腺病毒疫苗媒介物中的CD40和CD40L结合物的制作方法

腺病毒疫苗媒介物中的cd40和cd40l结合物
1.本申请要求2018年10月5日提交的序列号为62/742,167和2018年11月2日提交的序列号为62/755,217的共同待决的美国临时申请的优先权。
2.序列表
3.名为sequence_listing_st25.txt、大小为45kb的序列表的ascii文本文件创建于2019年9月19日，通过efs
‑
web与本申请一起以电子方式提交，并且将其内容通过引用以其全文并入。
技术领域
4.本披露涉及癌症疫苗，其包括编码cd40/cd40l融合蛋白和肿瘤相关抗原的重组核酸，以及改善的基于新表位的免疫疗法的组合物和方法。某些特定的披露涉及包含上述核酸和/或融合分子的组合物，以及使用这些核酸和/或融合分子来增强针对癌症疗法的免疫应答的方法。


背景技术：

5.以下描述包括可用于理解本披露的信息。本文不承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明有关，也不承认明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。
6.本文中鉴定的所有出版物均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入一样。在并入的参考文件中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用而在该参考文件中该术语的定义不适用。
7.tnf家族成员受体(例如cd40、4
‑
1bb或ox40)及其各自的配体在调节细胞免疫和体液免疫中起着关键作用。例如，4
‑
1bb信号传导与nk细胞激活一起增加了抗体依赖性细胞毒性(adcc)和干扰素γ(ifn
‑
γ)分泌，而ox40信号传导与t细胞激活和分化有关。在其他实例中，多种免疫细胞表达cd40，抗原呈递细胞(apc，例如树突细胞、巨噬细胞、和b细胞)也表达cd40。除其他作用外，cd40l/cd40对于激活和“许可”树突细胞以引发细胞毒性cd8 t细胞是至关重要的。最典型地，在cd4 辅助t细胞上表达的cd40配体(cd40l)与apc上的cd40接合，从而诱导apc激活和成熟。经cd40许可的apc诱导抗原特异性cd8 细胞毒性t细胞的激活和增殖。值得注意的是，在没有cd40信号传导的情况下，cd8 t细胞和未经许可的apc诱导t细胞无变应性并触发调节性t细胞形成，这是尽管存在其他抗原性肽的呈递但肿瘤在哺乳动物中持续存在的机制。
8.可以使用激动性抗体或可溶性cd40l来有效地触发cd40信号传导(例如，int rev immunol[国际免疫学评论]2012,31:246
‑
66)。然而，此类方法受到全身毒性的限制(例如，j clin oncol[临床肿瘤学杂志]2007,25:876
‑
83；science[科学]2012,331:1612
‑
16)。
[0009]
cd40信号传导功效取决于cd40多聚化。cd40l和gp100肿瘤抗原的多三聚体融合构建体在b16
‑
f10黑素瘤dna疫苗模型中可激活树突细胞并提高存活率(参见例如，vaccine.[疫苗]2015 33(38):4798
‑
806)。
[0010]
在wo 00/63395中报道了一种嵌合多肽，该嵌合多肽由与50
‑
100个氨基酸的间隔子融合的cd40信号转导结构域组成，该间隔子又与cd40l结合和三聚化结构域融合。
[0011]
类似地，在wo 02/36769中报道了一种嵌合多肽，该嵌合多肽由与2型受体跨膜结构域融合的cd40信号传导结构域组成，该2型受体跨膜结构域又与cd40l结合和三聚化结构域融合。
[0012]
wo 00/63395和wo 02/36769均未报道在植入用这些构建体转染的肿瘤细胞的小鼠中具有治疗作用。
[0013]
在us 7,404,950中报道了一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白由与fk506配体结合区和豆蔻酰化膜靶向区融合的cd40胞质区组成。
[0014]
在us 8,999,949中报道了具有多聚体配体结合区和缺少胞外结构域的cd40部分的融合蛋白。
[0015]
虽然此类构建体可以在体外提供一些增加的活性，但是当施用于哺乳动物时它们倾向于具有抗原性。
[0016]
因此，虽然本领域已知多种调节tnf家族成员受体/配体信号传导的方式，但是这些方式全部或几乎全部都具有一个或多个缺点。因此，仍然需要改善tnf家族受体/配体信号传导的调节。
[0017]
此外，靶向特定癌症所共用的某些抗原的免疫疗法在一些患者中引起了明显的应答。令人遗憾的是，尽管相同抗原有显性表达，但许多患者未能对这种免疫疗法产生应答。这种应答失败的一个可能的原因是多种免疫效应细胞可能没有以足够的量存在，或可能已经耗尽。而且，患者中细胞内抗原加工和hla变异性可能已经导致抗原加工和/或展示不足。
[0018]
肿瘤细胞中的一些随机突变可能产生独特的肿瘤特异性抗原(新表位)。新表位可提供用于免疫疗法的独特的精确靶标。另外，非常少量的肽可以触发细胞溶解性t细胞应答(例如，sykulev等人(1996)immunity[免疫性],4(6):565
‑
71)。而且，由于在许多癌症中突变的数量相对较多，可能的靶标数量相对较高。鉴于这些发现，将癌症新表位鉴定为治疗靶标已经引起了广泛关注。令人遗憾的是，目前的数据表明几乎所有的新表位对于患者和特定的肿瘤均是独特的，并且未能提供关于哪种新表位可用于治疗有效的免疫治疗剂的任何具体指示。
[0019]
然而，即使当过滤新表位的突变类型(例如，以确定错义或无义突变)、突变基因的经确认的转录、蛋白质表达和/或特异性hla结合时(如wo 2016/172722中所述)，持久和治疗有效的免疫应答可能仍然难以捉摸。例如，可以通过肿瘤微环境中的抑制性条件来防止免疫力。此外，并非所有的新表位都以相同强度触发免疫反应。一些新表位可能几乎没有免疫原性。
[0020]
尽管已知多种新表位鉴定和递送至多种细胞的方法，但这些方法中的全部都具有多个缺点。因此，需要改善的系统和方法用于新表位选择和生产以增加治疗应答的可能性。


