本发明涉及免疫蛋白检测，具体涉及一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法。
背景技术：
1、狂犬病俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，临床表现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征，是迄今为止人类唯一病死率高达100%的急性传染病。狂犬病人免疫球蛋白能特异性中和狂犬病病毒，主要用于被狂犬或其他疯动物咬伤、抓伤患者的被动免疫。
2、目前，狂犬病人免疫球蛋白效价测定的方法主要包括小鼠中和实验法（mnt）、快速荧光灶抑制法（rffit）、荧光抗体病毒中和实验（favn），其中小鼠中和实验法与快速荧光灶抑制法已收录于《中国药典》中，每种实验方法均有各自的优势和缺点。
3、小鼠中和实验法是将供试品和标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液混合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。该方法提供了一个相对于人类免疫系统的生物学模型，有助于了解免疫球蛋白与狂犬病毒之间的相互作用机制。但小鼠和人类之间存在生物学差异，比如免疫系统的反应方式，故小鼠中和实验的检测结果不能够准确反映人类免疫球蛋白的效价。而且小鼠中和实验结果可能受到小鼠的生理状况、年龄、性别等因素的影响，这些因素的可导致实验结果的不确定性，使实验标准化的难度增加，降低了实验的可重复性和可靠性。而且与一些其他高通量的体外方法相比，小鼠中和实验需要较长的时间和较高的成本。
4、快速荧光灶抑制法（rapid fluorescent focus inhibition test，rffit）和荧光抗体病毒中和实验（fluorescent antibody virus neutralization，favn）是使用bsr细胞模拟体内实验的体外测量方法。这两种方法的主要区别在于对结果的解释：前者，每个血清稀释度被感染的荧光灶的数量被用来计算ed50（50%有效剂量）的中和效价，如果检测中包含有参考标准品，则可将结果转化为国际单位/毫升（iu/ml）；在后一种方法里，bsr细胞被培养在96孔细胞培养孔板上，而不是rffit试验中使用的8孔室细胞培养载玻片，随后根据感染细胞是否存在，每孔分别被标记为阳性或阴性，再计算结果，从而提高了检测结果的准确性和质量。
5、rffit法的主要问题在于荧光灶比例的判断存在较强的主观性，不同的实验人员或不同实验室之间对荧光灶比例的判断差异较大。相对于其他方法，favn法具有较高的灵敏度，可以检测低浓度的中和抗体，并且可对免疫球蛋白中和狂犬病毒的效价进行定量测量，结果更具有可比性和可解释性，是国际上被广泛认可的免疫球蛋白效价测定方法之一，有助于不同实验室和研究机构之间的结果比较。但是favn的操作相对较为繁琐，实验周期较长。
技术实现思路
1、针对现有技术中各种狂犬病人免疫球蛋白效价测定方法存在的不足，本发明提供一种细胞培养孔板及狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法。
2、一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，使用专门制作的细胞培养孔板，细胞培养孔板底部设置有将圆形孔底分为100个扇形格的网格状图案，具体包括以下步骤：
3、（1）向细胞培养孔板中加入不同稀释倍数的狂犬病人免疫球蛋白标准品溶液或狂犬病人免疫球蛋白供试品溶液，再加入攻击病毒液，进行病毒中和反应；然后加入bsr细胞悬液，孵育；
4、（2）进行bsr细胞固定，然后使用抗狂犬病毒核蛋白荧光抗体染色液进行染色；
5、（3）统计细胞培养孔板标准品孔与供试品孔中阴性扇形格数量和百分比；
6、（4）以标准品稀释倍数的对数为横轴，抑制率为纵轴，进行四参数拟合，得到标准曲线；以供试品稀释倍数的对数为横轴，抑制率为纵轴，进行四参数拟合，得到拟合曲线；根据标准曲线和拟合曲线计算待测样品的效价。
7、进一步的，细胞培养孔板的每个细胞培养孔内径为5r，网格状图案包括与圆形孔同圆心的内径为r的四等分圆，内径为r、外径为2r的十二等分圆环，内径为2r、外径为3r的二十等分圆环，内径为3r、外径为4r的二十八等分圆环，内径为4r、外径为5r的三十六等分圆环；网格状图案中的等分线或其延长线均交于圆形孔圆心处。该网格状图案将孔底进行了完全100等分，且规避了扇形等分带来的统计困难的问题。
8、进一步的，网格状图案使用激光雕刻而成，以确保提供非常精确和清晰的刻画。
9、进一步的，对网格状图案处进行涂层或着色处理，以增强图案的外观。
10、进一步的，步骤（1）中，标准品溶液/供试品溶液的制备方法如下：将狂犬病人免疫球蛋白标准品/狂犬病人免疫球蛋白供试品于离心管中使用完全培养基稀释至0.05~0.2iu/ml，用振荡器混匀；将稀释液在离心管中稀释成不同稀释倍数的标准品溶液/供试品溶液。
11、进一步的，步骤（1）中，bsr细胞悬液的制备方法如下：取bsr细胞在t25培养瓶中进行培养，细胞生长出现接触抑制后，将培养基移除，加入5ml磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，并重复两次；倒掉磷酸盐缓冲液，加入1.5ml胰酶溶液，轻轻晃动使胰酶充分接触细胞，平放t25培养瓶，37℃下消化1min；将t25培养瓶竖起，当观察到细胞层成雾状且出现划线时，加入1ml完全生长培养基中和胰蛋白酶，拍打细胞瓶使细胞脱落，并用移液枪吹打分散细胞悬液至无肉眼可见的细胞团；使用细胞计数仪计数：将稀释细胞悬液至1.2×106~1.4×106个/ml。
