本发明涉及微流控芯片，具体涉及一种基于成像联合集成电路的高通量单细胞微流控检测芯片及其制备方法和应用。
背景技术：
1、针对单细胞内的dna、rna、蛋白质的研究，极大拓展了我们对于细胞群体的认识，展示了细胞群体的异质性。为我们展示了更广阔的细胞群体差异，为发现罕见细胞类型、探究疾病作用机理，奠定了坚实的基础。
2、然而，目前在高通量水平无法对罕见细胞类型进行特异性捕获和操纵。特别在高通量单细胞测序(检测)中，主要基于液滴微流控技术，需要保证在同一个液滴中同时包含有一个细胞和一个带有条形码的微珠，在这个过程中需要符合泊松分布，细胞利用率较低(10％)。同时目前的商业化高通量单细胞测序方法中，也无法通过荧光标记对细胞进行分析，同时获得具有特异性荧光标记的细胞内的dna、rna、蛋白质等相关信息。
3、因此，需要提供一种高通量单细胞微流控检测芯片及其制备方法和应用。
技术实现思路
1、基于以上的需求，本公开提供一种单细胞微流控检测芯片以及一种基于成像联合集成电路的高通量单细胞微流控检测芯片的制备方法及其应用。
2、根据本发明的第一方面，提供一种单细胞微流控检测芯片。所述微流控检测芯片从上之下依次包括：细胞流入层；细胞沉降微孔层；集成电路层。
3、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述微流控检测芯片可以封装于玻璃载玻片上。
4、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述细胞流入层可以包括细胞流入通道和流出通道。
5、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述细胞沉降微孔层包括微孔，便于细胞沉降。
6、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，在所述集成电路层，在每个圆柱形微孔的底部，具有一对集成电路电极，其中，所述一对集成电路电极分别接通外部高压电生成系统。
7、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述细胞流入层的高度为15-100微米。
8、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述细胞沉降微孔层包括有96-10000个微孔。
9、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述微孔的形状可以包括以下至少一种：圆柱形、三角形、正方形、五边形、六边形。
10、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述微孔的直径为15-100微米。
11、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，所述微孔的高度为20-100微米。
12、在根据本发明第一方面的微流控检测芯片中，在所述集成电路层，每对电极中每个电极位于微孔底部的长度为5-50微米，每对电极中两个电极尖端的距离为2-4微米。
13、根据本发明的第二方面，提供一种单细胞微流控检测芯片的制备方法。所述方法可以包括：制备集成电路层；在集成电路层之上，制备细胞沉降微孔层；在细胞沉降微孔层之上，制备细胞流入层。
14、在根据本发明第二方面的制备方法中，采用软光刻的方法来制备集成电路层、细胞沉降微孔层和细胞流入层。
15、在根据本发明第二方面的制备方法中，首先分别制备芯片模板，然后使用所述芯片模板来制备集成电路层、细胞沉降微孔层和细胞流入层的三层结构。
16、在根据本发明第二方面的制备方法中，利用聚二甲基硅氧烷(pdms)材料制备集成电路层、细胞沉降微孔层和细胞流入层。
17、在根据本发明第二方面的制备方法中，首先通过光蚀刻技术制备芯片模板，然后在所述芯片模板上通过气相金属沉积来制备集成电路层。
18、在根据本发明第二方面的制备方法中，利用等离子体法，从上到下封接单细胞微流控检测芯片的细胞流入层、细胞沉降微孔层、集成电路层。
19、根据本发明的第三方面，提供一种使用单细胞微流控检测芯片对细胞进行检测的方法。所述方法包括如下步骤：根据本发明第二方面的制备方法来制备单细胞微流控检测芯片；针对细胞使用多种荧光抗体标记目标蛋白；细胞通过液路加入所述芯片的细胞流入层，沉积于所述芯片的细胞沉降微孔层的微孔底部；带有细胞捕获标签的标记微珠通过液路加入所述芯片的细胞流入层，沉积于所述芯片的细胞沉降微孔层的微孔上部；在细胞流入层中加入密封油；利用荧光显微镜成像，确认一种荧光抗体标记的细胞在所述芯片中所在的微孔；向所确认的微孔下的所述芯片的集成电路层中的集成电路施加高电压，裂解荧光抗体标记的目标细胞；重复以上的荧光显微镜成像和向集成电路施加高压电裂解的步骤，对多种荧光抗体标记进行检测。
20、在根据本发明第三方面的方法中，所述的细胞通过液路加入所述芯片的细胞流入层，沉积于所述芯片的细胞沉降微孔层的微孔底部的步骤进一步包括：细胞通过液路加入细胞流入层；通过缓慢沉降，细胞沉积于细胞沉降微孔层的微孔底部；控制细胞的加入数量和多次冲洗，使得每个微孔内仅有1个细胞。
21、在根据本发明第三方面的方法中，所述的带有细胞捕获标签的标记微珠通过液路加入所述芯片的细胞流入层，沉积于所述芯片的细胞沉降微孔层的微孔上部的步骤进一步包括：带有细胞捕获标签的标记微珠通过液路加入细胞流入层；通过缓慢沉降，标记微珠沉降于细胞沉降微孔层的微孔上部；通过微珠的尺寸控制和多次冲洗，使得每个微孔内仅有1个微珠。
22、在根据本发明第三方面的方法中，所述的在细胞流入层中加入密封油的步骤进一步包括：在细胞流入层中加入密封油；将大部分细胞流入层的液体替换成密封油；每个细胞与每个微珠被密封油封装在同一个微孔之中。
23、在根据本发明第三方面的方法中，所述的利用荧光显微镜成像，确认一种荧光抗体标记的细胞在所述芯片中所在的微孔的步骤进一步包括：获取一种荧光抗体标记的细胞在所述芯片中所在的微孔的位置坐标。