技术实现要素：

[0021]
本文披露了编码包含tnf家族成员配体和tnf家族成员受体的嵌合蛋白并编码肿瘤相关抗原的重组核酸的组合物、方法和用途。还披露了包括此类核酸的经基因修饰的免疫细胞。还披露了使用此类重组核酸和/或经基因修饰的免疫细胞治疗癌症的方法。例如，
本文提供了重组表达盒，其包含与重组核酸可操作地偶联的启动子。重组表达盒可以是rna和/或病毒表达载体的一部分。重组表达盒包含编码嵌合蛋白的第一核酸区段和编码肿瘤相关抗原的第二核酸区段，该嵌合蛋白具有tnf家族成员配体的胞外部分，该胞外部分通过柔性接头与其相应的tnf家族成员受体偶联。最典型地，tnf家族成员配体的胞外部分相对于嵌合蛋白中的tnf家族成员受体位于n
‑
末端。此外，优选地，柔性接头具有4和50个之间的氨基酸，并且任选地包含(gns)x序列。
[0022]
在某些实施例中，重组表达盒包含编码与cd40l(cd40配体)的胞外部分的n
‑
末端偶联的前导肽的第三核酸区段。在这样的实施例中，cd40l的胞外部分可以是cd40l的人胞外部分。在一些实施例中，肿瘤相关抗原选自由短尾突变蛋白(brachyury)、muc1和cea组成的组。在其他实施例中，肿瘤相关抗原是患者
‑
和肿瘤特异性新表位。
[0023]
在某些优选的实施例中，第一和第二核酸区段置于相同阅读框中。可替代地，第一和第二核酸区段可以经由ires或2a序列偶联。
[0024]
在某些实施例中，重组表达盒可以进一步包含编码免疫刺激细胞因子的第四核酸区段。在这样的实施例中，免疫刺激细胞因子可以是与il
‑
7和il
‑
21中的至少一种偶联的il
‑
15超激动剂(alt803)。
[0025]
在某些实施例中，经基因工程化的病毒可以包括上述重组表达盒。
[0026]
在仍其他实施例中，经基因修饰的免疫细胞可包含具有第一和第二核酸区段、以及任选的第三和第四核酸区段的重组核酸。第一核酸区段编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有tnf家族成员配体的胞外部分，该胞外部分通过柔性接头与其相应的tnf家族成员受体偶联。第二核酸区段编码肿瘤相关抗原。最典型地，tnf家族成员配体的胞外部分位于嵌合蛋白的n
‑
末端，并且tnf家族成员受体位于嵌合蛋白的c
‑
末端。此外，优选地，柔性接头具有4和50个之间、或8和50个之间、或甚至更多个氨基酸，并且任选地包含(gns)x序列。
[0027]
经基因修饰的免疫细胞可以源自树突细胞，并且更优选地，患者的树突细胞(同种异体树突细胞)。在这样的实施例中，可以从患者的血液中获得患者自身的树突细胞，并且在用重组核酸进行基因修饰之前和/或之后进行离体扩增。
[0028]
优选地，重组核酸包含编码与cd40l的胞外部分的n
‑
末端偶联的前导肽的第三核酸区段。在这样的实施例中，cd40l胞外部分是人胞外cd40l部分。
[0029]
本文还披露了治疗患有肿瘤的患者的方法。经基因工程化的病毒可以按有效治疗肿瘤的剂量和时间表施用于患者。最典型地，经基因工程化的病毒包括具有第一和第二核酸区段的重组核酸。第一核酸区段编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有tnf家族成员配体的胞外部分，该胞外部分通过柔性接头与其相应的tnf家族成员受体偶联。第二核酸区段编码肿瘤相关抗原。最典型地，tnf家族成员配体的胞外部分相对于嵌合蛋白中的tnf家族成员受体位于n
‑
末端。此外，优选地，柔性接头具有4和50个之间的氨基酸，并且任选地包含(gns)x序列。
[0030]
在某些优选的实施例中，重组核酸包含编码与cd40l的胞外部分的n
‑
末端偶联的前导肽的第三核酸区段。在这样的实施例中，cd40l胞外部分可以是人cd40l胞外部分。在一些实施例中，肿瘤相关抗原选自由短尾突变蛋白、muc1和cea组成的组。在其他实施例中，肿瘤相关抗原是患者
‑
和肿瘤特异性新表位。
[0031]
在某些优选的实施例中，第一和第二核酸区段置于相同阅读框中。可替代地，第一
和第二核酸区段可以经由ires序列偶联。另外，重组核酸还可以进一步包含编码免疫刺激细胞因子的第四核酸区段。在这样的实施例中，免疫刺激细胞因子可以是单独的或与il
‑
7和il
‑
21中的至少一种偶联的il
‑
15超激动剂(alt803)。
[0032]
任选地，该方法可以进一步包括向患者施用检查点抑制剂和/或il
‑
15超激动剂(alt803)，其中该检查点抑制剂或alt803与il
‑
7和il
‑
21中的至少一种偶联。此外，该方法可包括共施用经基因修饰的细菌或经基因修饰的酵母作为经基因工程化的病毒的佐剂。在这样的实施例中，经基因修饰的细菌可以按不足以诱导cd
‑
14介导的脓毒症的水平表达内毒素。在某些实施例中，经基因修饰的酵母是gi
‑
400系列重组免疫治疗酵母菌株。
[0033]
本文还披露了经基因工程化的病毒、重组表达盒、和/或经基因修饰的免疫细胞用于产生用来治疗患有癌症的患者的药物组合物或用于治疗患有癌症的患者的用途。
[0034]
在特别优选的方面，构建了cd40l
‑
cd40融合蛋白并使其在apc中表达，其中该融合蛋白能够自身折叠以传输cd40介导的信号，如同它被具有cd40l的单独的细胞(例如，cd4 t细胞)激活一样。类似地，在进一步考虑的方面中，4
‑
1bb配体/4
‑
1bb和ox40l/ox40融合蛋白可以在合适的免疫感受态细胞中表达。
[0035]
本文描述了一种嵌合蛋白，其包括，按从n
‑
末端至c
‑
末端的序列，通过柔性接头与cd40偶联的cd40l胞外部分。在某些实施例中，嵌合蛋白还包含与cd40l胞外部分的n
‑
末端偶联的前导肽。
[0036]
在某些优选的实施例中，cd40l胞外部分是人胞外部分，并且cd40是人cd40。在某些优选的实施例中，柔性接头具有4和25个之间或8和50个之间的氨基酸(例如，包括(g
n
s)
x
基序，其中n和x独立地为1和5之间)。最典型地，与全长序列相比，cd40缺少信号序列。在某些实施例中，嵌合蛋白可具有根据seq id no:1
‑
10中任一项的序列。
[0037]
本文还披露了重组表达盒，其包括与编码如上所述的嵌合蛋白的区段可操作地偶联的启动子。重组表达盒还可以包括第二区段，该第二区段编码细胞因子和/或选自由以下组成的组的肽的至少一部分：肿瘤相关抗原(taa)、肿瘤特异性抗原(tsa)、肿瘤特异性新表位、及其组合。重组表达盒可以是rna，或者可以是病毒表达载体的一部分(其可以或可以不包封)。
[0038]
本文描述了用如本文所述的重组表达盒转染的重组细胞。在某些实施例中，细胞是apc(例如，树突细胞)，和/或细胞被瞬时转染。
[0039]
本文还描述了增强针对抗原的免疫反应的方法。这些方法包括用包含如本文所述的重组表达盒的核酸构建体转染apc，并使经转染的细胞与抗原接触或在经转染的细胞中表达抗原。在接触或表达后，然后使经转染的细胞与cd4 t细胞和/或cd8 t细胞接触。
[0040]
作为非限制性实例，肿瘤和患者特异性新表位或者肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)的至少一部分可用作上述方法的抗原。转染可以离体进行，并且接触可以在体内进行。因此，针对抗原的反应可以是针对个体中的肿瘤或病毒(例如，hiv)的免疫反应。
[0041]
本文还披露了治疗个体中的肿瘤的方法。这些方法包括用如本文所述的重组表达盒转染个体的apc，并使经转染的细胞与肿瘤抗原接触或在经转染的细胞中表达肿瘤抗原。在接触或表达后，然后使经转染的细胞与个体的cd4 t细胞和/或cd8 t细胞接触。
[0042]
如前所述，转染可以离体进行，并且接触可以在体内进行。而且，肿瘤抗原可以是肿瘤和患者特异性新表位或者taa或tsa的至少一部分。在优选的方面中，apc是树突细胞，
并且重组表达盒是mrna或腺病毒的一部分。
[0043]
在某些实施例中，如本文所述的嵌合蛋白和/或重组细胞可用于治疗癌症或病毒感染。
[0044]
本文描述了多种免疫治疗组合物和方法。特别地，描述了重组病毒表达系统，其中佐剂多肽与多个选择的新表位(典型地处于具有运输信号的合理设计的多肽的形式)一起被编码以增加抗原加工和呈递并最大化治疗效果。
[0045]
本文描述了产生表达载体以及用于增强免疫疗法的表达载体的方法。这些方法包括构建重组核酸，该重组核酸具有编码可操作地连接至第一启动子以驱动多表位的表达的多表位，并且进一步编码可操作地连接至第二启动子以驱动佐剂多肽的表达的佐剂多肽的序列。最优选地，多表位包含将该多表位引导至亚细胞位置(例如，细胞质、再循环内体、分选内体、溶酶体、或胞外膜)的运输元件。另外地或可替代地，运输元件可以将多表位引导至胞外空间。多表位还可包含多个经过滤的新表位序列。
[0046]
在某些实施例中，佐剂多肽是钙网蛋白或hmgb1、或者具有佐剂活性的钙网蛋白或hmgb1的一部分。第一和/或第二启动子可以是组成型活性启动子或诱导型启动子(例如，可被低氧、ifn
‑
γ或il
‑
8诱导)。合适的运输元件包括但不限于可切割的泛素、不可切割的泛素、cd1b前导序列、cd1a尾、cd1c尾和lamp1
‑
跨膜序列。
[0047]
最典型地，通过将来自相同患者的肿瘤与匹配的常态序列进行比较来过滤经过滤的新表位序列。也可以过滤序列以对mhc复合物具有≥200nm的结合亲和力。而且，经过滤的新表位序列可以排列在多表位内，使得该多表位具有疏水序列或信号肽的存在可能性，和/或具有低于预定阈值的疏水序列或信号肽强度。
[0048]
在某些实施例中，经过滤的新表位序列与mhc
‑
i结合，并且运输元件将多表位引导至细胞质或蛋白酶体。在某些实施例中，经过滤的新表位序列与mhc
‑
i结合，并且运输元件将多表位引导至再循环内体、分选内体、或溶酶体。在某些实施例中，经过滤的新表位序列与mhc
‑
ii结合，并且运输元件将多表位引导至再循环内体、分选内体、或溶酶体。另外，重组核酸可进一步包含编码第二多表位的序列，其中该第二多表位包含将该第二多表位引导至不同亚细胞位置的第二运输元件，并且其中该第二多表位包含第二多个经过滤的新表位序列。在这种情况下，多个经过滤的新表位序列中的至少一些和第二多个经过滤的新表位序列中的一些可以是相同的。
[0049]
如本文所披露，重组核酸可进一步包含编码以下中的至少一种的序列：共刺激分子(例如，ox40l、4
‑
1bbl、cd80、cd86、cd30、cd40、cd30l、cd40l、icos
‑
l、b7
‑
h3、b7
‑
h4、cd70、gitr
‑
l、tim
‑
3、tim
‑
4、cd48、cd58、tl1a、icam
‑
1和lfa3)、免疫刺激细胞因子(例如，il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
15超激动剂(alt803)、il
‑
21、ips1和lmp1)、和/或干扰或下调检查点抑制的蛋白质(例如，ctla
‑
4、pd
‑
1、tim1受体、2b4或cd160的抗体或拮抗剂)。
[0050]
合适的表达载体包括缺失了e1和e2b基因的腺病毒表达载体、酵母表达载体、和细菌表达载体。本文描述了包含本文提出的表达载体的重组病毒、酵母和细菌。本文还描述了包含携带重组表达载体的重组病毒、酵母或细菌的药物组合物。本文还披露了表达载体用于治疗癌症和/或制备用于治疗癌症的疫苗组合物的用途。
[0051]
本文描述了治疗个体的方法。这些方法包括施用包含如本文提出的表达载体的疫苗组合物，其中在有效地使个体的树突细胞同时暴露于至少一部分多表位和至少一部分佐
剂多肽的条件下施用该疫苗。
[0052]
可替代地或另外地，本文描述了改善对癌症的免疫应答的方法。个体中的这些免疫疗法包括向个体的肿瘤施用癌症疫苗组合物，并且基本上同时(即，当癌症疫苗组合物在患者体内以可测量的量存在时)向肿瘤共施用佐剂多肽、atp、或atp类似物。
[0053]
癌症疫苗组合物可包含重组腺病毒、重组酵母、或重组细菌，和/或包含或编码患者的肿瘤新表位。作为非限制性实例，可以将癌症疫苗组合物直接施用于肿瘤。合适的佐剂多肽包括但不限于，钙网蛋白或其具有佐剂活性的部分、或者hmgb1或其具有佐剂活性的部分。在某些实施例中，佐剂是不可水解的atp类似物。可以将佐剂直接注射到肿瘤中。
[0054]
本文披露的技术的多种目的、特征、方面和优点将根据以下详细描述和附图而变得更清楚。
附图说明
[0055]
图1描绘了示例性融合蛋白的预测结构的几个视图。
[0056]
图2描绘了表达示例性融合蛋白的细胞的结果。
[0057]
图3证明这些构建体在不同物种(鼠)中是可操作的。
[0058]
图4描绘了il
‑
8在所选细胞系中的分泌。
[0059]
图5证明构建体在不同物种中是可操作的。
[0060]
图6描绘了在293t细胞中的表面表达。
[0061]
图7描绘了在b16f10细胞中的表面表达。
[0062]
图8比较了相对cd40
‑
cd40l融合体，用cd40转染并随后用可溶性cd40l刺激的293t细胞。
[0063]
图9描绘了从用人/小鼠构建体转染的细胞产生的293t(人)和b16f10(小鼠)细胞因子。
[0064]
图10a说明了包括hil7和il21的嵌合体的示例性二聚体。图10b说明了包括mil7和il21的嵌合体的示例性二聚体。图10c说明了包括hil21的嵌合体的示例性二聚体。图10d说明了包括hil7的嵌合体的示例性二聚体。图10e说明了包括hil18和il12的嵌合体的示例性二聚体。图10f说明了包括hil18的嵌合体的示例性二聚体。
[0065]
图11是多种新表位排列的示意性图示。
[0066]
图12是用于选择优选的新表位排列的示例性部分示意图。
[0067]
现有技术图13是细胞质抗原加工和mhc
‑
i呈递的示意图。
[0068]
现有技术图14是溶酶体和内体抗原加工和mhc
‑
ii呈递的示意图。
[0069]
图15是用于癌症疫苗的重组腺病毒表达盒的示意图。
具体实施方式
[0070]
如本文所披露，可以通过干扰apc中的cd40信号传导以期望的方向(即，增强或减弱)调节针对肿瘤细胞的免疫应答。可以通过诱导apc表达一个或多个taa来显著增强针对肿瘤细胞的免疫应答。诱导apc中嵌合蛋白和taa的表达的疫苗组合物可治疗表达该taa的肿瘤。因此，本文描述了重组表达盒，其包括编码taa和调节cd40信号传导事件的嵌合蛋白的核酸序列。
[0071]
如本文所用，“肿瘤”是指以下项并且与以下项可互换地使用：一种或多种癌细胞、癌组织、恶性肿瘤细胞或恶性肿瘤组织，它们可以位于或者发现于人体的一个或多个解剖位置中。如本文所用，“结合”可与“识别”和/或“检测”互换使用，以传达具有等于或小于10
‑3m、10
‑4m、10
‑5m、10
‑6m或等于或小于10
‑7m的亲和力(k
d
)的两个分子之间的相互作用。如本文所用，“提供(provide或providing)”是指并且包括制造、产生、放置、使得能使用或准备使用的任何行为。
[0072]
嵌合蛋白(cd40/cd40l)
[0073]
如本文所用，“嵌合体”可与“嵌合蛋白”互换。本文披露的嵌合蛋白优选地包括tnf家族配体(优选地，配体的胞外部分)及其相应的tnf家族受体。这些嵌合体可以模拟或诱导细胞中的信号传导级联。示例性tnf家族配体和相应的受体包括cd40/cd40l、4
‑
1bb/4
‑
1bbl、和ox
‑
40/ox
‑
40l。由于这些蛋白质共享共同的结构基序和激活模式，本文提出的cd40/cd40l实施例和实例同样适用于4
‑
1bb/4
‑
1bbl和ox
‑
40/ox
‑
40l。
[0074]
具有tnf家族成员配体的胞外部分及其相应的tnf家族成员受体的嵌合蛋白可以自激活以引发信号转导。例如，具有cd40l的胞外结构域和cd40的嵌合蛋白可以是自激活的cd40信号传导蛋白，其能够自我折叠并将cd40介导的信号传输到apc中，如同该信号已经与另一表达cd40l的细胞(例如，cd4 t细胞)接触一样。cd40是n末端位于细胞外部的1型膜蛋白。cd40是主开关(例如，在树突细胞上)，而cd40l(例如，位于cd4 t细胞等上)是c末端位于细胞外部的2型膜蛋白。像tnf家族的许多其他成员一样，cd40需要三聚化来实现信号传导。三聚化是通过cd40与cd40l的三聚化结构域相互作用而发生的。通过经由接头将cd40偶联至其自身的cd40l(具有三聚化结构域)，可以利用这一激活要求来诱导信号传导。
[0075]
因此，在apc中表达的cd40/cd40l嵌合体必须三聚化并实现信号传导，而无需另一细胞(典型地是cd4 t细胞)来递送cd40l。最优选地，apc还将表达或暴露于选择的抗原，并因此在mhc系统上呈递抗原的一部分。这种apc即使在不存在cd4 t细胞的情况下也会增强免疫应答，这在破坏或减少cd4 t细胞的病原体(例如，hiv)的感染中是显著的。可以通过在mhc上共呈递嵌合蛋白与抗原的至少一部分，以定制的抗原特异性方式增强或下调免疫反应。对于针对特异性抗原的免疫刺激，可以三聚化嵌合体。相反，对于免疫下调，可以减少或抑制嵌合体三聚化。
[0076]
此类构建体与疫苗和其他免疫刺激组合物(尤其是癌症疫苗)特别相关，其中将三聚化概念转移到其他tnf家族成员如4
‑
1bb、ox40等，以通过基因表达激活细胞。因此，如上所述的系统和方法也适合除apc以外的用途(例如，用于nk细胞及衍生物(例如，nk
‑
92、ank、hank、tank等)、t细胞及衍生物(例如，car
‑
t、tcr
‑
t、til
‑
t等)、b细胞等)。
[0077]
例如，所有cd40变体均适合用于本文。然而，特别合适的cd40变体包括人和其他哺乳动物cd40。许多这样的序列是已知的(参见例如，uniprot序列数据库)，并且所有序列均适合用于本文。在某些非限制性实施例中，去除cd40信号肽，并用包含接头和cd40l部分的上游部分替代。为了激活嵌合构建体，cd40将典型地保留其胞内激活结构域。另一方面，在需要下调的情况下，cd40将具有缺少(功能性)激活结构域的胞内截短。
[0078]
最典型地，特定cd40将与apc物种匹配(例如，人cd40用于人apc)。可以进行许多修饰以实现所需目的。例如，胞内激活结构域可以以多个拷贝存在，或者部分缺失或完全缺失。在其他实例中，可以添加一个或多个氨基酸作为用于经由免疫组织化学鉴定的标签。在
仍另外的实例中，可以交换一个或多个氨基酸(尤其是在n
‑
末端)以增加半衰期。在较不优选的方面中，cd40跨膜结构域可以用另一个跨膜结构域替代。
[0079]
cd40l序列可以有相当大的变化。所有cd40l变体均适合用于本文。然而并且如上所述，人和其他哺乳动物cd40l是特别合适的。许多这样的序列是已知的(参见例如，uniprot序列数据库)，并且所有这些序列均适合用于本文。在某些非限制性实施例中，cd40l将包含其天然信号肽，然而也可以包含或取代其他信号肽。cd40l应保留其三聚化结构域以激活嵌合构建体。另一方面，在需要下调的情况下，cd40l可以具有截短的三聚化结构域或一些其他足够空间位阻以破坏三聚化。
[0080]
最典型地，将选择cd40l以匹配apc物种(例如，人cd40用于人apc等)。可以进行许多修饰以实现所需目的。例如，可以优化三聚化结构域以增加亲和力，或者部分或完全缺失。在仍另外的实例中，可以交换一个或多个氨基酸(尤其是在n
