本发明涉及生物化学，具体涉及一种评估脂质吸收的再酯化测定方法及应用。
背景技术：
1、功能性脂质是一类具有特殊生理功能的脂质，它是指那些为人类营养、健康所需要，并对人体一些相应营养素缺乏症和内源性疾病，特别是高血压、心脏病、癌症、糖尿病等有积极防治作用的一大类脂溶性物质。
2、功能脂质按照功能性可分为功能性脂肪酸、脂溶性维生素、甾醇类化合物、角鲨烯等；其他功能性脂质衍生物如辅酶q10、姜黄素、白藜芦醇、番茄红素、叶黄素、虾青素等。功能脂质中脂肪酸和植物甾醇类化合物在食物中有较为广泛的占有率，食品中常见的功能性脂肪酸主要以中长链脂肪酸dha、epa、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸等为主；植物甾醇(包括甾醇和甾烷醇)是一种四环三萜类的天然产物，广泛存在于植物油、谷物、蔬菜、水果等居民日常膳食中，我国居民每日的植物甾醇摄入量为257.7～473.7mg。食品中常见的植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇，而其对应的植物甾烷醇，如豆甾烷醇、菜油甾烷醇，具有更高的饱和度。这些功能性脂质具有对肥动脉粥样硬化、心血管疾病等具有缓解作用且对胆汁酸代谢过程相关蛋白受体具有显著调控作用。因此，如何通过测定再酯化率评价膳食脂质吸收效率进而指导膳食脂质合理摄入是人们关注的重点。
3、功能脂质的消化吸收能力反映了其生物利用度。功能性脂质均属于脂溶性物质，溶于混合胶束的脂质经过细胞内再酯化过程，酯化形式的脂质随后掺入乳糜微粒，进而参与淋巴及血液循环代谢利用。乳糜微粒中的脂质绝大部分来源于经过肠细胞再酯化过程的酰基辅酶a酯化形式，通过调控酯化过程中的关键控制点，可提高酯化率进而提高生物利用度。
4、生物利用度是评价功能脂质吸收能力和效率的重要指标，然而目前现有技术无法通过体外的方式较为准确评价该过程。例如，目前利用caco-2细胞模型通过单层膜透过率评价细胞膜透过率，并非整个吸收率。体内实验中药代动力学评估吸收，由于动物间存在个体差异，比起体外模型一般平行性较差。
5、吸收阶段最重要的环节为功能脂质于消化液中的甘油三酯、磷脂等形成乳糜微粒，乳糜微粒会进入淋巴循环后被机体利用。研究表明影响乳糜微粒形成的关键因素为脂质的再酯化过程，酯化形式的功能脂质会进一步被吸收利用，因此评价乳糜微粒的形成能力需要聚焦在酯化过程。
6、专利cn 114736947a公开了一种基于ph-stat结合caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，该方法结合体外消化模型和caco-2肠吸收模型评价甘油三酯的生物可及性。但该方法仅能评价易被吸收及跨肠细胞膜的部分，针对被机体利用部分即用于淋巴循环乳糜微粒中的甘油三酯(换言之甘油三酯生物利用度)无法用该方法衡量。
7、因此简化并精确脂质在体内的生物利用度形成评价模型有利于评价食物中功能脂质的吸收率，进而形成合理膳食模式。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种检测功能性脂质在消化吸收过程中肠上皮细胞内再酯化效率的方法，进而用于食物中脂质营养价值评价。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明基于放射性同位素标记辅助液体闪烁计数技术提供了一种评估脂质吸收的再酯化测定方法，所述脂质以脂肪酸和甾体类化合物为主，当所述脂质为脂肪酸，所述方法包括以下步骤：
4、(1)向单层培养的肠上皮细胞中加入待测脂肪酸，孵育使细胞负载待测脂肪酸；再加入含放射性同位素14c标记的辅酶a，孵育使得脂肪酸与辅酶a在细胞内发生再酯化反应生成14c标记的酯酰辅酶a；
5、(2)反应终止后，取细胞培养液离心，收集有机层，除去溶剂得到代谢产物；
