本发明属于寡糖合成，具体涉及一种tmg-壳三霉素及其类似物和其合成方法。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、β-n-乙酰己糖苷酶广泛分布在细菌、真菌以及动植物体内，可水解游离聚糖、糖蛋白和糖脂中β1,4连接的n-乙酰葡糖胺(glcnac)单元，在糖蛋白修饰及代谢、几丁质降解等重要生物过程中发挥着不同作用，与多种疾病相关。对微生物及昆虫来源的β-n-乙酰己糖苷酶的特异性抑制作用研究，在新型抗菌药、农药和农用化学品的开发方面具有广阔前景。2008年日本科学家hiroshi kanzaki等人以胶质几丁质为唯一碳源培养环状链霉菌nbrc13369时首次分离得到n,n,n-三甲基-d-葡萄糖胺(tmg)-壳三霉素(tmg-chitotriomycin)，表征结构为α-tmg-(1,4)-β-d-glcnac-(1,4)-β-d-glcnac-(1,4)-d-glcnac。2009年俞飚团队首次实现tmg-壳三霉素的全合成，并修正结构为β-tmg-(1,4)-β-d-glcnac-(1,4)-β-d-glcnac-(1,4)-d-glcnac。研究表明tmg-壳三霉素可以特异性抑制昆虫和真菌来源的β-n-乙酰己糖苷酶而对哺乳动物和植物的β-n-乙酰己糖苷酶无抑制作用，同时含有不同数量n-乙酰葡糖胺单元的tmg-壳三霉素类似物对多种昆虫或真菌来源的β-n-乙酰己糖苷酶也表现出不同程度的抑制活性，因此，tmg-壳三霉素及其类似物有望开发为新型杀虫剂或抗菌剂。
3、现有技术通过微生物发酵、化学全合成或半合成得到tmg-壳三霉素及少数类似物。但是前者产量低且分离困难，而后者由于n-乙酰葡糖胺在糖苷化反应中活性不高且需要繁琐的保护/脱保护步骤以克服糖苷化反应区域和立体选择性难题，导致合成过程总体效率偏低。因此，足量的高纯度样品的缺乏导致目前tmg-壳三霉素及相应类似物的研究开发尚不充分。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种tmg-壳三霉素及其类似物和其合成方法。本发明采用化学酶法相结合，以廉价易得的几丁质寡糖为原料，使用脱乙酰基酶位点特异性脱除几丁质寡糖上n-乙酰基，随后对游离的氨基进行三甲基化得到tmg-壳三霉素及其类似物，为系统研究tmg-壳三霉素及其类似物在药物研发领域提供物质基础。
2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
3、第一方面，本发明提供了一种tmg-壳三霉素及其类似物，其特征在于，具有如式i或式ii所示的结构；
4、
5、
6、其中，r1为+nme3或nhac，r2为+nme3或nhac，，式i中r1和r2不相同，式ii中r1和r2不同时为nhac，n为0、1、2或3。
7、第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的tmg-壳三霉素及其类似物的合成方法，包括以下步骤：
8、s1、使用几丁质寡糖脱乙酰基酶催化脱除如式iii所示的几丁寡糖的乙酰基得到如式iv或式v所示的脱乙酰基壳寡糖；
9、s2、如式iv或式v所示的脱乙酰基壳寡糖经n-三甲基化反应得到tmg-壳三霉素及其类似物；
10、
11、其中，r3为h或ac，r4为h或ac，式iv中r3和r4不相同，式v中r3和r4不同时为ac，n为0、1、2或3，m为2、3、4、5或6。
12、优选的，所述几丁质寡糖脱乙酰基酶为几丁质寡糖非还原端脱乙酰基酶和几丁质寡糖非还原端相邻位置脱乙酰基酶中的至少一种，，几丁质寡糖非还原端脱乙酰基酶包括rhizobium nodb，几丁质寡糖非还原端相邻位置脱乙酰基酶包括vibrio cholerae cod，rhizobium nodb的氨基酸序列如seq id no.1所示，vibrio cholerae cod的氨基酸序列如seq id no.2所示。
13、本发明中采用的几丁质寡糖脱乙酰基酶，rhizobium nodb用于脱去几丁质寡糖非还原端乙酰基，vibrio cholerae cod用于脱去几丁质寡糖非还原端相邻位置乙酰基，rhizobium nodb和vibrio cholerae cod联用以脱去几丁质寡糖非还原端两个乙酰基，合成效率高，基本无副产物的生成，方便进行纯化。而且上述酶均为微生物来源，均可在常规的大肠杆菌表达系统中方便的表达纯化。
14、酶的化学本质是蛋白质，其催化活性受到很多因素的影响，如金属离子、底物浓度、反应体系的温度、时间、ph等，本发明针对几丁质寡糖脱乙酰基过程中所使用的不同的酶设计了最适的反应条件体系，保证了本发明脱乙酰基酶的高效能发挥。
15、进一步优选的，步骤s1中，当几丁质寡糖脱乙酰基酶包括rhizobium nodb时将几丁寡糖与二硫苏糖醇和二价锰盐混合溶于缓冲体系中形成反应体系，当几丁质寡糖脱乙酰基酶不包括rhizobium nodb时将几丁寡糖溶于缓冲体系中形成反应体系，所述缓冲体系包括tris-hcl、pbs、mops或mes。