‑
末端)以增加半衰期。
[0081]
合适的接头通常使cd40和cd40l部分之间具有足够的移动性，从而允许所有选择性结合。尤其是为了激活嵌合分子，接头将是具有4和60个之间的氨基酸，具有低免疫原性或无免疫原性的多肽。合适的接头包括具有8和50个之间或4和25个之间、并且最优选地15和17个之间的氨基酸的gs型接头。已知存在许多替代性接头(参见例如，adv drug deliv rev.[先进药物递送综述]2013 65(10):1357
‑
69)，并且所有这些接头均适合用于本文。
[0082]
表达盒
[0083]
编码上述嵌合蛋白的重组表达盒可包括编码单个阅读框中的cd40l部分(cd40l的胞外结构域以及任选地与cd40l的胞外结构域的n
‑
末端偶联的前导肽)、接头、和cd40部分的第一核酸区段，使得可以在单一多肽中编码cd40l部分、接头、和cd40部分。示例性嵌合构建体示于seq id no:1
‑
10中。在前导肽要与cd40l的胞外结构域偶联的情况下，可以将编码前导肽的核酸区段与编码cd40l胞外结构域的区段置于相同阅读框中(在它们之间具有或不具有接头)。融合蛋白可包括插入序列(例如，2a序列)或可以是直接融合。表达盒包括启动子(组成型或诱导型)以驱动编码嵌合蛋白的序列的表达。由于嵌合蛋白具有跨膜部分，嵌合体典型地将具有信号序列(任选地可切割)以将嵌合体引导至细胞表面。
[0084]
肿瘤相关抗原
[0085]
如本文所述的重组表达盒通常还包括编码taa(例如muc1、cea、短尾突变蛋白、ras(例如，突变的ras(例如，具有g12v、q61r和/或q61l突变的ras等))、肿瘤特异性抗原(例如psa、psma、her2)、或者肿瘤
‑
和患者特异性新抗原或新表位的第二核酸区段，这些可以从患者的组学数据中鉴定出。如本文所用，“新表位”表示在肿瘤细胞中表达的、构成独特的肿瘤特异性抗原的随机突变。可以通过考虑突变的类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位等)和突变的影响(例如，无义、错义、移码等)来鉴定新表位，这些新表位可以这样充当内容过滤器，通过该内容过滤器可以消除沉默突变和其他不相关的(例如，未表达的)突变。新表位序列可以被定义为具有相对较短长度(例如，8
‑
12mer或14
‑
20mer)的序列延伸物，其中此类延伸物包括氨基酸序列中的一个或多个改变。最典型地，但非必需地，发生改变的氨基酸将在中心氨基酸位置处或附近。例如，典型的新表位可以具有a4‑
n
‑
a4、或a3‑
n
‑
a5、或a2‑
n
‑
a7、或a5‑
n
‑
a3、或a7‑
n
‑
a2的结构，其中a是蛋白原野生型或常态的(即，来自相同患者的相应健康组织)氨基酸，并且n是发生改变的氨基酸(相对于野生型或相对于匹配的常态)。因此，新表位序列包括具有相对较短长度(例如，5
‑
30mer，更典型地8
‑
12mer或14
‑
20mer)的序列延
伸物，其中此类延伸物包括氨基酸序列中的一个或多个改变。当需要时，可以将另外的氨基酸置于发生改变的氨基酸的上游或下游，例如，以允许在各种细胞区室(例如，蛋白酶体、内体、溶酶体)中进行另外的抗原加工。
[0086]
在一些实施例中，重组表达盒可包括在单独的启动子下或在不同的阅读框中编码一个或多个taa的序列，使得这些taa被表达为单独的分子。在其他实施例中，重组表达盒可包括编码taa作为多表位的一个或多个序列。如本文所用，“多表位”表示表达为单一多肽的两种或更多种抗原的串联阵列。优选地，两种或更多种人疾病相关抗原由接头或间隔子肽分开。可以使用接头或间隔子的肽序列的任何合适的长度和顺序。然而，接头的长度优选地是3和30个之间的氨基酸、优选地是5和20个之间的氨基酸、并且更优选地是5和15个之间的氨基酸。富含甘氨酸的序列(例如，gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly等)是优选的，以提供两种抗原之间的多表位的柔性。第二核酸区段可进一步包括运输信号，以将肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、新表位、和/或多表位引导至mhc
‑
i和/或mhc
‑
ii复合物中的至少一种，更优选地至少引导至mhc
‑
ii复合物。
[0087]
在一些实施例中，第一和第二核酸区段位于相同阅读框中、优选地在相同启动子的下游，使得嵌合蛋白和肿瘤相关抗原可以同时表达。在其他实施例中，内部核糖体进入位点(ires)序列将第一和第二核酸区段分开，使得该第一和第二核酸区段的翻译同时开始。可替代地，序列也可以包括插入序列部分(例如，2a序列)。
[0088]
由重组表达盒编码的另外的分子
[0089]
另外，重组表达盒可进一步包含编码一种或多种共刺激分子和/或细胞因子的第三核酸区段，以调节肿瘤微环境中的免疫应答。合适的共刺激分子包括b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、cd30l、cd40、cd40l、cd48、cd70、cd112、cd155、icos
‑
l、4
‑
1bb、gitr
‑
l、light、tim3、tim4、icam
‑
1、lfa3(cd58)和slam家族成员。合适的细胞因子包括用于增加免疫应答的免疫刺激细胞因子(例如，il
‑
2、il
‑
15、il
‑
17、il
‑
21等)或减弱免疫应答的下调细胞因子(例如，il
‑
10、tgf
‑
β等)。可替代地或另外地，核酸还可以包括编码smac(例如，cd2、cd4、cd8、cd28、lck、fyn、lfa
‑
1、cd43和/或cd45或其各个结合对应部分)的至少一种组分的序列。在某些实施例中，核酸可另外包含编码sting途径激活物(例如，ebv的lmp1的跨膜结构域与ips
‑
1的信号传导结构域融合的嵌合蛋白)的序列。
[0090]
在一个优选的实施例中，细胞因子是与il
‑
7、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21和il
‑
22中的至少一种，或优选地il
‑
7和il
‑
21两者偶联的il
‑
15超激动剂(il
‑
15n72d)和/或il
‑
15超激动剂/il
‑
15rαsushi
‑
fc融合复合物(例如，alt
‑
803)。预期il
‑
15超激动剂的任何合适的变异。il
‑
15超激动剂的示例性和优选的实施例示于图10a
‑
10f中。
[0091]
表达载体
[0092]
最典型地，将重组表达盒置于表达载体中，使得编码肽的核酸区段可以通过细胞分裂而持续存在。例如，重组表达盒是dna/rna片段，并且合适的dna/rna构建体可以是构造为表达载体的线性或环状构建体。因此，在一个实施例中，优选的表达载体包括病毒载体(例如，非复制性重组腺病毒基因组，该基因组任选地具有缺失或无功能的e1和/或e2b基因等)。然后可以将这样产生的重组病毒单独地或组合用作治疗疫苗。将此类疫苗典型地配制为药物组合物，例如无菌可注射组合物，其中病毒滴度为每剂量单位106和10
13
个病毒颗粒之间、并且更典型地109和10
12
个病毒颗粒之间。
[0093]
在仍另外的实施例中，表达载体可以是可以在经基因工程化的细菌中表达的细菌载体，在引入人体时，该经基因工程化的细菌表达的内毒素的水平足够低而不会在人细胞中引起内毒素应答和/或不足以诱导cd
‑
14介导的脓毒症。合适的细菌包括bl21(de3)电感受态细胞。此菌株是具有以下基因型的bl21：f
‑
ompt hsdsb(rb
‑
mb
‑
)gal dcm lonλ(de3[laci lacuv5
‑
t7基因1ind1 sam7 nin5])msba148δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδepta。几个特定的缺失突变(δgutqδkdsdδlpxlδlpxmδpagpδlpxpδepta)编码lps对脂质iv
a
的修饰，而一个另外的补偿突变(msba148)使得细胞能够在iva的存在下维持活力。这些突变使得寡糖链从lps缺失，更具体地，六条酰基链中有两条发生缺失。尽管提供电感受态bl21细菌作为实例，但是经基因修饰的细菌也可以是化学感受态细菌。
[0094]
可替代地或另外地，表达载体可以是可以在酵母中表达的酵母载体。优选的酵母包括酿酒酵母(例如，gi
‑
400系列重组免疫治疗酵母菌株等)。
[0095]
本文描述的重组核酸不必限于病毒、酵母或细菌表达载体。合适的载体还包括dna疫苗载体、线性化dna、和mrna，所有这些均可以按照本领域熟知的方案转染到合适的细胞中。
[0096]
病毒疫苗配制品和施用
[0097]
重组核酸(或重组表达盒)和/或携带重组核酸的重组病毒可以用于在体内或离体诱导或产生抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。所产生的嵌合蛋白和taa可增强针对表达taa的细胞的抗肿瘤免疫应答。可以在体内向患者apc施用包含编码嵌合蛋白和/或一个或多个肿瘤相关抗原、细胞因子、和/或共刺激分子的一个或多个核酸区段的一种或多种重组病毒。此类感染的apc表达一个或多个taa、细胞因子、和/或共刺激分子以刺激针对肿瘤细胞的免疫应答。
[0098]
例如，可以将携带编码嵌合蛋白和/或一个或多个taa的重组核酸的经基因修饰的病毒配制在任何药学上可接受的运载体中(例如，优选地配制为无菌可注射组合物等)以形成药物组合物。可以按任何合适的方法施用无菌组合物。在一些实施例中，当要在相同细胞中表达细胞因子(例如，alt
‑
805)时，重组核酸进一步包含编码细胞因子的核酸。另外地或可替代地，可以共施用包含编码细胞因子的重组核酸的另一种重组病毒(或细菌或酵母)。当希望两种或更多种类型的重组病毒感染相同抗原呈递细胞时，两种或更多种类型的重组病毒可以配制成单一药物组合物。然而，还可以将两种或更多种类型的重组病毒配制成两种单独且不同的药物组合物，并且同时或基本上同时(例如，在一小时内、在2小时内等)施用于患者。
[0099]
在药物组合物包括重组病毒的情况下，滴度应为每剂量单位104和10
12
个病毒颗粒之间。然而，替代性配制品也适合用于本文，以及所有已知的施用途径和模式。在药物组合物包括重组细菌的情况下，滴度应为每剂量单位102和103个细菌之间、103和104个细菌之间、或104和105个细菌之间。在药物组合物包括重组酵母的情况下，滴度应为每剂量单位102和103个酵母之间、103和104个酵母之间、或104和105个酵母之间。
[0100]
如本文所用，“施用”病毒、细菌或酵母配制品是指直接和间接施用两者。配制品的直接施用典型地由健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行。间接施用包括向健康护理专业人员提供配制品或使健康护理专业人员可用配制品以用于直接施用(例如，经由注射、
输注、口服递送、局部递送等)的步骤。
[0101]
在一些实施例中，病毒、细菌或酵母配制品是全身注射的，包括皮下(subcutaneous)、皮下(subdermal)或静脉内注射。在其他实施例中，在全身注射可能无效的情况下(例如，对于脑肿瘤等)，可以将配制品注射到肿瘤中。
[0102]
施用的剂量和/或时间表可以取决于取决于以下而变化：病毒、细菌或酵母的类型，疾病的类型和预后(例如，肿瘤类型、尺寸、位置)，以及患者的健康状况(例如，包括年龄、性别等)。尽管剂量和时间表可以变化，但是可以对其进行选择和调节，使得配制品对正常宿主细胞几乎没有显著的毒性作用，但足以引发免疫应答。因此，在优选的实施例中，可以基于预定阈值确定最佳施用。例如，预定阈值可以是特定类型的细胞因子(例如，ifn
‑
γ、tnf
‑
β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
10等)的预定局部或全身浓度。典型地调节剂量、途径和时间表以使免疫应答特异性细胞因子的至少局部或全身表达为至少20％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、更多。
[0103]
例如，在药物组合物包括重组病毒的情况下，剂量为至少106个病毒颗粒/天、或至少108个病毒颗粒/天、或至少10
10
个病毒颗粒/天、或至少10
11
个病毒颗粒/天。在一些实施例中，可以将单一剂量的病毒配制品每天至少一次或每天两次(每次施用一半剂量)施用至少一天、至少3天、至少一周、至少2周、或至少一个月。在其他实施例中，病毒配制品的剂量可以在时间表期间逐渐增加，或在时间表期间逐渐减少。在仍其他实施例中，可以施用几个系列的配制品，每个系列的施用分隔一定的间隔时间(例如，每次一个系列施用连续3天，并且间隔7天再每次一个系列施用连续3天等)。
[0104]
在一些实施例中，配制品可以分两个或更多个阶段施用：例如，初次施用和加强施用。初次剂量可以高于随后的加强剂量(例如，高至少20％、优选地至少40％、更优选地至少60％等)。可替代地，初次剂量可以低于随后的加强剂量。另外，在存在多次加强的情况下，每次加强可以具有不同的剂量(例如，增加的剂量、减少的剂量等)。
[0105]
基于细胞的组合物和施用
[0106]
可以从血液中分离患者自身的apc，并用编码嵌合蛋白和/或taa的重组核酸进行转染。也可以用包含重组核酸的重组病毒、细菌或酵母感染分离的患者apc。在一些实施例中，mhc匹配的异源apc可以与患者自身的apc一起使用或代替患者apc使用。例如，可以分离患者树突细胞(同种异体树突细胞)，并用tnf
‑
α、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、或白介素(il)
‑
4进一步离体扩增。然后这些树突细胞(dc)可以进一步用重组核酸转染或用包含重组核酸的病毒疫苗感染。任选地，在转染和/或感染后，可以进一步离体扩增感染的和/或转染的dc，以增加要施用的dc群体。
[0107]
可以将转染的/感染的dc配制在任何药学上可接受的运载体中(例如，配制成无菌可注射组合物)，其中细胞滴度为每剂量单位至少103个细胞/ml、优选地至少105个细胞/ml、更优选地至少106个细胞/ml，并且至少1ml、优选地至少5ml、更优选地并且至少20ml。替代性配制品也适合用于本文，以及所有已知的施用途径和模式。
[0108]
要共施用的佐剂
[0109]
可以将具有编码嵌合蛋白和/或一个或多个taa的重组核酸的病毒、细菌或酵母与一种或多种佐剂和/或另外的分子共施以增强效果。例如，可以通过共施用或共暴露作为佐剂的非宿主细胞来大大提高病毒有效负载(重组核酸或盒)的表达和/或病毒感染效率。合
适的非宿主细胞可包括属于宿主细胞物种以外的物种的细胞(例如，对于患者而言是人)，或属于宿主物种但展现出一种或多种应激或危险信号的细胞(例如，暴露于化学治疗剂、辐射等以触发nkg2dl表达、应激标记、促凋亡标记等的细胞)。然而，最典型地，合适的非宿主细胞将是致病性或其他的细菌和/或酵母。
[0110]
例如，合适的细菌包括经修饰具有降低的lps表达的细菌，否则它们将触发免疫应答并引起内毒素应答。具有经修饰的脂多糖的一种示例性细菌菌株包括bl21(de3)电感受态细胞。尽管提供电感受态bl21细菌作为实例，但是合适的经基因修饰的细菌也可以是化学感受态细菌。
[0111]
可替代地，无活性或弱化的牛结核杆菌(例如，卡介苗芽孢杆菌)可以是佐剂。此外，患者自身的内共生细菌可以充当非宿主细胞。如本文所用，患者的“内共生细菌”是指存在于患者体内而不引起任何实质性的免疫应答的细菌。因此，患者的内共生细菌是患者的正常菌群。内共生细菌可包括通常可在人的肠或胃中发现的大肠杆菌或链球菌属。内共生细菌可以获得自来自肠、胃、口腔粘膜、结膜的患者活检样品，或获得自粪便样品。然后可以培养患者的内共生细菌，并用编码一种或多种人疾病相关抗原的核苷酸转染。细菌非宿主细胞还可以包括致病性细胞，包括百日咳杆菌和/或牛分枝杆菌。最典型地但非必须地，细菌非宿主细胞在暴露于宿主细胞之前将被杀灭。
[0112]
许多酵母菌株均适合用于本文。典型的非致病性酵母包括酿酒酵母、布拉迪酿酒酵母(s.boulardi)、巴斯德毕赤酵母(pichia pasteuris)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、星状假丝酵母(candida stellata)等。可以对此类酵母菌株进行进一步的基因修饰以减少一种或多种不良性状、和/或表达进一步增加病毒感染性和/或表达的重组蛋白。合适的酵母菌株通常是可商购的，并且可以经由已知的方案进行修饰。
[0113]
不受理论的束缚，一种或多种非宿主细胞组分可以充当危险或破坏信号，特别是在宿主细胞是免疫感受态细胞的情况下。因此，不仅可以使用非宿主细胞，而且也可以使用其一个或多个免疫刺激部分。合适的部分包括pamp受体配体、damp受体配体、tlr配体、cpg、ssdna、和毒胡萝卜素。
[0114]
非宿主细胞与宿主细胞的准确比率可根据宿主细胞的类型、非宿主细胞的类型(或其组分)、和病毒(或dna/rna)而有相当大的变化。然而，通常宿主细胞与非宿主细胞的比率是1:1至约1:100、或1:10至约1:1,000、或1:50至约1:5,000、或1:100至约1:10,000，在免疫感受态细胞是宿主细胞并且细菌细胞是非宿主细胞的情况下尤其如此。类似地，宿主细胞与非宿主细胞的合适比率包括100:1至约10:1、或1:1至约1:10、或1:50至约1:5,00、或1:100至约1:1,000，在宿主细胞是免疫感受态细胞并且非宿主细胞是酵母的情况下尤其如此。
[0115]
在非宿主细胞存在时，宿主细胞在重组病毒(或dna/rna)中的暴露可以是相当不同的。然而，通常暴露时间是在几分钟到几小时之间，或几小时到几天之间。例如，在体外进行暴露时，暴露时间可以是在10分钟到2小时之间、或在30分钟到4小时之间、或在60分钟到6小时之间、或在2小时到8小时之间、或在6小时到12小时之间、或在12小时到24小时之间、或在24小时到48小时之间、或甚至更长。另一方面，在体内(例如，经由疫苗配制品)进行暴露时，暴露时间可以是在60分钟到6小时之间、或在6小时到12小时之间、或在12小时到24小
时之间、或在24小时到48之间、或甚至更长。在这样的疫苗接种方案中，宿主细胞、非宿主细胞、和重组病毒(或dna或rna)可以是在相同配制品中共施用的。
[0116]
可以将具有编码嵌合蛋白和/或一个或多个taa的重组核酸的病毒、细菌或酵母配制品与一种或多种细胞因子和/或检查点抑制剂共施用。任何能够调节免疫应答(例如，增加或减少t细胞活性等)的细胞因子都将发挥作用。最优选地，细胞因子是与il
‑
7、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21和il
‑
22中的至少一种，或优选地il
‑
7和il
‑
21两者偶联的il
‑
15超激动剂(il
‑
15n72d)、和/或il
‑
15超激动剂/il
‑
15rαsushi
‑
fc融合复合物(例如，alt
‑
803)。示例性细胞因子示于图10a
‑
10f中。示例性检查点抑制剂包括针对ctla
‑
4(尤其是针对cd8

