本发明属于生物标志物诊断，具体涉及一种同时检测ctni、nt-probnp、d-dimer三种标志物的量子点荧光免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术：
1、急性心肌梗死属于发病率、致死率较高的心血管疾病，中老年人群为主要发病群体。经调查得出，25％左右的急性心肌梗死患者在早期无明显临床症状，有50％左右的患者的心电图无明显异常。因此高效、准确的判断急性心肌梗死成为现今临床研究重点。
2、心肌肌钙蛋白i(ctni)是心肌细丝上的特异性蛋白，ami发生后，在血液中释放且浓度短暂升高，在血清中能较早发现，具有特异性高、半衰期长、诊断窗口期宽阔等优点，可减少漏诊，可协助急性心肌梗死早期筛查与诊断，也是急性心肌梗塞患者疗效观察和预后的重要指标。ami还可以并发急性心力衰竭，主要由于心肌血供减少，而逐渐形成心力衰竭，心力衰竭时，心室容量负荷增加，致使心室肌合成分泌血浆n末端脑钠尿肽原(nt-probnp)增多，所以nt-probnp的含量与ami的关系极为密切，其水平与ami的严重程度成正相关。ami由于冠状动脉内膜损伤导致凝血系统的过度激活，产生凝血亢进和继发纤溶，使血浆d-二聚体(d-d)升高，急性心肌缺血发病时，d-dimer的浓度升高比ctni升高要早，所以d-二聚体是心肌梗死早期阶段的标志物。所以联合这三种标志物进行检测，可提高急性心肌梗死早期诊断的检出率以及诊断准确性，减少或避免了漏诊、误诊情况的发生，具有较高的诊断价值。
3、近几年研究比较多的是血清标志物的检测，市面上已经出现了nt-probnp、ctni和d-dimer单独的量子点荧光免疫法检测试剂盒、nt-probnp和ctni二合一胶体金法检测试剂盒、ctni和d-dimer二合一量子点荧光免疫法检测试剂盒以及nt-probnp、ctni和d-dimer三合一胶体金法检测试剂盒，但还未出现nt-probnp、ctni和d-dimer三合一量子点荧光免疫法检测试剂盒。与量子点相比，胶体金的背景干扰大，检测灵敏度低。量子点(quantumdots，qds)，又称半导体纳米微晶，主要是由ii-vi族或iii-v族元素组成的，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒。与胶体金相比，量子点光稳定性好、荧光强度大，同时具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、发射波长可调等独特的光学特性，且量子点具有优良的标记特性，标记抗体等大分子物质后不会改变大分子物质的生物活性。
技术实现思路
1、有鉴于此，为解决现有技术缺陷，本发明提供一种同时检测急性心肌梗死的三种标志物的量子点荧光免疫层析试纸条。所提供的层析试纸条可以同时检测ctni、nt-probnp、d-dimer。具有操作简易、反应时间短，可同时检测多个生物标志物等特点。
2、为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
3、(1)制备量子点：
4、取65-80mg的pmao-comb-mpeg，分散在6-12ml的dmso中，室温条件下磁力搅拌充分分散。然后加入0.5-1ml的油溶性cdse/zns量子点溶液，室温条件下磁力搅拌充分分散。然后引入氮气流，充分鼓泡8-15分钟，在持续氮气流的保护下，先升温到110℃，保温15-20分钟，再接着升温到180℃，保温10～20分钟。然后冷却到室温，所剩液体透析除去dmso，得到改性的量子点水溶液；
5、(2)制备量子点和抗体的偶联复合物：
6、取5-12μl自制水溶性量子点置于离心管中，加入50-100μl磷酸盐缓冲液，混匀后，加入偶联剂edc和nhs进行活化，然后分别加入相应的ctni、nt-probnp、d-dimer抗体，并将其置于水浴恒温振荡器中震荡2-4h，反应结束后加入10％bsa进行封闭，离心并除去上清液，加入保存液进行超声重悬，静置过夜，4℃保存备用；
7、(3)包被试纸条：
8、将ctni、nt-probnp、d-dimer、羊抗鼠igg抗体按顺序包被在硝酸纤维素膜上形成t1检测线、t2检测线、t3检测线、c质控线；
9、(4)制备试纸条
10、取底板(1)，将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)自前向后依次粘贴于底板上，结合垫(2)覆盖硝酸纤维膜(4)的前部，样品垫(1)压住结合垫的一部分，吸水纸(5)覆盖硝酸纤维素膜(4)的后部，切割成长条，制得ctni、nt-probnp、d-dimer三联量子点免疫层析试纸条。
11、优选的，所加入的油溶性cdse/zns量子点和pmao-comb-mpeg聚合物的比例为1∶15-1∶25。
12、进一步的，所述偶联标记抗体ctni(ab1-1)、nt-probnp(ab2-1)、d-dimer(ab3-1)的质量浓度均为0.03～0.12mg/ml。
13、优选的，所述标记抗体偶联物的保存液主要包括以下含量组分：0.375％的甘氨酸、10％的蔗糖、0.2％的碳酸钾、1％的bsa、10％的蔗糖。
14、优选的，所述三条检测线t1t2t3和质控线上分别包被ctni特异性抗体ab1-2、nt-probnp特异性抗体ab2-2、d-dimer特异性抗体ab3-2和羊抗鼠igg，其浓度为0.5-3mg/ml。
15、优选的，所述的硝酸纤维素膜上包被的检测线和质控线均以0.7μl/cm的划线速度进行包被。
16、进一步的，所述的量子点为自制量子点，量子点的发射波长为609nm。
17、本发明制备的试纸条可以有效区分不同生物标记物的荧光强度，且不同生物标志物的存在，不会对其他种类生物标志物的检测结果造成影响，无交叉反应。具有检测简单，检测样品体积小，操作简便，成本低，自动化水平高，具有良好的检测性能，线性范围宽，准确性和精密度好等显著优势，为急性心肌梗死(ami)提供了早期诊断的试纸，扩大了ami的诊断窗口。
1.一种同时检测ctni/nt-probnp/d-dimer的量子点试纸条及制备方法，其特征在于，所述的试纸条包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所加入的油溶性cdse/zns量子点和梳状两亲性聚合物的比例为1∶15-1∶25。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述偶联标记抗体ctni(ab1-1)、nt-probnp(ab2-1)、d-dimer(ab3-1)的质量浓度均为0.03～0.12mg/ml。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述标记抗体偶联物的保存液主要包括以下含量组分：0.375％的甘氨酸、10％的蔗糖、0.2％的碳酸钾、1％的bsa、10％的蔗糖。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述三条检测线t1t2t3和质控线c上分别包被ctni特异性抗体ab1-2、nt-probnp特异性抗体ab2-2、d-dimer特异性抗体ab3-2和羊抗鼠igg，其浓度为0.5-3mg/ml。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上包被的检测线和质控线均以0.7μl/cm的划线速度进行包被。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的量子点为自制量子点，量子点的发射波长为609nm。