16、再进一步优选的，二硫苏糖醇、二价锰盐和缓冲体系的摩尔比为(1～100):(1～100):(10～500)。
17、优选的，步骤s1中，反应ph为3.5～9，反应温度为25～40℃，反应时间为3～72h。
18、优选的，步骤s1中，通过100℃水浴煮沸5-20min停止酶反应。
19、优选的，步骤s2中，脱乙酰基壳寡糖与碘甲烷、氢氧化钠混合进行反应，碘甲烷的摩尔量为脱乙酰基壳寡糖中氨基摩尔量的4～40倍，氢氧化钠的摩尔量为脱乙酰基壳寡糖中氨基摩尔量的3～5倍。
20、优选的，步骤s2中，反应温度为25～50℃，反应时间为3～72h。
21、壳寡糖中氨基的甲基化可能存在单甲基化、双甲基化和三甲基化，且糖环上的羟基也有被甲基化的可能，溶剂、反应温度、甲基化试剂当量、氢氧化钠当量和时间都可能影响反应。本发明针对不同的影响因素进行优化，保证了脱乙酰基位点明确的壳寡糖的n-三甲基化。
22、优选的，采用薄层色谱法跟踪反应进程，使用按体积比乙酸乙酯:乙醇:水:氨水＝5:5:4:0.3混合的展开剂检测。
23、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
24、本发明提供了一种化学酶法合成tmg-壳三霉素及其类似物的合成方法。本发明从来源丰富、价格低廉的几丁质、壳聚糖或壳寡糖等制备得到的几丁寡糖出发，利用酶的高选择性和高效性实现了脱乙酰基位点明确的壳寡糖的合成，并将其进行n-三甲基化得到tmg-壳三霉素及其类似物。该方法规避了化学合成中低效的n-乙酰葡糖胺糖苷化反应及繁琐的保护/脱保护操作，以几丁寡糖为原料进行简单的化学酶法结构修饰以实现tmg-壳三霉素及其类似物的合成，该合成路线步骤短，效率高，成本低，适于大量制备。
25、本发明不仅避免了目前化学合成策略存在的糖苷化反应选择性低、合成路线长、收率低等弊端，而且本发明所利用的脱乙酰基酶均为微生物来源，能够在大肠杆菌中稳定表达，具有蛋白表达量高、催化效率高等优点。因而，本发明为在分子水平上研究tmg-壳三霉素及其类似物的生物活性及其作用机制、促进其应用开发方面具有重要意义。
1.一种tmg-壳三霉素及其类似物，其特征在于，具有如式i或式ii所示的结构；
2.一种如权利要求1所述的tmg-壳三霉素及其类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述几丁质寡糖脱乙酰基酶为几丁质寡糖非还原端脱乙酰基酶和几丁质寡糖非还原端相邻位置脱乙酰基酶中的至少一种，，几丁质寡糖非还原端脱乙酰基酶包括rhizobium nodb，几丁质寡糖非还原端相邻位置脱乙酰基酶包括vibrio cholerae cod，rhizobium nodb的氨基酸序列如seq id no.1所示，vibriocholerae cod的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤s1中，当几丁质寡糖脱乙酰基酶包括rhizobium nodb时将几丁寡糖与二硫苏糖醇和二价锰盐混合溶于缓冲体系中形成反应体系，当几丁质寡糖脱乙酰基酶不包括rhizobium nodb时将几丁寡糖溶于缓冲体系中形成反应体系，所述缓冲体系包括tris-hcl、pbs、mops或mes。
5.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于，二硫苏糖醇、二价锰盐和缓冲体系的摩尔比为(1～100):(1～100):(10～500)。
6.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤s1中，反应ph为3.5～9，反应温度为25～40℃，反应时间为3～72h。
7.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤s1中，通过100℃水浴煮沸5-20min停止酶反应。
8.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤s2中，脱乙酰基壳寡糖与碘甲烷、氢氧化钠混合进行反应，碘甲烷的摩尔量为脱乙酰基壳寡糖中氨基摩尔量的4～40倍，氢氧化钠的摩尔量为脱乙酰基壳寡糖中氨基摩尔量的3～5倍。
9.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤s2中，反应温度为25～50℃，反应时间为3～72h。
10.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，采用薄层色谱法跟踪反应进程，使用按体积比乙酸乙酯:乙醇:水:氨水＝5:5:4:0.3混合的展开剂检测。