细胞)、pd
‑
1(尤其是针对cd4

细胞)、tim1受体、2b4和cd160的抗体或结合分子。伊匹单抗和纳武单抗是合适的检查点抑制剂。
[0117]
不希望受理论的束缚，将重组病毒和转染的/感染的apc共施用于患者将通过增加呈递taa的、预激活的apc(例如，dc)的数量并且通过使此类apc暴露于辅助t(th)细胞或其他免疫细胞，来激活针对在肿瘤微环境中表达taa的肿瘤细胞的t细胞。与此类apc相互作用的th细胞可以进一步激活信号传导级联，以产生更多的记忆t细胞并引发针对肿瘤细胞的免疫应答。
[0118]
实例
[0119]
使用cd40、cd40l、cd40/cd40l复合物的晶体结构来确定可以将cd40和cd40l拴系在一起，同时保持功能性的接头长度的范围。为此，对五个不同长度的接头进行建模并重组表达。测试了几种融合蛋白。
[0120]
图1描绘了携带融合蛋白的示例性16
‑
mer接头模型。左侧小图显示了嵌合蛋白单体的预测的侧视图。中间小图描绘了三聚体的预测的侧视图。右侧小图描绘了三聚体的预测的顶视图。正如所见，接头提供足够的空间移动性以允许cd40l与cd40结合并允许三聚化。
[0121]
为了确定这些构建体是否也会刺激免疫感受态细胞，用具有不同接头长度的构建体转染kg
‑
1细胞(骨髓细胞系)。这些细胞按约30％
‑
50％转染。使用biorad gene pulser ii以3个脉冲(200欧姆，25μf，0.26kv)经由电穿孔法转染kg
‑
1细胞，然后在生长培养基(iscove改良的杜氏培养基(iscove’s modified dulbecco’s medium)，其补充有20％胎牛血清)中培养16小时。洗涤经转染的细胞以去除可能由电穿孔过程产生的残留细胞因子，并且在96孔组织培养板中的新鲜培养基中以每孔20,000个细胞进行培养。将细胞再培养24小时，并收获上清液。使用对人il
‑
1β、mcp
‑
1和il
‑
8有特异性的流式微珠阵列法，根据制造商推荐的方案测定上清液中的细胞因子水平；但是，只有il
‑
8表现出任何变化。图2显示了用具有不同接头长度的cd40l
‑
接头
‑
cd40构建体瞬时转染的人细胞的il
‑
8。发现约16个氨基酸的接头长度是最有效的。
[0122]
小鼠cd40l/cd40融合蛋白：为了确定自我连接的cd40/cd40l融合构建体的概念是否可以扩展到其他物种，生产了一组平行的编码这些蛋白的小鼠型式的构建体，并在小鼠b16f10黑素瘤细胞系中测试其活性。使用lipofectamine 2000根据制造商推荐的方案，用小鼠cd40/cd40l融合蛋白构建体转染b16f10细胞。将细胞静置18小时，洗涤以去除残留细胞因子并且在96孔组织培养板中的新鲜生长培养基(补充有10％fbs的dmem)中以每孔50,000个细胞再培养24小时。孵育后，收获上清液并使用流式微珠阵列法根据制造商推荐的方
案，测定小鼠il
‑
1β、mcp
‑
1和kc的水平。图3显示了在此平行系统中获得类似结果，表明该系统可能可扩展到其他cd40序列和甚至其他tnf家族成员。一些构建体在经转染的细胞(kc和mcp
‑
1两者)中触发大量活性，表明14或16个氨基酸的接头长度是最有效的。18个氨基酸的接头没有引发应答。
[0123]
使用与上述基本相同的方案，用嵌合构建体转染树突细胞样(kg
‑
1)和293t衍生物(ec7)细胞来测定il
‑
8分泌。图4显示了在测试的所有变体中，两种细胞系均具有显著的il
‑
8分泌。为了进一步测试这些构建体是否可以跨物种边界操作，用人和小鼠构建体两者转染小鼠黑素瘤细胞(b16f10)，并且测定kc和mcp
‑
1的分泌。图5显示了kc和mcp
‑
1的分泌，即使在嵌合构建体不是来自相同物种的情况下。
[0124]
转染人(293t)和鼠(b16f10)细胞，并在24小时后用单克隆或多克隆抗体标记。图6和7显示了对于所有构建体，cd40/cd40l构建体均在两种细胞系的表面上表达。
[0125]
针对用cd40转染，随后用scd40l刺激的293t，测试嵌合构建体的功能性。结果示于图8中。值得注意的是，嵌合构建体比可溶性cd40配体诱导更多的il
‑
8分泌。最后，使用小鼠和人序列元件用于融合蛋白的cd40结构域，制备了嵌合构建体。因此，就胞内(ic)、跨膜
tm
或胞外(ec)结构域的起源而言，至少一些融合蛋白也是嵌合的。值得注意的是，图9显示，即使在使用鼠ic和tm区段的情况下，使用人ec的人细胞中的嵌合构建体引发显著更高的il
‑
8分泌。类似地，人ec在鼠细胞中也更优良。
[0126]
在优选的实施例中，cd40/cd40l蛋白构建体在所附序列表中说明。seq id.no:1是具有12mer接头的人cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:2是具有14mer接头的人cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:3是具有16mer接头的人cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:4是具有18mer接头的人cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:5是具有20mer接头的人cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:6是具有12mer接头的小鼠cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:7是具有14mer接头的小鼠cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:8是具有16mer接头的小鼠cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:9是具有18mer接头的小鼠cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。seq id.no:10是具有20mer接头的小鼠cd40/cd40l构建体的一个说明性实例。4
‑
1bbl/4
‑
1bb和ox40l/ox40的其他构建体可以以基本上如以上针对cd40l/cd40所述的方式基于公开获得的uniprot序列。
[0127]
在一些优选的实施例中，可以通过用具有第一和第二核酸区段的重组核酸感染肿瘤细胞来制备经基因工程化的激活的树突细胞；其中该第一核酸区段编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有通过柔性接头与cd40l偶联的cd40的胞外部分；并且其中该第二核酸区段编码肿瘤相关抗原。经基因工程化的激活的树突细胞可进一步包含重组核酸，该重组核酸编码抗体分泌部分以影响肿瘤微环境。抗体分泌部分可包含以下中的一种或多种：pd1、ctla4和tgfb阱以及il 8。
[0128]
在一些实施例中，经基因工程化的激活的dc可用于治疗肿瘤。该方法包括向患者施用包含如上讨论的经基因工程化的激活的dc的组合物。经基因工程化的激活的dc的施用可以如下进行：小范围(膀胱癌、脑癌)、或局部(皮肤肿瘤)、或介入性注射到组织中(肝癌、乳腺癌、胰腺癌)、或吸入(肺癌、或脑癌)、或鞘内。在一些实施例中，可以经由cd46进一步增强经工程化的细胞的肿瘤杀伤特性，以靶向car和cd46两者。此外，可以如以下文献披露使
用本文披露的方法和经工程化的细胞：do等人(2018)int.j.mol.sci.[国际分子科学杂志]19:2694和zhai等人(2102)gene ther.[基因疗法]19(11):1065
‑
74。
[0129]
可以通过使用与免疫原性肽(优选地是患者和肿瘤特异性新表位)共表达或共呈递的佐剂来改善基于新表位的免疫疗法。最典型地，经表达的患者
‑
和肿瘤特异性新表位靶向加工和/或特异性细胞表面呈递或甚至分泌。在需要时，仍可以使用检查点抑制，经由细胞因子的免疫刺激，和/或骨髓衍生的抑制细胞(mdcs)、t调节细胞(treg)、或m2巨噬细胞的抑制剂来进一步增强基于新表位的疗法。
[0130]
作为非限制性实例，这样的治疗实体将从重组核酸在体内表达，并且尤其合适的重组核酸包括质粒和病毒核酸。在使用病毒核酸的情况下，特别优选经由病毒感染患者细胞来递送核酸。
[0131]
本文提出的组合物和方法将在一种或多种新表位的表达和/或存在的情况下递送佐剂。的确，可以有利地定制此类治疗以实现一种或多种特异性免疫反应(包括cd4