6、(3)利用薄层色谱技术对代谢产物进行层析，切下酯酰辅酶a对应的条带，转移到含有闪烁液的闪烁瓶中，搅拌孵育，液体闪烁计数仪检测同位素14c强度，计算14c回收率表征待测脂肪酸再酯化率；
7、当所述脂质为甾醇，所述方法包括以下步骤：
8、1)待测甾醇上标记放射性同位素3h，再加入到单层培养的肠上皮细胞中孵育；然后加入含放射性同位素14c标记的酯酰辅酶a，孵育使得甾醇与酯酰辅酶a在细胞内发生再酯化反应生成同时具有14c和3h标记的甾醇脂肪酸酯；
9、2)反应终止后，取细胞培养液离心，收集有机层，除去溶剂得到代谢产物；
10、3)利用薄层色谱技术对代谢产物进行层析，切下甾醇脂肪酸酯对应的条带，转移到含有闪烁液的闪烁瓶中，搅拌孵育，液体闪烁计数仪检测同位素3h和14c强度，按照公式(ⅰ)计算得待测甾醇再酯化率；
11、
12、其中给药剂量[14c]酯酰辅酶a为反应物中14c添加量，给药剂量[3h]甾醇为反应物中3h添加量，单层模型[14c]辅酶a为生成物中14c含量，单层模型[3h]甾醇脂肪酸酯为生成物中3h含量。
13、进一步的，所述脂肪酸以中长链脂肪酸为主，包括但不限于dha、epa、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸。
14、进一步的，所述甾体类化合物为植物甾醇，包括但不限于谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇。
15、本发明提供的评估脂质吸收的再酯化测定方法原理如下：
16、针对脂肪酸再酯化，脂肪酸在辅酶a作用下反应生成酯酰辅酶a和酰基甘油，利用放射性同位素标记辅酶a，产物酯酰辅酶a将携带放射性同位素标记，检测产物中放射性同位素强度，通过计算放射性同位素回收率量化脂肪酸的再酯化率。
17、针对甾醇再酯化，甾醇与酯酰辅酶a反应生成甾醇脂肪酸酯和辅酶a，利用两种不同的放射性同位素分别标记甾醇和酯酰辅酶a，生成同时携带两种放射性同位素标记的甾醇脂肪酸酯，通过检测放射性同位素强度测定反应物中酯酰辅酶a的减少量和产物中甾醇脂肪酸酯的生成量，量化甾醇的再酯化率
18、本发明通过在参与酯化反应的酶上标记放射性同位素，将代谢途径精确定位到上述酶参与的酯化反应，有效排除未知代谢途径的影响。
19、进一步的，所述肠上皮细胞为caco-2细胞，caco-2细胞模型是研究营养物质吸收情况的经典模型；caco-2细胞培养至状态稳定后转移至transwell12孔板上，继续培养形成单层细胞。
20、进一步的，细胞培养过程中测量细胞跨膜电阻值，当跨膜电阻值大于350时，单层膜模型构建成功。
21、进一步的，辅酶a的14c标记剂量为0.015-0.06μci，优选的，辅酶a的14c标记剂量为0.03μci。
22、进一步的，待测甾醇的3h标记剂量为0.001-0.004μci，酯酰辅酶a的14c标记剂量为0.015-0.06μci。优选的，待测甾醇的3h标记剂量为0.002μci，酯酰辅酶a的14c标记剂量为0.03μci。
23、进一步的，待测脂肪酸或待测甾醇在肠上皮细胞中孵育的条件为：37℃下孵育5min。
24、进一步的，步骤1)中，将甾醇溶解于质量体积百分比为45％的2-羟丙基β-环糊精水溶液，再加入到单层培养的肠上皮细胞中，37℃下孵育5min。
25、进一步的，步骤1)中，待测甾醇孵育后，加入14c标记的酯酰辅酶a、无脂肪酸牛血清白蛋白孵育进行再酯化反应。牛血清白蛋白作为细胞营养来源供细胞发生酯化反应。
26、进一步的，在步骤(1)和步骤1)中，在对照组中加入同等剂量的未标记的辅酶a或酯酰辅酶a。进一步的，步骤(1)和步骤1)中，再酯化反应时间为12～24h。
27、进一步的，步骤(2)和步骤2)中，加入体积比2:1的氯仿:甲醇混合物生理盐水终止反应。
28、进一步的，步骤(2)和步骤2)中，离心的条件为：在4℃下800×g离心10min。