24、在根据本发明第三方面的方法中，所述的向所确认的微孔下的所述芯片的集成电路层中的集成电路施加高电压，裂解荧光抗体标记的目标细胞的步骤进一步包括：使得目标细胞的内容物被微珠捕获。
25、在根据本发明第三方面的方法中，所述的重复以上的荧光显微镜成像和向集成电路施加高压电裂解的步骤，对多种荧光抗体标记进行检测进一步包括：确认对应荧光抗体标记细胞的微孔，从而裂解目标细胞。
26、优选地，所述的确认对应荧光抗体标记细胞的微孔，从而裂解目标细胞的步骤进一步包括：获取对应荧光抗体标记细胞的微孔的位置坐标；裂解目标细胞，使得目标细胞内容物被微珠所捕获。
27、本发明公开了一种高通量单细胞微流控检测芯片，可以将一个细胞与一个捕获微珠封装在同一个微孔之中，并可通过对细胞荧光标记进行成像的方式，通过集成电路，特异性地对目标细胞进行裂解，从而捕获目标细胞的内容物，进行后续的dna、rna、蛋白质分析。
28、本发明拓展了单细胞测序领域内目标细胞的捕获方式，实现在同一张单细胞微流控检测芯片上，进行细胞成像、细胞裂解、细胞捕获。这种集成化的细胞分析方式，可以平行大规模拓展，每一张芯片上可以进行不少于10000个细胞的捕获和特异性分析。
1.一种单细胞微流控检测芯片，其特征在于，所述微流控检测芯片从上之下依次包括：
2.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述微流控检测芯片封装于玻璃载玻片上。
3.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述细胞流入层包括细胞流入通道和流出通道。
4.根据权利要求3所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述细胞沉降微孔层包括微孔，便于细胞沉降。
5.根据权利要求4所述的微流控检测芯片，其特征在于，在所述集成电路层，在每个圆柱形微孔的底部，具有一对集成电路电极，其中，所述一对集成电路电极分别接通外部高压电生成系统。
6.根据权利要求3所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述细胞流入层的高度为15-100微米。
7.根据权利要求4所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述细胞沉降微孔层包括有96-10000个微孔。
8.根据权利要求4所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述微孔的形状包括以下至少一种：圆柱形、三角形、正方形、五边形、六边形。
9.根据权利要求4所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述微孔的直径为15-100微米。
10.根据权利要求4所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述微孔的高度为20-100微米。
11.根据权利要求5所述的微流控检测芯片，其特征在于，在所述集成电路层，每对电极中每个电极位于微孔底部的长度为5-50微米，每对电极中两个电极尖端的距离为2-4微米。
12.一种单细胞微流控检测芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，采用软光刻的方法来制备集成电路层、细胞沉降微孔层和细胞流入层。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，首先分别制备芯片模板，然后使用所述芯片模板来制备集成电路层、细胞沉降微孔层和细胞流入层的三层结构。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，利用聚二甲基硅氧烷(pdms)材料制备集成电路层、细胞沉降微孔层和细胞流入层。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，首先通过光蚀刻技术制备芯片模板，然后在所述芯片模板上通过气相金属沉积来制备集成电路层。
17.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，利用等离子体法，从上到下封接单细胞微流控检测芯片的细胞流入层、细胞沉降微孔层、集成电路层。
18.一种使用单细胞微流控检测芯片对细胞进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的细胞通过液路加入所述芯片的细胞流入层，沉积于所述芯片的细胞沉降微孔层的微孔底部的步骤进一步包括：
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的带有细胞捕获标签的标记微珠通过液路加入所述芯片的细胞流入层，沉积于所述芯片的细胞沉降微孔层的微孔上部的步骤进一步包括：
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的在细胞流入层中加入密封油的步骤进一步包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的利用荧光显微镜成像，确认一种荧光抗体标记的细胞在所述芯片中所在的微孔的步骤进一步包括：
23.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的向所确认的微孔下的所述芯片的集成电路层中的集成电路施加高电压，裂解荧光抗体标记的目标细胞的步骤进一步包括：
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的重复以上的荧光显微镜成像和向集成电路施加高压电裂解的步骤，对多种荧光抗体标记进行检测进一步包括：
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的确认对应荧光抗体标记细胞的微孔，从而裂解目标细胞的步骤进一步包括：