偏向的免疫应答、cd8

偏向的免疫应答、抗体偏向的免疫应答和/或刺激的免疫应答(例如，减少检查点抑制和/或通过使用细胞因子激活免疫感受态细胞))，所有这些都可以得益于佐剂的存在。在不表达佐剂的情况下(例如，佐剂是atp或atp类似物)，优选将佐剂注射到肿瘤中，使得疫苗组合物和佐剂同时存在(例如，疫苗组合物和佐剂以可测量的量同时存在)。
[0132]
所有已知的佐剂均适合用于本文。合适的示例性佐剂包括各种无机化合物，例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物(calcium phosphate hydroxide)、矿物油、尤其是石蜡油。其他合适的佐剂包括小分子化合物，例如角鲨烯，以及各种细菌产物，例如杀灭的细菌百日咳杆菌、牛分枝杆菌类毒素等。佐剂也可以由一种或多种乳化的新抗原形成，以产生复合组合物，例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
[0133]
尤其合适的佐剂包括各种damp(损伤相关分子模式蛋白)。已知damp会触发炎症、先天性和适应性免疫应答、以及损伤后的组织愈合。特别优选的damp包括钙网蛋白或其具有佐剂活性的部分、和hmgb1或其具有佐剂活性的部分。仍另外的damp包括s100蛋白和各种细胞因子，并且尤其是il
‑
1、il
‑
2、和il
‑
12。
[0134]
hmgb1是一种损伤相关分子模式(damp)蛋白，其通常在细胞内部但在细胞死亡后释放，以允许危险抗原和无害抗原之间的免疫区分。经历严重应激的细胞分泌hmgb1。胞外hmgb1触发炎症和适应性免疫应答。还报道了hmgb1增强肿瘤中突变蛋白(新抗原或新表位)的免疫原性，从而促进抗肿瘤应答和免疫记忆(参见例如，immunol rev.[免疫学综述](2017)280(1):74
‑
82)。例如，据报道hmgb1诱导树突细胞成熟和t辅助1细胞应答。
[0135]
据报道，hmgb1的特定片段激活树突细胞(参见us 9,539,321)。包含safflfcse序列的肽在体外具有免疫刺激作用，并且此类序列可以附接至纳米粒或微粒上。hmgb1还促进抗原呈递细胞的成熟(us 2004/0242481)。如在us 2011/0236406中所述，将hmgb1的多个部分用于融合蛋白中以激活t细胞。
[0136]
癌症疗法可以在er中诱导应激应答，从而在细胞凋亡的形态学出现之前将钙网蛋白易位到质膜的外小叶。这种表面暴露的钙网蛋白充当免疫系统的强大动员信号。因此，在肿瘤的光动力疗法的背景下外部添加的钙网蛋白是一种免疫增强剂(front immunol[免疫学前沿](2015)5(15):1
‑
7)。
[0137]
hmgb1和钙网蛋白佐剂需要以更传统的方式配制疫苗化合物和佐剂的混合物，或
在钙网蛋白的抗原范围之外全身施用佐剂。然而，此类方法通常不适合癌症疗法，尤其是在癌症抗原是重组抗原的情况下。
[0138]
有利地，如本文所述，可以通过多肽或蛋白佐剂连同新表位的共表达，在新表位(或taa或肿瘤特异性抗原)的直接背景中施用多肽或蛋白佐剂。这样的共表达可以在活细胞中，尤其是在被诊断患有肿瘤的患者的apc中，或者在施用于该患者的酵母或细菌疫苗组合物中进行。
[0139]
例如，如在下文中更详细地描述的，可以构建重组核酸，其包括用于表达新表位的一个或多个表达盒(优选地以将新表位导向mhc
‑
i和/或mhc
‑
ii呈递的方式)，并且还包括编码一种或多种多肽或者蛋白佐剂的表达盒。多肽或蛋白佐剂可以表达为膜结合蛋白或可溶性分泌蛋白。重组核酸可进一步包括编码共刺激分子、免疫刺激细胞因子和干扰或下调检查点抑制的蛋白质中的至少一种的序列。合适的共刺激分子包括ox40l、4
‑
1bbl、cd80、cd86、cd30、cd40、cd30l、cd40l、icos
‑
l、、b7
‑
h3、b7
‑
h4、cd70、gitr
‑
l、tim
‑
3、tim
‑
4、cd48、cd58、tl1a、icam
‑
1和lfa3，并且合适的免疫刺激细胞因子包括il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
15超激动剂(alt803)、il
‑
21、ips1和lmp1。干扰检查点抑制的优选蛋白质包括ctla
‑
4、pd
‑
1、tim1受体、2b4或cd160的抗体或拮抗剂。
[0140]
另外地或可替代地，可以经由全身施用或肿瘤内施用将非蛋白应激信号作为免疫疗法的一部分递送至肿瘤。例如，非蛋白佐剂包括各种嘌呤代谢物，特别是atp和atp类似物(例如，不可水解的α,β
‑
亚甲基
‑
atp(αβ
‑
atp))。胞外atp充当一种危险信号使免疫系统警惕组织损伤，并且触发dc激活。
[0141]
癌症免疫疗法可以使用重组腺病毒。此类腺病毒可以携带癌症表位作为有效负载，以及至少一种多肽或蛋白佐剂，以及任选地如下讨论的另外的功能元件。癌症表位典型地是根据一种或多种标准(也如下所述)过滤的肿瘤和患者特异性新表位。
[0142]
新表位鉴定可以从多种生物材料(包括新鲜的活检物、冷冻的或以其他方式保存的组织或细胞样品、循环的肿瘤细胞、外来体、多种体液(尤其是血液)等)开始。合适的组学分析方法包括核酸测序，并且特别是在dna上操作的ngs方法(例如，illumina测序、离子激流测序(ion torrent sequencing)、454焦磷酸测序、纳米孔测序等)；rna测序(例如，rnaseq、基于逆转录的测序等)；并且在一些情况下是基于蛋白质测序或质谱的测序(例如，srm、mrm、crm等)。
[0143]
对于基于核酸的测序，肿瘤组织的高通量基因组测序允许快速鉴定新表位。然而，在将序列信息与标准参考序列比较时，正常发生的患者间变异(例如，由于snp、短的插入缺失(indel)、不同数目的重复等)以及杂合性将导致相对大量的潜在假阳性新表位(即，在相同患者的健康组织上也发现的新表位)。值得注意的是，在将患者的肿瘤样品与相同患者的匹配的常态(即，非肿瘤)样品进行比较的情况下，可以消除这种不准确性。
[0144]
可以通过肿瘤样品和匹配的常态样品两者的全基因组测序和/或外显子组测序(通常按覆盖深度为至少10x，更典型地至少20x)来进行dna分析。可替代地，还可以从来自相同患者的先前序列确定的已建立的序列记录(例如，sam、bam、fasta、fastq或vcf文件)提供dna数据。合适的数据集包括未处理的或已处理的数据集，并且示例性优选的数据集包括具有bam格式、sam格式、gar格式、fastq格式、或fasta格式的那些以及bambam、sambam和vcf数据集。然而，如在us 2012/0059670和us 2012/0066001中所述，bam格式或bambam diff对
象是尤其合适的。数据集反映了相同患者的肿瘤样品和匹配的常态样品。因此，可以排除不引起肿瘤的遗传种系改变(例如，沉默突变、snp等)。肿瘤样品可能来自初始肿瘤、来自治疗开始时的肿瘤、来自复发的肿瘤和/或转移部位等。在大多数情况下，患者的匹配的常态样品是血液或来自与肿瘤相同组织类型的未患病组织。
[0145]
同样，可以按许多方式分析序列数据。然而，在最优选的方法中，如在us 2012/0059670和us 2012/0066001中，使用bam文件和bam服务器通过肿瘤和常态样品的位置引导的同步比对来进行计算机模拟分析。这样的分析有利地减少假阳性新表位，并且显著地减少对存储器和计算资源的需求。
[0146]
应该读取针对“计算机”的任何语言，以包括任何合适的计算装置的组合，这些计算装置包括服务器、接口、系统、数据库、代理、端、引擎、控制器或单独或共同操作的其他类型的计算装置。计算装置包括处理器，该处理器被配置为执行存储在有形的非暂时性计算机可读存储介质(例如，硬盘驱动器、固态驱动器、ram、闪存、rom等)上的软件指令。软件指令优选地配置计算装置，以提供如下文关于所披露的设备所讨论的角色、职责或其他功能。此外，所披露的技术可以体现为计算机程序产品，其包括存储软件指令的非暂时性计算机可读介质，这些软件指令使处理器执行与基于计算机的算法、过程、方法或其他指令的实现相关联的所披露的步骤。在尤其优选的实施例中，多种服务器、系统、数据库或接口交换数据使用标准化协议或算法，可能地基于http、https、aes、公钥
‑
私钥交换、web服务api、已知的金融交易协议、或其他电子信息交换方法。装置之间的数据交换可以通过分组交换网络、互联网、lan、wan、vpn或其他类型的分组交换网络；电路交换网络；信元交换网络；或其他类型的网络来进行。
[0147]
可以建立患者
‑
和癌症特异性计算机模拟序列集合，这些序列集合编码具有预定长度为例如5和25个之间的氨基酸的新表位，并且包括至少一个发生改变的氨基酸。对于每个发生改变的氨基酸，这种集合将典型地包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个成员，其中发生改变的氨基酸的位置是不同的。这种集合有利地增加了适用于免疫疗法的潜在候选分子，并然后可以用于进一步过滤(例如，通过亚细胞定位、转录/表达水平、mhc
‑
i和/或ii亲和力等)，如在下文中更详细地描述的。
[0148]
例如，使用同步的位置引导分析肿瘤和匹配的常态序列数据，已经从多种癌症和患者中鉴定出各种癌症新表位，包括以下癌症类型：blca、brca、cesc、coad、dlbc、gbm、hnsc、kich、kirc、kirp、laml、lgg、lihc、luad、lusc、ov、prad、read、sarc、skcm、stad、thca和ucec。这些癌症的示例性新表位数据可在国际申请pct/us16/29244中找到，其通过引用并入本文。
[0149]
取决于癌症的类型和阶段，以及患者的免疫状况，并非所有已鉴定出的新表位都必然导致患者产生治疗上等效的反应。的确，仅一部分新表位将产生免疫应答。为了增加治疗上希望的应答的可能性，可以进一步过滤最初鉴定的新表位。出于本文提出的方法的目的，下游分析不需要考虑沉默突变。然而，优选的突变分析将除了提供突变的特定类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、易位)之外，还提供突变影响的信息(例如，无义、错义等)，并且可以这样充当第一内容过滤器，通过该过滤器消除沉默突变。例如，可以选择新表位用于进一步考虑，其中突变是移码、无义、和/或错义突变。
[0150]
在进一步的过滤方法中，新表位还可以针对亚细胞定位参数进行详细的分析。例
如，如果新表位被鉴定为具有膜相关位置(例如，位于细胞的细胞膜的外部)和/或如果计算机模拟结构计算确认了新表位可能暴露于溶剂，或呈现出结构稳定的表位(例如，j exp med[实验医学杂志]2014)等，则可以选择新表位序列用于进一步考虑。
[0151]
新表位尤其适合于在组学或其他分析揭示出新表位实际表达的情况下使用。可以按本领域已知的所有方式对新表位的表达和表达水平进行鉴定。优选的方法包括定量rna(hnrna或mrna)分析和/或定量蛋白质组学分析。最典型地，包含新表位的阈值水平将是以下表达水平，该表达水平是相应匹配的常态序列的表达水平的至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％，因此确保(新)表位对于免疫系统是至少潜在
‘
可见的’。因此，通常优选的是，组学分析还包括对基因表达的分析(转录组学分析)，从而帮助鉴定具有突变的基因的表达水平。
[0152]
本领域已知许多转录组学分析方法，并且所有已知方法均适合用于本文。例如，mrna和初级转录物(hnrna)以及rna序列信息可以从逆转录的多聚腺苷酸