29、进一步的，步骤(2)和步骤2)中，在氮气流下蒸发去除溶剂。
30、进一步的，代谢产物重悬后点样于薄层硅胶板上，流动相采用体积比为80:20:1的正己烷:乙酸乙酯:乙酸混合液，层析时间为45min。
31、同时，以仅含酯酰辅酶a或甾醇脂肪酸酯的样品进行点样层析作为代谢产物分离鉴别的对照。
32、进一步的，步骤(3)中，为定量反应生成的具有放射性酯酰辅酶a并排除其他非14c标记coa途径，向代谢产物重悬液中加入未标记的酯酰辅酶a，再进行薄层色谱。
33、本发明的另一个目的是提供了所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法在评价食品中脂质营养价值中的应用。所述应用包括：首先从食品中提取并鉴定功能脂质具体组分，根据目标组分确定代谢产物；然后采用上述再酯化测定方法对目标代谢产物上携带的同位素强度进行检测，进而计算得出目标组分的再酯化率。
34、本发明具备的有益效果：
35、乳糜微粒形成的关键因素为脂质的再酯化过程，本发明基于放射性同位素标记辅助液体闪烁计数技术提供了一种功能脂质再酯化评价方法，该方法中通过放射性同位素标记辅酶a或酯酰辅酶a，以标记的辅酶a作为衡量代谢过程的评价物，检测经上述酶催化产物的放射性同位素强度，将功能脂质的代谢途径精确定位到辅酶a参与的酯化反应，排除未知代谢途径的影响。
36、相较于目前体外实验利用caco-2细胞模型通过单层膜透过率评价细胞膜透过率评价脂质吸收能力，本发明方法聚焦肠上皮细胞内的能量代谢反应，更接近真实脂质吸收情况，评价更为准确。
37、相较于目前体内实验中药代动力学评估吸收的方法，本发明方法精确定位脂质的再酯化过程，可以准确评价脂质吸收情况，检测重复性好。
1.一种评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，当所述脂质为脂肪酸，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，所述肠上皮细胞为caco-2细胞；caco-2细胞培养至状态稳定后转移至transwell12孔板上，继续培养形成单层细胞。
3.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，步骤(1)中，辅酶a的14c标记剂量为0.03μci。
4.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，步骤(1)中，再酯化反应时间为12～24h。
5.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，步骤1)中，待测甾醇的3h标记剂量为0.002μci，酯酰辅酶a的14c标记剂量为0.03μci。
6.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，步骤1)中，将甾醇溶解于质量体积百分比为45％的2-羟丙基β-环糊精水溶液，再加入到单层培养的肠上皮细胞中，37℃下孵育5min。
7.如权利要求5所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，步骤1)中，待测甾醇孵育后，加入14c标记的酯酰辅酶a、未标记的酯酰辅酶a、无脂肪酸牛血清白蛋白孵育进行再酯化反应。
8.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，其特征在于，步骤(3)和步骤3)中，代谢产物重悬后点样于薄层硅胶板上，流动相采用体积比为80:20:1的正己烷:乙酸乙酯:乙酸混合液，层析时间为45min。
9.如权利要求1所述的评估脂质吸收的再酯化测定方法，步骤(3)中，向代谢产物重悬液中加入未标记的酯酰辅酶a，再进行薄层色谱分离。
