本发明涉及生物，具体涉及重组腺相关病毒载体及其应用。
背景技术：
1、menkes综合征(menkes syndrome)又称menkes病(menkes disease，md)是一种x连锁隐性遗传病，由atp7a基因突变引起，临床表现为神经系统症状及全身多系统功能障碍。md根据临床表现不同分为经典型、轻型以及极轻型，其中极轻型md又称枕角综合征(occipital horn syndrome，ohs)。经典型md多于生后2～3个月开始出现临床表现，包括肌张力降低、发育迟缓、癫痫发作、共济失调、肌肉和关节松弛、皮肤白皙、毛发稀少卷曲、先天性骨折、骨骼畸形等，并多于3岁内死亡。轻型md和枕角综合征的临床表现多以结缔组织和骨骼异常为主，少数出现癫痫症状。
2、atp7a是一种铜转运酶。在肠道中，atp7a通过将铜离子从小肠转运到血液中来调节人体对铜离子的吸收。在其他组织中，atp7a在高尔基体和细胞膜之间穿梭以维持适当的铜离子浓度，对骨骼、皮肤、头发、血管和神经系统的结构和功能十分重要。铜供应的减少还会降低多种酶的活性，包括多巴胺-β-羟化酶(dopamine-β-hydroxylase，dbh)、酪氨酸酶(tyrosinase，tyr)等。dbh位于去甲肾上腺素神经元的胺存储囊泡内，是一种重要的神经递质合成酶，可催化多巴胺形成去甲肾上腺素。tyr是一种氧化酶，是调控黑色素生成的限速酶。铜含量减少，直接影响酪氨酸酶的活性，酪氨酸酶活性降低导致了黑色素的合成减少。此外，线粒体细胞色素c氧化酶、超氧化岐化酶、赖氨酰氧化酶等铜相关性酶活性下降会影响自由基清除、胶原合成、角蛋白合成。
3、腺相关病毒(aav)是细小病毒科的一种，对于体内递送遗传物质有很大潜力。aav载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。aav重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列(itrs)之间的dna片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，两个itr之间的外源dna及病毒基因组一起进入细胞，线性双链dna基因组以游离dna的形式存在于细胞核中。目前，人们已从自然界中鉴定出许多aav病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性。其中，aav9对心肌、肺、视网膜、皮肤等组织具有亲和性。此外，由于aav9具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。
4、通过对atp7a功能区域进行划分可分为6个铜结合区域，8个跨膜区域及磷酸酶，磷酸化和atp结合区域。由于现有技术所采用的aav骨架序列和表达调控序列，atp7a的载入使得aav病毒载体序列全长远远超过了常规载量。有文献报道，aav5和aav9可以作为rsatp7a(reduced-size atp7a)的载体，通过侧脑室注射的方式调控小鼠体内的atp7a水平。然而通过序列比对发现，rsatp7a序列直接删除了肽链的n端约1.4kb碱基的序列，很大概率破坏了信号肽的功能，失去了信号肽序列的引导，该蛋白无法经过正确的定位和加工，从而失去正常的功能。此外，rsatp7a的设计删除序列涉及前4个铜离子结合域，可能导致atp7a功能异常。
5、atp7a基因表达的蛋白是一个跨膜蛋白，在蛋白定位加工过程中需要信号肽的引导，目前该基因的信号肽序列还不明确，但大部分蛋白的信号肽位于肽链的n端，rsatp7a的设计直接删除了肽链的n端几百个碱基的序列，很大概率破坏了信号肽的功能，失去了信号肽序列的引导，该蛋白无法经过正确的定位和加工，从而失去正常的功能。
6、此外，atp7a基因所表达的蛋白一共6个铜离子结合域，rsatp7a的设计删除序列涉及前4个铜离子结合域，针对menkes综合征的治疗，该方法所保留下来的蛋白功能未在严谨的非临床和临床体系下进行过药效验证。且现有技术所采用的aav骨架序列和表达调控序列，所获得的病毒载体序列全长已经远远超过了aav病毒的常规载量。
7、因此，提供重组腺相关病毒介导的atp7a基因表达载体具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了重组腺相关病毒载体及其应用。
2、本发明提供了重组腺相关病毒载体及其应用。本发明选择的aav骨架序列和表达调控序列能够将载体全长压缩到5kb左右，可实现病毒包装。重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达atp7a蛋白，提高大脑、脊髓和一些外周组织脏器中的表达，有希望开发成为一种menkes的基因治疗药物。
3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
4、本发明提供了表达载体，包括广泛性启动子、编码atp7a蛋白的基因和多聚腺苷酸。
5、在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体能够将载体全长压缩到5kb左右。
6、在本发明的一些具体实施方案中，所述广泛性启动子包括但不限于efs。
7、在本发明的一些具体实施方案中，所述广泛性启动子(组成型启动子)包括：cmv(巨细胞病毒)；ef1a(延伸因子-1α)；efs；cag(巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成)；cbh；sffv；mscv；sv40(猿猴病毒来源)；mpgk；hpgk(磷酸甘油酸激酶)；ubc(泛素c)。
8、在本发明的一些具体实施方案中，所述多聚腺苷酸为shortpa。
9、在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体还包括kozak序列、aav反向末端重复序列中的一种或多种。
10、在本发明的一些具体实施方案中，所述aav反向末端重复序列包括aav 5’-itr和/或aav 3’-itr。
11、在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体依次包括aav 5’-itr、广泛性启动子、kozak序列、编码atp7a蛋白的基因、多聚腺苷酸和aav 3’-itr。
12、在本发明的一些具体实施方案中，所述多聚腺苷酸为shortpa。
13、在本发明的一些具体实施方案中，所述编码atp7a蛋白的基因的c端添加标签，所述标签包括但不限于ha。
14、在本发明的一些具体实施方案中，所述编码atp7a蛋白的基因包括：
15、(ⅰ)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或
16、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
17、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