‑
rna(polya

‑
rna)获得，该逆转录的多聚腺苷酸

‑
rna进而从相同患者的肿瘤样品和匹配的常态(健康的)样品中获得。同样，尽管多聚腺苷酸

‑
rna作为转录组的代表典型地是优选的，但是其他形式的rna(hn
‑
rna、非多聚腺苷酸化rna、sirna、mirna等)也是合适的。优选的方法包括定量rna(hnrna或mrna)分析和/或定量蛋白质组学分析，尤其包括rnaseq。在其他方面，使用基于rnaseq、qpcr和/或rtpcr的方法进行rna定量和测序，尽管多种可替代的方法(例如，基于固相杂交的方法)也是合适的。转录组学分析(单独地或与基因组分析组合)可能适合于鉴定和定量具有癌症
‑
和患者特异性突变的基因。
[0153]
类似地，可以按许多方式进行蛋白质组学分析以确定新表位的rna的实际翻译，并且所有已知蛋白质组学分析均是合适的。优选的蛋白质组学方法包括基于抗体的方法和质谱方法。蛋白质组学分析不仅可以提供有关蛋白质本身的定性或定量信息，而且也可以包括蛋白质具有催化活性或其他功能活性的蛋白质活性数据。参见例如us 7,473,532，将其通过引用并入本文。鉴定并甚至定量蛋白质表达的其他合适的方法包括多种质谱分析(例如，选择性反应监测(srm)、多反应监测(mrm)和连续性反应监测(crm))。上述方法将提供患者和肿瘤特异性新表位，这些新表位可以通过包含新表位的蛋白质的亚细胞位置(例如，膜位置)、表达强度(例如，如与相同患者的匹配的常态对照相比，是过表达的)等被进一步过滤。
[0154]
可以将新表位与包含已知人序列(例如，患者或患者集合的序列)的数据库进行比较，以此避免使用与人相同的序列。而且，过滤还可以包括去除由于患者中的snp而导致的新表位序列，其中这些snp同时存在于肿瘤和匹配的常态序列中。例如，dbsnp(单核苷酸多态性数据库)是由美国国家生物技术信息中心(ncbi)与美国国家人类基因组研究所(nhgri)合作开发和托管的关于不同物种内和不同物种之间的遗传变异的免费公共档案。尽管数据库的名称仅暗示了一类多态性(单核苷酸多态性(snp))的集合，但实际上它包含相对广泛的分子变异：(1)snp；(2)短缺失和插入多态性(插入缺失/dip)；(3)微卫星标记或短串联重复序列(str)；(4)多核苷酸多态性(mnp)；(5)杂合的序列；和(6)命名的变体。dbsnp接受明显中性的多态性，对应于已知表型的多态性和无变异的区域。使用如上所述的这样的数据库和其他过滤选项，可以过滤患者和肿瘤特异性新表位以去除那些已知序列，产生具有多个新表位序列的序列集，该多个新表位序列具有显著减少的假阳性。
[0155]
一旦新表位被充分过滤(例如，通过肿瘤相对于常态对照、和/或表达水平、和/或亚细胞位置、和/或患者特异性hla匹配、和/或已知的变体)，进一步的过滤步骤可以考虑受新表位影响的基因类型。例如，合适的基因类型包括癌症驱动基因、与细胞分裂的调控相关的基因、与细胞凋亡相关的基因、以及与信号转导相关的基因。然而，在尤其优选的方面，癌症驱动基因是特别优选的(其可以通过功能化多种基因类型而持续，这些基因类型包括受体基因、信号转导基因、转录调节基因等)。合适的基因类型还可以是已知的乘客基因(passenger gene)和参与代谢的基因。
[0156]
多种方法和预测算法在本领域中是已知的以确定基因是否是癌症驱动基因。例如，合适的算法包括mutsigcv(nature[自然]2014,505(7484):495
‑
501)、activedriver(mol syst biol[分子系统生物学]2013,9:637)、music(genome res[基因组研究]2012,22(8):1589
‑
1598)、oncodriveclust(bioinformatics[生物信息学]2013,29(18):2238
‑
2244)、oncodrivefm(nucleic acids res[核酸研究]2012,40(21):e169)、oncodrivefml(genome biol[基因组生物学]2016,17(1):128)、肿瘤抑制物和癌基因(tuson)(cell[细胞]2013,155(4):948
‑
962)、20/20 (https://github.com/karchinlab/2020plus)和oncodriverole(bioinformatics[生物信息学](2014)30(17):i549
‑
i555)。可替代地或另外地，癌症驱动基因的鉴定也可以采用多种来源来获得已知的癌症驱动基因及其与具体癌症的关联性。例如，驱动突变的intogen目录(2016.5；url:www.intogen.org)包含由癌症基因组解释程序(cancer genome interpreter)对28种肿瘤类型的泛癌群组中的6,792个外显子进行的驱动分析的结果。
[0157]
然而，尽管进行了过滤，但并不是所有新表位都对免疫系统可见，因为这些新表位在更大的背景中(例如，在多表位内)存在以及在患者的mhc复合物上被呈递的情况下也需要进行加工。所有新表位中仅一部分将具有足够用于呈递的亲和力。因此，在新表位被mhc复合物适当加工、结合并由其呈递的情况下，这些新表位将更有可能是有效的。治疗成功将随着可以经由mhc复合物呈递的新表位数量的增加而增加，其中此类新表位对患者的hla类型具有最小的亲和力。有效的结合和呈递是新表位的序列与患者的特定hla类型的组合功能。因此，通常需要对患者组织进行hla类型确定。最典型地，hla类型确定包括至少三种mhc
‑
i亚型(例如，hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c)和至少三种mhc
‑
ii亚型(例如，hla
‑
dp、hla
‑
dq、hla
‑
dr)，优选地其中每种亚型被确定为至少2位、至少4位、至少6位、或至少8位深度。
[0158]
一旦确定了患者的hla类型，就可以根据数据库计算和/或获取hla类型的结构解决方案，然后将其用于计算机中的对接模型以确定(典型地是过滤的)新表位与hla结构解决方案的结合亲和力。用于确定结合亲和力的合适的系统包括netmhc平台(参见例如，nucleic acids res.[核酸研究]2008年7月1日；36(web server issue):w509
‑
w512.)。然后选择对先前确定的hla类型具有高亲和力(例如，小于100nm、小于75nm、小于50nm)的新表位，连同患者的mhc
‑
i/ii亚型的知识用于进行治疗。
[0159]
可以使用本领域已知的湿化学中的多种方法来进行hla确定。所有这些方法均适合用于本文。可以使用包含大多数或所有已知和/或常见的hla类型的参考序列，从计算机组学数据预测hla类型。例如，数据库可以提供映射至染色体6p21.3(或hla等位基因附近的任何其他位置)的相对大量的患者序列读段。最典型地，序列读段将具有约100
‑
300个碱基，并且包含元数据，包括读段质量、比对信息、取向、位置等。例如，合适的格式包括sam、bam、
fasta、gar等。作为非限制性实例，患者序列读段可以提供至少5x、更典型地至少10x、甚至更典型地至少20x，并且最典型地至少30x的覆盖深度。
[0160]
除了患者序列读段之外，本发明的方法进一步采用一个或多个参考序列，这些参考序列包括多个已知不同的hla等位基因的序列。例如，典型的参考序列可以是合成的(没有相应的人或其他哺乳动物对应物)序列，该序列包括至少一种hla类型的序列区段，该hla类型具有该hla类型的多个hla等位基因。合适的参考序列包括但不限于hla
‑
a的至少50个不同等位基因的已知基因组序列的集合。可替代地或另外地，参考序列还可以包括hla
‑
a的至少50个不同等位基因的已知rna序列的集合。参考序列不限于hla
‑
a的50个等位基因，但是关于hla类型和等位基因的数目/组成可以具有可替代的组成。最典型地，参考序列将是计算机可读格式，并且将从数据库或其他数据存储设备提供。例如，合适的参考序列格式包括fasta、fastq、embl、gcg或genbank格式，并且可以直接从公共数据存储库(例如imgt，国际免疫遗传学(international immunogenetics)信息系统，或等位基因频率网络数据库(the allele frequency net database)，eurostam)的数据中获取或构建。可替代地，参考序列还可以基于一个或多个预定标准(例如等位基因频率、种族等位基因分布、常见或稀有等位基因类型等)从各个已知的hla等位基因构建。
[0161]
使用参考序列，可以将患者序列读段穿过迪布鲁英(de bruijn)图，以鉴定具有最佳匹配的等位基因。每个个体携带针对每种hla类型的两个等位基因，并且这些等位基因可能非常类似，或在一些情况下甚至是相同的。如此高的相似度给传统的比对方案带来了重大问题。可以使用以下方法来解析hla等位基因，并且甚至是非常密切相关的等位基因，在该方法中通过将序列读段分解成相对小的k
‑
mer(典型地具有10
‑
20个碱基之间的长度)，并且通过实施加权投票过程(其中每个患者序列读段基于与等位基因的序列匹配的序列读段的k
‑
mer，针对每个等位基因提供投票(“定量读取支持”))来构建迪布鲁英图。然后，等位基因的累积最高投票指示最可能预测的hla等位基因。另外，通常优选与等位基因匹配的每个片段也用于计算该等位基因的总覆盖率和覆盖深度。
[0162]
得分可以根据需要被进一步改进或完善，尤其是在许多最高命中(top hit)相似的情况下(例如，其得分的很大一部分来自高度共享的k
‑
mer集)。例如，分数细化可以包括加权方案，其中从将来的考虑中去除与当前的最高命中基本相似(例如，>99％，或其他预定值)的等位基因。然后，将当前最高命中所使用的k
‑
mer的计数重新加权一个因子(例如，0.5)，并通过将这些加权计数相加来重新计算每个hla等位基因的得分。重复此选择过程以找到新的最高命中。使用rna序列数据可甚至进一步改进该方法的准确性，该rna序列数据允许鉴定由肿瘤表达的等位基因，这些等位基因有时可能只是dna中存在的2个等位基因中的1个。可以处理dna或rna、或dna和rna两者的组合以做出高度准确的hla预测，并且可以源自肿瘤或血液dna或rna。在另外的方面中，用于高准确性计算机模拟的hla分型的合适方法和考虑描述于wo 2017/035392(通过引用并入本文)中。
[0163]
一旦确定了患者和肿瘤特异性新表位以及hla类型，就可以通过在计算机将新表位与hla进行对接并确定最佳结合物(例如，最低kd(例如，小于500nm或小于250nm，或小于150nm，或小于50nm)进行进一步的计算分析，例如，使用netmhc。这种方法不仅将鉴定对患者和肿瘤真实的特异性新表位，而且还将鉴定最可能在细胞上呈递并因此最有可能引发具有治疗效果的免疫应答的那些新表位。如下文进一步讨论的，这些hla匹配的新表位可以在
体外进行生物化学验证，然后将编码表位的核酸作为有效负载包含到病毒中。
[0164]
在鉴定出所需的新表位后，可以使用新表位的序列信息制备一种或多种免疫治疗剂。在其他药剂中，可以用病毒治疗患者，如下文进一步讨论的那样，该病毒用核酸构建体进行基因修饰，其导致至少一种已鉴定的新表位的表达从而引发针对肿瘤的免疫应答。例如，合适的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，腺病毒是特别优选的。此外，进一步优选的是，病毒是复制缺陷的非免疫原性病毒，其典型地通过靶向缺失选择的病毒蛋白(例如，e1、e3蛋白)来实现。此类希望的特性可通过缺失e2b腺病毒基因功能来进一步加强。使用经基因修饰的人293细胞可以实现高滴度的重组病毒(参见例如，j virol.[病毒学杂志](1998)72(2):926
‑
33)。
[0165]
可以使用病毒来离体或在体内感染患者(或非患者)细胞。例如，可以皮下或静脉内注射病毒，或者可以经鼻内或经由吸入施用以此感染患者细胞(尤其是apc)。可替代地，可以体外感染免疫感受态细胞(例如，nk细胞、t细胞、巨噬细胞、dc等)，并然后输注给患者。可替代地，免疫疗法无需依赖病毒，但可以受到使用rna或dna、或导致新表位(例如，作为单一肽、串联小基因等)在所希望的细胞(尤其是免疫感受态细胞)中表达的其他重组载体，用核酸转染或疫苗接种的影响。
[0166]
最典型地，核酸序列(用于从病毒感染的细胞中表达)在本领域熟知的适当的调节元件的控制下。例如，合适的启动子元件包括组成型强启动子(例如，sv40、cmv、ubc、ef1a、pgk、cagg启动子)，但是诱导型启动子也适合用于本文，特别是在对于肿瘤微环境典型的诱导条件下。例如，诱导型启动子包括对低氧敏感的那些启动子和对tgf
‑
β或il
‑
8敏感的启动子(例如，经由traf、jnk、erk或其他应答元件启动子)。在其他实例中，合适的诱导型启动子包括四环素诱导型启动子、黏病毒耐药蛋白1(mx1)启动子等。
[0167]
新表位排列的方式和合理设计的新表位运输可以影响免疫治疗组合物的功效。例如，单个新表位可以从作为单个质粒、病毒表达构建体等递送的重组构建体中单独表达。可替代地，多个新表位可以与单独的启动子分开表达以形成单独的mrna，然后将其单独翻译成各自的新表位。也可以使用包含每个新表位序列的单独翻译起始点的单个mrna(例如，使用2a或ires信号)。
[0168]
在从单个转录物表达多个新表位以形成单个转录物，然后将该单个转录物翻译成单个多表位的情况下，表达、加工和抗原呈递被认为是有效的。多表位的表达需要通过细胞内适当的蛋白酶(例如，蛋白酶体、内体蛋白酶、溶酶体蛋白酶)进行加工以产生新表位序列，并且与单独新表位(特别是其中具有相对较短长度(例如，小于25个氨基酸；结果未显示)的单独新表位)的表达相比，多表位导致大多数新表位的抗原加工和呈递得到改善。而且，这种方法还允许合理设计在新表位肽序列之间的蛋白酶敏感序列基序，以确保或避免被特异性蛋白酶加工(因为蛋白酶体、内体蛋白酶和溶酶体蛋白酶具有不同的切割偏好)。因此，可以设计多表位，这些多表位不仅包括在空间上分开的新表位的接头序列，而且还包括将优先被特异性蛋白酶切割的序列部分(例如，3
‑
15个氨基酸)。
[0169]
可以使用包含核酸区段的重组核酸和表达载体(例如，病毒表达载体)，该核酸区段编码多表位，该多表位与所希望的启动子元件可操作地偶联，并且其中单独新表位任选地被接头和/或蛋白酶切割或识别序列分开。例如，图11说明了新表位的多种预期的排列，用于从腺病毒表达系统(在此：adv5，具有e1和e2b基因缺失)中表达。在此，构建体1说明了
示例性新表位排列，该新表位排列包含多个新表位(
‘
小基因’)，在串联体序列中具有的总长度为15个氨基酸，而没有插入的接头序列，而构建体2显示了构建体1的排列，但包含了在每个新表位序列之间的九个氨基酸接头。当然，并且如上所述，新表位的确切长度不限于15个氨基酸，而是可以有相当大的变化。但是，在大多数情况下，在8
‑
12个氨基酸之间的新表位(例如，对于mhc
‑
i呈递)旁有另外的氨基酸时，总长度将通常不超过25个氨基酸、或30个氨基酸或50个氨基酸。尽管图11指示g
‑
s接头，但多种其他接头序列也适合用于本文。当旨在经由mhc
‑
i呈递新表位时，这种相对短的新表位是尤其有益的。
[0170]
合适的接头序列将提供空间柔性并分离两个相邻的新表位。然而，不允许为接头选择可能具有免疫原性或可形成患者体内已经存在的表位的氨基酸。针对可以在患者中发现的表位的存在(例如，作为常态序列的一部分或由于snp或其他序列变异)，可以再次过滤多表位构建体。这样的过滤将应用如上文已经讨论的相同的技术和标准。
[0171]
构建体3说明了示例性新表位排列，该新表位排列包含在串联体序列中没有插入的接头序列的多个新表位，并且构建体4显示了构建体3的排列，其中包含了在每个新表位序列之间的九个氨基酸接头。如上所述，新表位的确切长度不限于25个氨基酸，而是可以有相当大的变化。但是，在大多数情况下，在14
‑
20个氨基酸之间的新表位序列(例如，对于mhc
‑
ii呈递)旁有另外的氨基酸时，总长度将通常不超过30个氨基酸、或45个氨基酸或60个氨基酸。尽管图11指示g
‑
s接头，但多种其他接头序列也适合用于本文。当旨在经由mhc
‑
i呈递新表位时，这种相对短的新表位是尤其有益的。
[0172]
在此实例中，15个氨基酸(15
‑
aa)的小基因是在任一侧用天然序列的7个氨基酸选择的mhc i类靶向的肿瘤突变，而25个氨基酸的小基因是在任一侧用天然序列的12个氨基酸选择的mhc ii类靶向的肿瘤突变。示例性的9个氨基酸接头具有足够的长度，从而避免在相邻的小基因之间形成“非天然的”mhc i类表位。多表位序列比单个新表位更有效地加工和呈递(数据未显示)。对于mhc
‑
i呈递添加超过12个氨基酸的氨基酸，并且对于mhc
‑
i呈递添加超过20个氨基酸的氨基酸改善了蛋白酶加工。
[0173]
为了使定制的蛋白质序列的细胞内保留最大化以便加工和hla呈递，可以排列新表位序列以最小化疏水序列，这些疏水序列可以指导向细胞膜或胞外空间的运输。最优选地，通过将序列与权重矩阵进行比较(参见例如，nucleic acids res.[核酸研究](1986)14(11):4683
‑
90)，或通过使用在包含信号序列的肽上训练的神经网络(参见例如，j.mol.biol[分子生物学杂志](2004)338(5):1027
‑
36)来进行疏水序列或信号肽的检测。图12描绘了示例性排列，其中分析了多个多表位。在此，计算所有新表位位置置换以产生排列的集合。然后，通过权重矩阵和/或神经网络预测对该集合进行加工，以生成代表疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度的得分。然后将所有的位置置换按得分排序，将分数低于预定阈值或最低分数(针对疏水序列或信号肽的存在可能性和/或强度)的一个或多个置换用于构建定制的新表位表达盒。
[0174]
通常优选多表位包含至少两个、或至少三个、或至少五个、或至少八个、或至少十个新表位序列。实际上，重组dna的有效负载能力以及经过滤的和适当的新表位的可用性通常被认为是限制因素。因此，腺病毒表达载体，并且特别地adv5是尤其优选的，因为此类载体在重组有效负载中可以容纳高达14kb。
[0175]
新表位/多表位可以被导向特定的亚细胞区室(例如，胞质溶胶、内体、溶酶体)，并
因此被导向特定的mhc呈递类型。这样的定向表达、加工和呈递是特别有利的，因为可以制备将免疫应答导向cd8