12、进一步的，步骤（1）具体为：将不同稀释倍数的供试品溶液和标准品溶液分别取50μl加入细胞培养孔，每个稀释倍数做两个平行处理，各孔分别加入50μl攻击病毒液，震荡混匀，在37℃下中和1h；各孔分别加入bsr细胞悬液50μl；另设阴性对照孔，以完全生长培养基代替病毒悬液和中和抗体，在5% co2，37℃培养箱中孵育21h。
13、进一步的，步骤（2）具体为：将细胞培养孔中的培养基用移液枪从孔底处全部取出，避免触碰细胞层；每孔添加50μl 80%冷丙酮，置于-30℃冰箱中固定10min；将丙酮全部弃去，待丙酮全部挥发后用磷酸盐缓冲液清洗一次，在暗处用移液枪在每孔加入50μl抗狂犬病毒核蛋白荧光抗体染色液，置于37℃培养箱孵育30min，取出后每孔用100μl磷酸盐缓冲液清洗1遍，清洗完成后每孔加入100μl磷酸盐缓冲液。
14、进一步的，步骤（3）具体为：在显微镜下每孔分视野进行部分重叠拍摄，用图像处理软件将每个孔的照片合为一张完整的孔内全视野照片。
15、本发明的有益效果在于：
16、本发明提供的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，以狂犬病人免疫球蛋白与狂犬病毒中和作用原理为基础，通过制作专用细胞培养孔板，对检测结果进行观测记录、数据统计，并引入四参数拟合模型，构建了狂犬病人免疫球蛋白稀释倍数与荧光灶形成抑制率的四参数拟合曲线，直观地表现出中和反应的特征，可准确分析相关变量之间的关系，并能较为准确、便捷地测得狂犬病人免疫球蛋白样品的效价。
1.一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，使用专门制作的细胞培养孔板，细胞培养孔板底部设置有将圆形孔底分为100个扇形格的网格状图案，具体包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，细胞培养孔板的每个细胞培养孔内径为5r，网格状图案包括与圆形孔同圆心的内径为r的四等分圆，内径为r、外径为2r的十二等分圆环，内径为2r、外径为3r的二十等分圆环，内径为3r、外径为4r的二十八等分圆环，内径为4r、外径为5r的三十六等分圆环；网格状图案中的等分线或其延长线均交于圆形孔圆心处。
3.如权利要求2所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，网格状图案使用激光雕刻而成。
4.如权利要求2所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，对网格状图案处进行涂层或着色处理。
5.如权利要求1所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，步骤（1）中，标准品溶液/供试品溶液的制备方法如下：将狂犬病人免疫球蛋白标准品/狂犬病人免疫球蛋白供试品于离心管中使用完全培养基稀释至0.05~0.2iu/ml，用振荡器混匀；将稀释液在离心管中稀释成不同稀释倍数的标准品溶液/供试品溶液。
6.如权利要求1所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，步骤（1）中，bsr细胞悬液的制备方法如下：取bsr细胞在t25培养瓶中进行培养，细胞生长出现接触抑制后，将培养基移除，加入5ml磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，并重复两次；倒掉磷酸盐缓冲液，加入1.5ml胰酶溶液，轻轻晃动使胰酶充分接触细胞，平放t25培养瓶，37℃下消化1min；将t25培养瓶竖起，当观察到细胞层成雾状且出现划线时，加入1ml完全生长培养基中和胰蛋白酶，拍打细胞瓶使细胞脱落，并用移液枪吹打分散细胞悬液至无肉眼可见的细胞团；使用细胞计数仪计数：将稀释细胞悬液至1.2×106~1.4×106个/ml。
7. 如权利要求1所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，步骤（1）具体为：将不同稀释倍数的供试品溶液和标准品溶液分别取50μl加入细胞培养孔，每个稀释倍数做两个平行处理，各孔分别加入50μl攻击病毒液，震荡混匀，在37℃下中和1h；各孔分别加入bsr细胞悬液50μl；另设阴性对照孔，以完全生长培养基代替病毒悬液和中和抗体，在5% co2，37℃培养箱中孵育21h。
8. 如权利要求1所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，步骤（2）具体为：将细胞培养孔中的培养基用移液枪全部取出，避免触碰细胞层；每孔添加50μl80％冷丙酮，置于-30℃冰箱中固定10min；将丙酮全部弃去，待丙酮全部挥发后用磷酸盐缓冲液清洗一次，在暗处用移液枪在每孔加入50μl抗狂犬病毒核蛋白荧光抗体染色液，置于37℃培养箱孵育30min，取出后每孔用100μl磷酸盐缓冲液清洗1遍，清洗完成后每孔加入100μl磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的一种狂犬病人免疫球蛋白效价检测方法，其特征在于，步骤（3）具体为：在显微镜下每孔分视野进行部分重叠拍摄，用图像处理软件将每个孔的照片合为一张完整的孔内全视野照片。
