本发明涉及生物，尤其是涉及一种过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系及其构建方法和应用。
背景技术：
1、生物制品在生产过程中，大多是经过细胞表达制备的。在细胞库的构建过程中，由于培养环境、试剂及细胞本身的原因，有携带内外源性病毒因子的风险。因此，用于生产抗体类药物、蛋白类药物、细胞治疗产品等生物制品的细胞库，需要进行内源性和外源性病毒检测，可以有效的预防生物制品污染，保证生物制品的安全性。
2、体外不同指示细胞接种培养法作为外源性病毒检测中的基础检项，通过观察指示细胞的病变效应和血吸附及血凝效应对细胞样品中潜在的病毒进行广谱检测。其中cho-k1细胞常作为生产用cho细胞的同种属、同组织类型来源的指示细胞，其对病毒的敏感性，即感染病毒后能否产生细胞病变和血吸附阳性的结果尤为重要。
3、cho-k1是未经改造的野生型cho细胞。最初是在1970年左右，由puck和kao的实验室从一只成年中国仓鼠卵巢活检中获得的亲本cho细胞系，一个亚克隆存放于atcc(ccl-61)，并命名。随后源于atcc cho-k1的一个亚克隆在1985年被分离，并保存于ecacc(85051005)，并被制药公司和cmo公司用作重组蛋白的表达。
4、在使用cho-k1作为生产用cho细胞系的同种、同组织来源的指示细胞接种病毒后，由于cho-k1细胞系缺乏α-2,6唾液酸转移酶，很难产生血吸附阳性，因而无法通过血吸附现象判断样品中是否有内外源病毒因子，导致生物制品存在安全性风险。
5、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、为了解决外源病毒因子检测-体外不同指示细胞接种培养法中指示细胞cho-k1无法检测到血吸附阳性病毒的问题，本发明的目的在于提供一种过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系，使其在接种血吸附阳性病毒后能产生明显血吸附现象，从而达到可检测对cho细胞系同种属同组织来源易感病毒的目的。
2、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系，所述唾液酸转移酶为α-2,6唾液酸转移酶。
4、唾液酸转移酶属于脊椎动物唾液酸转移酶家族，该家族包括α-2,3、α-2,6、α-2,8唾液酸转移酶这3个亚型。其中α-2,3-唾液基转移酶1(st3gal1)是一种高尔基膜结合的唾液基转移酶，它将唾液酸残基以α-2,3键连接到含半乳糖的底物上，参与调节细胞迁移和淋巴细胞分化；α-2,8唾液酸转移酶可催化唾液酸从cmp-唾液酸转移到n-连接的寡糖和糖蛋白，生成多聚唾液酸；α-2,6唾液酸转移酶表达在机体许多种细胞的表面，可催化活化的唾液酸以α-2,6糖苷键的形式连接到细胞膜表面的n-乙酰乳糖胺上，成为流感病毒等病原体与其靶细胞之间相互识别的重要受体。本发明提供的过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系，可表达足量的α-2,6唾液酸转移酶，使其可敏感检测到血吸附阳性的内外源病毒因子。
5、第二方面，本发明还提供了构建上述的过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系的方法，包括如下步骤：
6、(a)将过表达基因插入表达载体中，得到重组质粒；
7、(b)将步骤(a)得到的重组质粒转染至cho-k1细胞，进行蛋白表达，得到所述过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系。
8、进一步地，所述过表达基因包括st6 gal i基因；
9、优选地，所述st6 gal i基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
10、进一步地，所述表达载体包括pcdna3.1-hyg(+)amp(+)。
11、选择hyg(+)amp(+)载体，即具有潮霉素抗性基因(hyg(+))和氨苄抗性基因(amp(+))的载体，便于细胞系构建后的抗性筛选实验，从而得到能够稳定表达目的基因的细胞株。
12、进一步地，所述st6 gal i基因插入到表达载体的hind iii和bamh i限制性酶切位点之间。
13、在一些具体的实施方式中，st6 gal i基因通过酶切、连接的方法插入到表达载体中，产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的pcdna3.1-st6 gal表达质粒。
14、进一步地，所述pcdna3.1-st6 gal表达质粒转染至贴壁状态的cho-k1细胞中。
15、进一步地，转染时，所使用的转染试剂可通过市购途径获得。例如可以是sinobio的sinofection转染试剂(货号stf02)。
16、在一些优选的实施方式中，为了得到稳定表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞株，所述方法还包括抗性筛选的步骤。
17、进一步地，所述抗性包括潮霉素b(hygromycin b)。
18、具体地，所述潮霉素b的添加浓度为0.5～2mg/ml。例如可以为，但不限于0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml或2mg/ml。
19、当具体的筛选方法为：0.5个细胞/孔接种96孔细胞培养板，添加潮霉素b，挑选出单个细胞克隆孔时，所述潮霉素b的添加浓度为2mg/ml。
20、本发明的第三方面，提供一种新构建cho-k1细胞在外源病毒因子检测中的应用。
21、其中，具体检测的方法，包括如下步骤：
22、(a)新构建cho-k1单克隆细胞和普通cho-k1细胞同时接种流感病毒。
23、(b)在步骤(a)中所述的细胞-病毒培养物中加入鸡血-豚鼠血等量混合悬液，分别放置于2-8℃和20-25℃孵育30分钟后观察血吸附现象。
24、进一步地，步骤(a)中接种流感病毒为牛副流感3型。
25、进一步地，步骤(b)中鸡血-豚鼠血等量混合悬液红细胞浓度为0.5％。
26、本发明的第四方面，提供一种鉴别新构建cho-k1细胞的方法，包括如下步骤：
27、(a)新构建cho-k1细胞种属鉴定。
28、(b)新构建cho-k1细胞α-2,6-唾液酸转移酶表达量检测。
29、进一步地，步骤(a)中所述细胞种属鉴定方法为dna barcoding法。
30、进一步地，步骤(a)中所述dna barcoding法是根据细胞线粒体基因co1的序列来鉴别细胞系种属。
31、进一步地，步骤(b)中所述α-2,6-唾液酸转移酶表达量检测方法为流式细胞术。
32、进一步地，步骤(b)中所述抗体标记为间接标记法。
33、进一步地，步骤(b)中标记抗体为st6gal1单克隆抗体。
34、进一步地，步骤(b)中单克隆抗体偶连荧光素为fitc。
35、本次发明将st6 gal i(st6β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶)基因整合到真核表达载体pcdna3.1-hyg(+)amp(+)上，经cho-k1细胞表达并经抗性筛选出稳定表达单克隆细胞株，使得cho-k1细胞系拥有的α-2,6唾液酸转移酶，使其可敏感检测到血吸附阳性的内外源病毒因子。
36、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
37、本发明提供的过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系，拥有足量的α-2,6唾液酸转移酶，使其可敏感检测到血吸附阳性的内外源病毒因子。
1.一种过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系，其特征在于，所述唾液酸转移酶为α-2,6唾液酸转移酶。
2.构建权利要求1所述的过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述过表达基因包括st6 gali基因；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括pcdna3.1-hyg(+)amp(+)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述st6 gali基因插入到表达载体的hindiii和bamhi限制性酶切位点之间。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括抗性筛选的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗性包括潮霉素b。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述潮霉素b的添加浓度为0.5～2mg/ml。
9.权利要求1所述的过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系或采用权利要求2-8任一项所述的方法构建得到的过表达唾液酸转移酶的cho-k1细胞系在病毒因子检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病毒因子包括内源性病毒因子和外源性病毒因子；通过血吸附实验检测病毒因子。