型应答(其中多表位被导向细胞质空间)或导向cd4

型应答(其中多表位被导向内体/溶酶体区室)的组合物。通常经由mhc
‑
i途径呈递的多表位可以经由mhc
‑
ii途径呈递(并因此模拟新表位的交叉呈递)。可以使用合适的序列元件设计新表位和多表位序列并将其导向一个或两个mhc呈递途径。mhc
‑
i呈递的肽将通常经由蛋白酶体加工从细胞质产生并通过内质网递送。因此，如在下文中更详细地讨论的，旨在用于mhc
‑
i呈递的表位的表达将通常被导向细胞质。另一方面，mhc
‑
ii呈递的肽将通常在递送至细胞膜之前经由酸性蛋白酶(例如，豆荚蛋白、组织蛋白酶l和组织蛋白酶s)的降解和加工从内体和溶酶体区室而产生。
[0176]
还可以使用多种方法增强多表位的蛋白质降解，包括将可切割的或不可切割的泛素部分添加至n
‑
末端，和/或将一个或多个去稳定的氨基酸(例如，n、k、c、f、e、r、q)置于多表位的n
‑
末端，其中呈递被导向mhc
‑
i。在呈递被导向mhc
‑
ii的情况下，可以将内体或溶酶体蛋白酶的切割位点工程化为多表位。
[0177]
信号和/或前导肽可以将新表位和/或多表位运输至内体和溶酶体区室，或将新表位/多表位保留在细胞质空间中。例如，为了将多表位输出至内体或溶酶体，前导肽(例如，cd1b前导肽)可以将多表位与细胞质隔离。另外地或可替代地，可以将靶向前序列和/或靶向肽添加至n
‑
末端和/或c
‑
末端。靶向前序列典型地包含6至136个之间的碱性氨基酸和疏水氨基酸。用于过氧化物酶体靶向的序列可以在c
‑
末端处。其他信号(例如，信号斑)包括在肽序列中分离并在适当的肽折叠后起作用的序列元件。蛋白质修饰(像糖基化)可以诱导靶向。合适的靶向信号包括但不限于过氧化物酶体靶向信号1(pts1)和过氧化物酶体靶向信号2(pts2)。
[0178]
此外，可以通过蛋白质的胞质溶胶结构域内的信号来将蛋白质分选为内体和溶酶体，这些信号典型地是短的线性序列。“基于酪氨酸的”分选信号符合npxy或共有基序。“基于双亮氨酸的”信号适合[de]xxxl[li]或dxxll共有基序。所有这些信号都被膜的胞质溶胶表面上的蛋白质外壳组分所识别。衔接蛋白(ap)复合物ap
‑
1、ap
‑
2、ap
‑
3和ap
‑
4识别具有特征性精细特异性的和[de]xxxl[li]信号，然而gga衔接家族识别dxxll信号。“fyve”结构域与液泡蛋白分选和内体功能相关联。人cd1尾序列(参见例如，immunology[免疫学],122:522
‑
31)也可以靶向内体。lamp1
‑
tm(跨膜)结构域靶向溶酶体。cd1a尾序列靶向再循环内体。cd1c尾序列靶向分选内体。
[0179]
多表位可以是嵌合多表位，其包括至少一部分，并且更典型地整个taa(例如，cea、psma、psa、muc1、afp、mage、her2、hcc1、p62、p90等)。通常经由mhc
‑
ii加工和呈递taa。因此，代替使用区室特异性信号和/或前导序列，用于taa的加工机制可以使用mhc
‑
ii靶向。
[0180]
运输至或保留在胞质溶胶区室中不一定需要一种或多种特定的序列元件。然而，可以添加n
‑
末端或c
‑
末端细胞质保留信号(例如，snap
‑
25、突触融合蛋白、突触蛋白、突触小分子蛋白、囊泡相关膜蛋白(vamp)、突触囊泡糖蛋白(sv2)、高亲和力胆碱转运蛋白、神经毒素，电压门控钙通道、乙酰胆碱酯酶、和notch)，包括膜锚定蛋白或膜锚定蛋白的膜锚定结构域。
[0181]
多表位还可包含一个或多个跨膜区段以在加工后将新表位引导至细胞外部，从而使其对免疫感受态细胞可见。本领域已知许多跨膜结构域，所有这些均适合用于本文，包括
具有单个α螺旋、多个α螺旋、α/β桶形结构等的那些跨膜结构域。例如，预期的跨膜结构域包括但不限于t细胞受体、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8(例如，cd8α、cd8β)、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa
‑
1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4
‑
1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla
‑
6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa
‑
1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa
‑
1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244，2b4)、cd84、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb
‑
a，ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo
‑
3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr或pag/cbp的α、β或ζ链的一个或多个跨膜区域。当需要融合蛋白时，重组嵌合基因可以具有编码一个或多个跨膜区的第一部分和编码抑制蛋白的第二部分(其与该第一部分同框)。这将不会实现mhc复合物的呈递，并因此提供了不依赖于mhc/t细胞受体相互作用的新表位呈递，这可能为免疫识别开辟了另外的途径以触发针对新表位的抗体产生。
[0182]
可替代地或另外地，多表位也可以包括输出信号序列，从而迫使经转染的细胞产生并分泌一种或多种新表位。例如，将sparc前导序列添加至新表位或多表位序列可实现新表位/多表位在体内分泌到胞外空间。有利地，此类分泌的新表位或多表位然后被免疫感受态细胞(尤其是apc，例如dc)吸收，这些细胞典型地经由mhc
‑
ii途径加工和展示新表位。
[0183]
可替代地或另外地，可以将新表位或多表位作为肽施用，任选地与运载体蛋白结合。在其他合适的运载体蛋白中，人白蛋白或乳铁蛋白是优选的。运载体蛋白可以处于天然的构象，或被预处理以形成具有暴露的疏水性结构域的纳米颗粒(参见例如，(2015)adv protein chem struct biol.[蛋白质化学和结构生物学的进展]98:121
‑
43)，新表位或多表位可以与这些运载体蛋白偶联。最典型地，新表位或多表位与运载体蛋白非共价地偶联。运载体结合的新表位或多表位将被免疫感受态细胞(尤其是apc，例如dc)吸收，这些细胞典型地经由mhc
‑
ii途径加工和展示新表位。
[0184]
免疫治疗组合物可以将一个或多个新表位递送至多种亚细胞位置，从而产生不同免疫应答。例如，现有技术图13说明了多表位主要在蛋白酶体中加工并经由mhc
‑
i呈递。mhc抗原被cd8
t细胞识别。因此，将多表位加工靶向胞质溶胶将使免疫应答向cd8

