本发明涉及一种用于膀胱癌诊断的生物标志物及其用途。
背景技术：
1、近年来，膀胱癌在国内的发病率呈逐年增长趋势，已经显著超越了肾脏肿瘤，在国内居于首位。移行尿路上皮癌(ucc)、鳞状细胞癌和腺癌是膀胱的三种常见癌组织类型，其他还包括较少见的小细胞癌、混合型癌、癌肉瘤和转移性癌。其中，移行尿路上皮癌最为常见，在膀胱恶性肿瘤中占90％以上，由于该病的发生率较高，易发生局部复发及病情进展，常给患者造成巨大的医疗负担，严重影响生活质量。
2、膀胱癌由于起病隐匿，早期症状往往不典型，缺乏一定的临床表现，当出现临床症状时通常已达到晚期，患者就诊时间普遍较晚，从而使得膀胱癌的早期诊断和治疗存在困难。目前临床上诊断膀胱癌的方法主要包括膀胱镜检、组织活检、影像学检查及细胞学检查，其中膀胱镜检和尿细胞学检查是临床诊断膀胱癌最常用检测方法。影像学检查包括泌尿系b超、泌尿系ct重建、尿路造影、多参数磁共振成像等，仅能发现直径较大的瘤体，对于微小癌及原位癌等的诊断效能微乎其微。细胞学检测虽然具有无创、特异性高的优点，但对低级别肿瘤有着较低的敏感度，而且许多标记物应用于临床诊断仍存在诸多限制。膀胱镜检查虽作为膀胱癌诊断金标准，约80％的非肌肉浸润型膀胱癌在膀胱镜下能被发现，但对于低级别肌层浸润性膀胱癌和原位癌(cis)病变往往会出现漏诊，其次，膀胱镜检作为一种有创手段，常常发生泌尿道损伤和感染等并发症，对患者带来极大的痛苦，近年来，尽管软镜、蓝光膀胱镜以及窄带宽普技术应用提高了癌症诊断率，同时也增加了患者经济负担，并且医生在操作过程中也会存在一定的主观性，因此普适性也较差。脱落细胞学检查虽具有高度特异性和无创性，但对低级别膀胱癌较低敏感度仅为35％左右，且易受到泌尿系感染及结石等因素的影响而出现假阳性结果。由此可见，寻找一种敏感性、特异性较高，且便于检测预后的非侵入性检查手段已成为目前的研究重点，这将有助于提高膀胱恶性肿瘤的早期诊断，指导临床治疗，从而改善患者预后。
3、代谢组学主要是利用有关技术对一系列由病理或生理学改变引起的小分子代谢物质的动态变化进行定性或定量分析，利用先进的分析手段和统计手段，对各种疾病进行生物标记的检测与研究，从而使临床医师提高对疾病的诊断，在药物靶点、发病机制等方面获得更深刻的认识。代谢组学常用的分析技术包括磁共振(nuclear magnetic resonance，nmr)、气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，gc-ms)和液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，lc-ms)等。血液被认为是生物过程的积极参与者，利用血液进行基因标志物的研究已进入临床实验，可用于识别血液系统恶性肿瘤。另外，血清中还包括了人体各组织、器官的代谢物，既便于获得，又不易受外界因素影响，因此挖掘能够对膀胱癌进行早期诊断的特异性血清中的代谢标志物是亟需解决的问题。
技术实现思路
1、为此，本发明要解决的技术问题是提供一种膀胱癌诊断的代谢标志物及其应用。本发明的技术方案如下所述：
2、一种用于膀胱癌诊断或监测的血清代谢标志物，其包括牛酸、抗生素ji-20a、别胆酸、α-酮异戊酸、5-氨基戊酸、吡咯烷酮羧酸、l-脯氨酸、循环gmp、肌酸酐、血栓素b2、葡萄糖、胆绿素、阿斯巴甜、甘露醇、脱氧尿苷、l-酪氨酸、核黄素、山梨醇、左旋肉碱、β-丙氨酰-l-精氨酸、9-六溴二苯醚、吲哚、5-羟基-l-色氨酸、l-2-羟基戊二酸、γ-氨基丁酸、5-羟基吲哚乙酸、黄嘌呤、牛黄酸苷中的至少一种。