18、(ⅳ)、与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
19、在本发明的一些具体实施方案中，所述efs启动子包括：
20、(ⅰ)、如seq id no:1所示核苷酸序列；或
21、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
22、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
23、在本发明的一些具体实施方案中，所述多聚腺苷酸包括：
24、(ⅰ)、如seq id no:3所示核苷酸序列；或
25、(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
26、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
27、在本发明的一些具体实施方案中，所述多聚腺苷酸为shortpa。
28、本发明还提供了所述表达载体在制备腺相关病毒表达载体中的应用。
29、在上述研究的基础上，本发明还提供了腺相关病毒表达载体，包括腺相关病毒衣壳和所述表达载体。
30、在本发明的一些具体实施方案中，所述腺相关病毒衣壳为aav9衣壳。
31、本发明还提供了病毒颗粒，包括所述腺相关病毒表达载体。
32、本发明还提供了宿主，包括：
33、(i)、转染所述腺相关病毒表达载体；和/或
34、(ii)、转导所述病毒颗粒。
35、在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括细胞或微生物，凡是可以作为宿主的均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
36、本发明还提供了如下任意项在制备预防、减轻和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用：
37、(ⅰ)、所述表达载体；和/或
38、(ⅱ)、所述腺相关病毒表达载体；和/或
39、(iii)、所述病毒颗粒；和/或
40、(iv)、所述宿主。
41、在本发明的一些具体实施方案中，所述神经系统疾病包括涉及运动功能的神经元疾病。
42、在本发明的一些具体实施方案中，所述神经元疾病包括menkes综合征、脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化或外伤性脊髓损伤中的至少一种。
43、在本发明的一些具体实施方案中，所述神经元疾病包括menkes综合征、枕角综合征或远端型遗传性运动神经病中的一种或多种。
44、在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的给药方式为注射；
45、所述注射包括静脉注射、侧脑室注射、小脑延髓池注射或鞘内注射中的至少一种。
46、在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括细胞或微生物，凡是可以作为宿主的均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
47、本发明还提供了药物，包括以下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂；
48、(i)、所述腺相关病毒表达载体；和/或
49、(ⅱ)、所述病毒颗粒；和/或
50、(iii)、所述宿主。
51、在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的给药方式为注射；
52、所述注射包括静脉注射、侧脑室注射、小脑延髓池注射或鞘内注射中的至少一种。
53、在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括细胞或微生物，凡是可以作为宿主的均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
54、本发明还提供了药物组合，包括所述的药物以及其他任意有效成分。
55、本发明提供了重组腺相关病毒载体及其应用。本发明选择的aav骨架序列和表达调控序列能够将载体全长压缩到5kb左右，可实现病毒包装。重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达atp7a蛋白，提高大脑、脊髓和一些外周组织脏器中的表达，有希望开发成为一种menkes的基因治疗药物。
1.表达载体，其特征在于，包括广泛性启动子、编码atp7a蛋白的基因和多聚腺苷酸。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述广泛性启动子包括但不限于efs。
3.如权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，还包括kozak序列、aav反向末端重复序列中的一种或多种。
4.如权利要求1至3任一项所述的表达载体，其特征在于，所述aav反向末端重复序列包括aav 5’-itr和/或aav 3’-itr。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，依次包括aav 5’-itr、广泛性启动子、kozak序列、编码atp7a蛋白的基因、多聚腺苷酸和aav 3’-itr。
6.如权利要求1至5任一项所述的表达载体，其特征在于，所述编码atp7a蛋白的基因包括：
7.如权利要求1至6任一项所述的表达载体在制备腺相关病毒表达载体中的应用。
8.腺相关病毒表达载体，其特征在于，包括腺相关病毒衣壳和如权利要求1至6任一项所述的表达载体。
9.如权利要求8所述的腺相关病毒表达载体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳为aav9衣壳。
10.病毒颗粒，其特征在于，包括如权利要求8或9所述的腺相关病毒表达载体。
11.宿主，其特征在于，包括：
12.如下任意项在制备预防、减轻和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用：
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病包括涉及运动功能的神经元疾病。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病包括menkes综合征、枕角综合征或远端型遗传性运动神经病中的一种或多种。
15.如权利要求12至14任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为注射；
16.药物，其特征在于，包括以下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂；
17.如权利要求16所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式为注射；
18.药物组合，其特征在于，包括如权利要求16或17所述的药物以及其他任意有效成分。
