，可以去除前期操作中可能残留的杂质和缓冲液，准备好层析系统和层析柱进行下一步骤。使用阳离子层析结合缓冲液平衡层析柱，可以确保层析柱内的介质处于一个合适缓冲条件，为样品的加载和分离创造适当的条件。上样之后，使用阳离子层析结合缓冲液再次平衡层析柱，确保在上样后层析柱仍然在适当的条件下，以确保高效的分离；使用阳离子层析洗脱缓冲液进行洗脱，将目标蛋白从层析柱中洗脱，在这个步骤中，洗脱缓冲液的浓度通常从0％逐渐增加到100％，以逐步减弱目标蛋白与层析介质的相互作用，实现洗脱。
31、其中，所述步骤d的具体过程为：
32、先采用疏水层析母液稀释步骤c中洗脱样品的(nh4)2so4浓度至0.75m，0.45μm过滤，用纯化水和0.5m naoh溶液清洗层析系统和层析柱，随后用疏水层析结合缓冲液平衡层析柱，上样，再用疏水层析结合缓冲液平衡层析柱，最后采用疏水层析洗脱缓冲液等度洗脱，梯度设置为20％、40％、60％、80％、100％。
33、具体的，在步骤d中，疏水层析采用capto butyl impres的层析柱；
34、疏水层析母液组分为20mm pb，3m(nh4)2so4，1mm edta·2na·2h2o，ph7.5；
35、疏水层析结合缓冲液为20mm pb，0.75m(nh4)2so4，1mm edta·2na·2h2o，ph7.5；
36、疏水层析洗脱缓冲液为20mm pb，1mm edta·2na·2h2o，ph7.5。
37、需要说明的是，疏水层析基于蛋白质在不同溶剂极性条件下的表面疏水性差异，利用梯度洗脱实现目标蛋白的分离。母液稀释可以提高样品中的盐浓度(硫酸铵)，让目的蛋白的疏水基团暴露出来，为后续的层析步骤做准备；使用0.45微米的过滤器对样品进行过滤。这一步的目的是去除颗粒物和悬浮物，确保样品的清晰度，并保护层析柱和仪器；用纯化水和0.5m naoh溶液对层析系统和层析柱进行清洗，可以去除前期操作中可能残留的杂质和缓冲液，准备好层析系统和层析柱进行下一步骤；使用疏水层析结合缓冲液平衡层析柱可以确保层析柱内的介质处于一个合适的缓冲条件，为样品的加载和分离创造适当的条件；之后上样；再使用疏水层析结合缓冲液再次平衡层析柱，这是为了确保在上样后层析柱仍然在适当的条件下，以确保高效的分离；采用疏水层析洗脱缓冲液进行洗脱，并设置梯度，通过改变洗脱缓冲液的盐浓度，逐步降低目标蛋白与层析介质之间的结合能力，实现目标蛋白的洗脱。
38、其中，在步骤e中，超滤换液装置包括超滤置换液存储罐、注射用水存储罐、naoh溶液存储罐、隔膜泵、超滤置换袋、超滤膜包、蠕动泵、废液存储罐；
39、超滤置换液存储罐、注射用水存储罐、naoh溶液存储罐以及超滤置换袋的出口端均与隔膜泵的入口端相连接，隔膜泵的出口端与超滤膜包的进口端相连接，超滤膜包的废液端、回流端分别与废液存储罐、超滤置换袋的入口端相连接；
40、超滤置换液存储罐还与蠕动泵的入口端相连接，蠕动泵的出口端与超滤置换袋的入口端相连接。
41、由此，该种超滤装置采用蠕动泵和隔膜泵与超滤膜包和超滤置换袋相互连接，隔膜泵主要连接不同缓冲液及装有样品的超滤置换袋；隔膜泵主要连接超滤缓冲液，用于超滤置换液的补加；超滤膜包进口端与隔膜泵相连，出口端分为回流端、废液端，回流端连接超滤置换袋，废液端连接废液存储罐，其中超滤膜包需与超滤夹具相互搭配，不同大小的超滤夹具能够匹配各种膜面积的膜包使用，能够满足不同规格的生产使用。
42、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
43、(1)本发明开发的纯化方法包括：菌体破碎澄清、ni亲和层析、阳离子层析、疏水层析、超滤换液，其纯化步骤较市面上牛痘病毒加帽酶纯化方法更简单，最关键的是不需要分子筛这样的分离方式，分子筛放大成本、对人员操作要求极高。而且，本发明的纯化方法也明显高于市面上纯化方法的收率。
44、(2)其中，本发明的纯化方法的一套流程相对较短，减少了步骤的复杂性，更易于操作和实施。而且，使用ni亲和层析可以高效地富集具有特定亲和性标签的目标蛋白，提高目标蛋白的纯度，疏水层析用于进一步提高纯度，去除过量表达的小亚基以及一些非特异性结合的杂质，超滤换液可用于浓缩目标蛋白，同时去除低分子量的溶剂和盐。
45、(3)其中，相较于市场上的超滤换液装置，本发明设置的超滤换液装置，通过部件上的调整以及部件之间配合上的改进，超滤换液过程稳定、高效，不会对样品造成破坏，使得最终得到的牛痘病毒加帽酶纯度高，没有杂质产生，因此具有更广泛的应用前景。
46、(4)综述，本发明的纯化方法以及超滤换液装置适用于牛痘病毒加帽酶纯化领域时，能实现纯化方式更加简易化，最终也得到更高的回收率，提高产品产量及产品质量，降低商业化生产成本。
1.一种牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，所述步骤a的具体过程为：
3.根据权利要求2所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，所述破菌缓冲液的组分为：20mm pb，50mm nacl，1mm edta·2na·2h2o，10％甘油，ph8.0。
4.根据权利要求3所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，所述步骤b的具体过程为：
5.根据权利要求2所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，在步骤b中，层析柱采用ni-nta-hp的层析柱；
6.根据权利要求5所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，所述步骤c的具体过程为：
7.根据权利要求2所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，阳离子层析采用rigose-sp-hp的层析柱；
8.根据权利要求7所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，所述步骤d的具体过程为：
9.根据权利要求8所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，在步骤d中，疏水层析采用capto butyl impres的层析柱；
10.根据权利要求9任意一项所述的牛痘病毒加帽酶纯化的方法，其特征在于，在步骤e中，超滤换液装置包括超滤置换液存储罐、注射用水存储罐、naoh溶液存储罐、隔膜泵、超滤置换袋、超滤膜包、蠕动泵、废液存储罐；