3、根据本发明的血清代谢标志物，其至少包括5-羟基-l-色氨酸、5-羟基吲哚乙酸、γ-氨基丁酸、黄嘌呤、牛黄酸苷、吲哚、左旋肉碱、l-脯氨酸、9-六溴二苯醚、抗生素ji-20a、l-2-羟基戊二酸中的一种。
4、根据本发明的血清代谢标志物，其至少包括左旋肉碱和l-脯氨酸中的一种或两种。
5、本发明中，所述血清代谢标志物可以是单独的标志物本身，或者是标志物的组合或组合物，例如包括其中的一种，两种或者多种，比如3种、4种、5种，8种，20种甚至所有28种。
6、本发明还保护一种用于膀胱癌诊断或监测的试剂盒，其含有如上所述的血清代谢标志物，以及任选的内标物和/或代谢物提取试剂。
7、本发明还保护上述血清代谢标志物的应用，其用于制备膀胱癌诊断或监测药物或试剂盒。
8、本发明还保护上述血清代谢标志物的另一应用，其用于建立监测或诊断膀胱癌的代谢物数据库。
9、本发明的代谢标志物中，牛酸、抗生素ji-20a、别胆酸、α-酮异戊酸、5-氨基戊酸、吡咯烷酮羧酸、l-脯氨酸、循环gmp、肌酸酐、血栓素b2、葡萄糖、胆绿素、阿斯巴甜、甘露醇、脱氧尿苷、l-酪氨酸、核黄素、山梨醇、左旋肉碱、β-丙氨酰-l-精氨酸合计20个标志物上调，9-六溴二苯醚、吲哚、5-羟基-l-色氨酸、l-2-羟基戊二酸、γ-氨基丁酸、5-羟基吲哚乙酸、黄嘌呤、牛黄酸苷合计8个差异性代谢物下调，那么，本发明代谢标志物的应用方式如下所述：与对照组相比，来自于待诊断或待评估的样本的上述代谢标志物的浓度发生变化，即当上述20种标志物中的一种或两种或者更多种浓度上调，和/或上述8种标志物中的一种或两种或者更多种浓度下调，由此可诊断样本的来源是否具有患膀胱癌的风险或者患有膀胱癌。
10、本发明中，血清待测样品需要经过样本采集、样本预处理步骤、和样本提取步骤后，再进行lc-ms检测分析。
11、本发明中，所述的样本采集步骤主要包括：待测者空腹采全血；室温放置一段时间；离心得上清液；任选地，当需要储存和运输时需速冻上清液后全程低温保存。
12、根据本发明，所述采集步骤中需在30s内速冻，所述低温可采用液氮保存或-70℃以下的冰箱保存。
13、本发明中，所述的样本预处理步骤主要包括：任选地解冻和混匀采集的冷冻样本的步骤；配制一系列体积梯度样本溶液并加入补充液、内标和蛋白沉淀试剂，离心取上清液浓缩得干渣，加入定量甲醇溶液复溶，混合后离心，取上清液作为标准曲线校正溶液。
14、根据本发明，所述补充液是水，所述内标为琥珀酸-2,2,3,3-d4、胆酸-2,2,3,4,4-d5、dl-色氨酸-2,3,3-d3、dl-蛋氨酸-3,3,4,4-d4、l-苯基丙氨酸-d5和氯化胆碱(三甲基-d9)的等体积混合物，所述蛋白沉淀试剂是甲醇。
15、根据本发明，预处理步骤中的解冻是在4℃环境解冻。
16、根据本发明，预处理步骤中离心在4℃进行。
17、根据本发明，预处理步骤中，甲醇溶液的浓度是70-90％，其温度为-15～-25℃。
18、本发明中，所述的样本提取步骤主要包括：任选地解冻和混匀采集的冷冻样本的步骤；取定量样本加入内标混标和甲醇，混匀；离心取上清液浓缩干燥；取定量甲醇复溶，混匀后再次离心，取上清液作为待测样本。
19、根据本发明，样本提取步骤中的解冻在4℃环境解冻。
20、根据本发明，定量样本：内标混标：甲醇的体积比例为1:1:4。
21、根据本发明，样本提取步骤中的离心在4℃进行。
22、根据本发明，定量样本：待浓缩干燥的上清液的体积比例为1：5。
23、根据本发明，加入定量样本的甲醇溶液的浓度是70-90％，其温度为-15～-25℃。
24、根据本发明，定量样本：复溶用的甲醇的体积比例为1:1.5。
25、因此，本发明还保护一种膀胱癌早期诊断或着监测模型的构建方法，其包括如下步骤:
26、(1)待测者的血清样本收集，
27、(2)样本预处理，
28、(3)样本提取，
29、(4)进行lc-ms检测分析，
30、(5)判断结果：比较对照品和待测者的检测结果，当牛酸、抗生素ji-20a、别胆酸、α-酮异戊酸、5-氨基戊酸、吡咯烷酮羧酸、l-脯氨酸、循环gmp、肌酸酐、血栓素b2、葡萄糖、胆绿素、阿斯巴甜、甘露醇、脱氧尿苷、l-酪氨酸、核黄素、山梨醇、左旋肉碱、β-丙氨酰-l-精氨酸、9-六溴二苯醚、吲哚、5-羟基-l-色氨酸、l-2-羟基戊二酸、γ-氨基丁酸、5-羟基吲哚乙酸、黄嘌呤、牛黄酸苷中的至少一种的血清代谢标志物浓度是否异常。
31、根据本发明构建方法，其中步骤(1)包括：离心全血样本得上清液，任选地，当需要储存和运输时需速冻上清液后全程低温保存。步骤(1)中的细节如前文所描述，步骤(2)-(3)如前文所描述。
32、本发明还保护一种如上所述的血清代谢标志物的检测方法，其包括如下步骤：
33、(1)离心全血样本得上清液，任选地，当需要储存和运输时需速冻上清液后全程低温保存；
34、(2)样本预处理，
35、(3)样本提取，
36、(4)进行lc-ms检测分析。
37、其中步骤(1)-(4)的细节如前文所描述。
38、有益效果
39、目前的膀胱癌诊断方法有的会带来介入性创伤、有的费用高昂、有的灵敏度较低、有的因方法本身的局限会漏检。本发明的血清代谢标志物检测法无创、灵敏度高、特异性高，操作简单方便，成本低，对膀胱癌的早期诊断、改善预后具有重要意义。
1.一种用于膀胱癌诊断或监测的血清代谢标志物，其包括牛酸、抗生素ji-20a、别胆酸、α-酮异戊酸、5-氨基戊酸、吡咯烷酮羧酸、l-脯氨酸、循环gmp、肌酸酐、血栓素b2、葡萄糖、胆绿素、阿斯巴甜、甘露醇、脱氧尿苷、l-酪氨酸、核黄素、山梨醇、左旋肉碱、β-丙氨酰-l-精氨酸、9-六溴二苯醚、吲哚、5-羟基-l-色氨酸、l-2-羟基戊二酸、γ-氨基丁酸、5-羟基吲哚乙酸、黄嘌呤、牛黄酸苷中的至少一种。
2.根据权利要求1的血清代谢标志物，其至少包括5-羟基-l-色氨酸、5-羟基吲哚乙酸、γ-氨基丁酸、黄嘌呤、牛黄酸苷、吲哚、左旋肉碱、l-脯氨酸、9-六溴二苯醚、抗生素ji-20a、l-2-羟基戊二酸中的一种。
3.根据权利要求1的血清代谢标志物，其至少包括左旋肉碱和l-脯氨酸中的一种或两种。
4.一种用于膀胱癌诊断或监测的试剂盒，其含有如权利要求1-3任一项所述的血清代谢标志物，以及任选的内标物和/或代谢物提取试剂。
5.权利要求1-3任一项所述的血清代谢标志物的应用，其用于制备膀胱癌诊断或监测的药物或试剂盒。
6.权利要求1-3任一项所述的血清代谢标志物的应用，其用于建立监测或诊断膀胱癌的代谢物数据库。
7.一种膀胱癌早期诊断或着监测模型的构建方法，其包括如下步骤:
8.一种如权利要求1-3任一项所述的血清代谢标志物的检测方法，其包括如下步骤：
9.根据权利要求7所述的构建方法或者权利要求8所述的检测方法，所述的样本预处理步骤主要包括：任选地解冻和混匀采集的冷冻样本的步骤；配制一系列体积梯度样本溶液并加入补充液、内标和蛋白沉淀试剂，离心取上清液浓缩得干渣，加入定量甲醇溶液复溶，混合后离心，取上清液作为标准曲线校正溶液。
10.根据权利要求7所述的构建方法或者权利要求8所述的检测方法，所述的样本提取步骤主要包括：任选地解冻和混匀采集的冷冻样本的步骤；取定量样本加入内标和甲醇，混匀；离心取上清液浓缩干燥；取定量甲醇复溶，混匀后再次离心，取上清液作为待测样本。