应答偏斜。另一方面，现有技术图14说明了多表位主要在内体中加工并经由mhc
‑
ii呈递。在这种情况下，mhc抗原被cd4
t细胞识别。因此，将多表位加工靶向内体或溶酶体将使免疫应答向cd4

应答偏斜。此类靶向方法将多表位和新表位肽递送至与该肽具有最高亲和力的特定mhc亚型，即使这些肽将不会由该mhc亚型呈递。在以下实例中，另外添加的氨基酸允许在细胞质、蛋白酶体、和内体中的加工灵活性。
[0185]
可以将新表位或多表位运输模式组合以适应特定的目的。例如，依次施用具有不同靶向的相同新表位或多表位可以在初免
‑
加强方案中发挥功能。第一次施用时，用重组病毒对患者接种以感染患者细胞，导致抗原表达、加工和mhc
‑
i呈递，从而实现源自细胞内的第一次免疫应答。然后，第二次施用与白蛋白结合的相同新表位可加强免疫，因为apc将该蛋白质呈递在mhc
‑
ii上。运输用于细胞表面结合的mhc非依赖性呈递的相同新表位或多表位可促进adcc应答或nk介导的细胞杀伤。如以下实例中说明的，交叉呈递或mhc
‑
ii引导的呈递可以增强新表位的免疫原性。
[0186]
可以按许多方式实现相同新表位或多表位的多种不同运输。例如，使用相同的(例如，病毒表达载体)或不同的(例如，病毒表达载体和白蛋白结合)模式，可以分别施用不同运输的新表位或多表位。类似地，并且尤其是当治疗剂是表达系统(例如，病毒的或细菌的)时，重组核酸可以包含两个不同的部分，这两个不同的部分编码相同的，尽管不同运输的新表位或多表位(例如，第一部分运输至第一位置(例如，胞质溶胶或内体或溶酶体的)，第二部分运输至第二个不同的位置(例如，胞质溶胶或内体或溶酶体，分泌的、膜结合))。同样，第一次施用可以将新表位或多表位靶向细胞质，而第二次施用(典型地在第一次施用后至少一天、两天、四天、一周或两周)可以将新表位或多表位靶向内体或溶酶体，或将它们分泌到细胞外。
[0187]
新表位和蛋白佐剂的一种示例性排列在图15中描绘。在此，重组核酸编码通过接头偶联在一起的第一系列的新表位。此第一区段与通过各自的接头偶联在一起的第二系列的新表位偶联。在第一和第二区段之间是gsg
‑
p2a自切割肽序列。第二系列的新表位的下游是编码两个单独的共刺激分子的区段，随后是编码检查点抑制剂的区段。在检查点抑制剂编码序列的更下游是编码佐剂肽的区段。图15的排列仅是说明性的。其他排列和内容也是合适的。
[0188]
尽管未示于图15中，但重组核酸中包含的人cd74衍生物序列元件“ii
‑
键(ii
‑
key)”可以增加mhc
‑
ii呈递的表位的免疫原性。示例性序列元件包括“lrmklpkppkpvskmr”及其更短的版本，尤其是“lrmk”。此类序列元件可以置于一个或多个患者和/或肿瘤特异性新表位的5'端。例如，构建体可以紧跟在前导肽序列之后并且在多表位序列之前，在mhc ii靶向多表位中含有一个或多个“ii
‑
键”序列，任选地具有一个或多个表位内接头(gpgpg
‑
lrmk)以增强各表位。
[0189]
表达构建体(例如，表达载体或质粒)可以进一步编码至少一种、至少两种、至少三种、或甚至至少四种共刺激分子，以增强感染的细胞(例如，apc)和t细胞之间的相互作用。非限制性实例包括cd80、cd86、cd30、cd40、cd30l、cd40l、icos
‑
l、b7
‑
h3、b7
‑
h4、cd70、ox40l、4
‑
1bbl、或甚至gitr
‑
l、tim
‑
3、tim
‑
4、cd48、cd58、tl1a、icam
‑
1、lfa3和slam家族成员。用于协调表达的尤其优选的分子包括cd80(b7
‑
1)、cd86(b7
‑
2)、cd54(icam
‑
1)和cd11(lfa
‑
1)。也可以从重组核酸表达一种或多种细胞因子或细胞因子类似物。非限制性实例包括il
‑
2、il
‑
15、和il
‑
15超激动剂(alt
‑
803)。可以协调共刺激分子和/或细胞因子的表达，使得新表位或多表位与共刺激分子和/或细胞因子同时表达。可以从单个转录物(任选地包括多表位编码序列)，例如使用ires或2a序列，或从多个转录物产生共刺激分子和/或细胞因子。
[0190]
病毒载体还可以编码一种或多种检查点受体配体。最典型地，结合抑制检查点信号传导。非限制性受体实例包括ctla
‑
4(尤其是针对cd8

细胞)、pd
‑
1(尤其是针对cd4

细胞)、tim1受体、2b4、和cd160。合适的肽结合物可包括抗体片段，尤其是scfv。特异性结合受体的小分子肽配体(例如，经由rna展示或噬菌体淘选分离)也是可用的。可以协调检查点抑制剂的表达，使得新表位或多表位同时表达。可以从单个转录物(任选地包括多表位编码序列)，例如使用ires或2a序列，或从多个转录物产生配体。
[0191]
上述所有的共刺激物和检查点抑制剂是本领域熟知的，并且编码这些蛋白质的基因、同种型、和变体的序列信息可以从各种公共资源(包括在ncbi、embl、genbank、refseq等
可访问的序列数据库)检索。尽管以上示例性刺激分子可以按全长的人形式表达，但经修饰的和非人形式也是合适的，只要此类形式刺激或激活t细胞。因此，突变蛋白、截短物和嵌合体也是合适的。
[0192]
表达构建体优选地包括编码一个或多个多表位的序列，其中至少一个、至少两个、或所有的多表位包括运输信号，这些运输信号将多表位引导到至少一个，并且更典型地至少两个亚细胞位置。例如，可以将第一多表位运输至细胞质，而将第二多表位运输至内体或溶酶体。或者，可以将第一多表位运输至内体或溶酶体，而将第二多表位运输至细胞膜或分泌物。
[0193]
病毒表达构建体(例如，腺病毒，尤其是δe1/δe2b adv5)可单独或组合用作治疗疫苗，用于伴随同种异体移植的或自体的自然杀伤细胞或t细胞的治疗—它们呈裸露形式或携带表达靶向新表位的抗体、新表位、肿瘤相关抗原或与该病毒相同的有效负载的嵌合抗原受体。包括患者衍生的nk
‑
92细胞系的自然杀伤细胞还可以表达cd16，并且可以与抗体偶联。
[0194]
可以单独或与自体或同种异体nk细胞，尤其是hank细胞或tank细胞(例如，两者均可从南特圭斯特公司(nantkwest)，9920杰弗逊大街卡尔弗城(jefferson blvd.culver city)，加利福尼亚州90232商购)组合施用另外的基于治疗新表位的模式(例如，如wo 2016/172722中所述针对新表位的合成抗体)。作为非限制性实例，hank细胞可以在cd16变体上携带与所治疗的患者的新表位结合的重组抗体，并且tank细胞可以携带与所治疗的患者的新表位结合的嵌合抗原受体。另外的治疗模式还可以不依赖新表位，例如激活的nk细胞(例如，ank细胞，可从南特圭斯特公司，9920杰弗逊大街卡尔弗城，加利福尼亚州90232商购)，以及非基于细胞的疗法(例如，化学疗法和/或放射疗法)。可以单独或与一种或多种检查点抑制剂(例如，伊匹单抗、纳武单抗等)组合施用免疫刺激细胞因子—尤其是il
‑
2、il15和il
‑
21。另外的药物干预可以包括施用一种或多种抑制免疫抑制性细胞(尤其是mdsc、treg和m2巨噬细胞)的药物。用于此目的的合适的药物包括il
‑
8或干扰素
‑
γ抑制剂或结合il
‑
8或干扰素
‑
γ的抗体；以及使mdsc失活的药物(例如，no抑制剂、精氨酸酶抑制剂、ros抑制剂)；阻断发育或分化为mdsc的药物(例如，il
‑
12、vegf抑制剂、双膦酸盐)；或对mdsc有毒性的药剂(例如，吉西他滨、顺铂、5
‑
fu)。同样，环磷酰胺、达利珠单抗和抗gitr或抗ox40抗体可以抑制treg。
[0195]
低剂量的、优选在节律方案中的化学疗法和/或放射疗法可以触发应激信号的过表达或转录。此类治疗可以使用影响蛋白质表达、细胞分裂和/或细胞周期，优选诱导细胞凋亡或应激相关基因(特别是nkg2d配体)的剂量。此类治疗可以包括使用一种或多种化学治疗剂的低剂量治疗。最典型地，低剂量治疗暴露应是化学治疗剂的ld
50
或ic
50
的不大于70％、等于或小于50％、等于或小于40％、等于或小于30％、等于或小于20％、等于或小于10％、或等于或小于5％。此类低剂量方案可以按如在us 7,758,891、us 7,771,751、us 7,780,984、us 7,981,445和us 8,034,375中所述的节律方式进行。
[0196]
所有已知的化学治疗剂均适合用于本文披露的方法，包括作为非限制性实例的激酶抑制剂、受体激动剂和拮抗剂、抗代谢药、细胞生长抑制药和细胞毒性药。如在wo 11/139345和wo 13/62505中所述，可以使用对组学数据的途径分析来鉴定适合干扰或抑制驱动肿瘤生长或发育的途径的药物。肿瘤细胞中应激相关基因的表达驱动nkg2d、nkp30、
nkp44和/或nkp46配体的表面呈递，其激活nk细胞以破坏肿瘤细胞。低剂量化学疗法可以触发肿瘤细胞以表达和展示与应激相关蛋白。
[0197]
虽然阐述本发明一些实施例的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可实行地精确地报告。在本发明的一些实施例中呈现的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。
[0198]
除非上下文指明相反，否则本文阐述的所有范围应当被解释为包括其端点，并且开放式范围应当被解释为仅包括商业实用值。类似地，除非上下文指出相反的情况，否则应将所有值的列表视为包含中间值。如本文的说明书和随后的整个权利要求中所使用，“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在
……
中(in)”的含义包括“在
……
中(in)”和“在
……
上(on)”，除非上下文另有明确说明。
[0199]
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文披露的构思的情况下，除了已经描述的那些之外，更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的精神中之外，所要求保护的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求书提及选自由a、b、c
……
和n组成的组的某物的至少一种的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个要素，而不是a加n、或b加n等。

技术特征：
1.一种表达盒，其包含与具有第一和第二核酸区段的重组核酸可操作地偶联的启动子；其中该第一核酸区段编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有tnf家族配体的胞外部分，该胞外部分通过柔性接头与其相应的tnf家族受体偶联；并且其中该第二核酸区段编码肿瘤相关抗原(taa)。2.如权利要求1所述的表达盒，其中该tnf家族配体的胞外部分比该嵌合蛋白上相应的tnf家族受体更接近n
‑
末端。3.如权利要求2所述的表达盒，其中该tnf家族配体是cd40l，并且其中该tnf家族受体是cd40。4.如权利要求3所述的表达盒，其中该重组核酸进一步包含编码与cd40l的胞外部分的n
‑
末端偶联的前导肽的第三核酸区段。5.如权利要求3或4所述的表达盒，其中该cd40l的胞外部分是cd40l的人胞外部分。6.如权利要求3
‑
5中任一项所述的表达盒，其中该柔性接头具有4和50个之间的氨基酸，并且任选地包含(gns)x序列。7.如前述权利要求中任一项所述的表达盒，其中该taa选自由短尾突变蛋白、muc1和cea组成的组。8.如前述权利要求中任一项所述的表达盒，其中该taa是患者特异性和肿瘤特异性新表位。9.如前述权利要求中任一项所述的表达盒，其中该第一和第二核酸区段置于相同阅读框中和/或被2a序列分开。10.如权利要求1
‑
8中任一项所述的表达盒，其中该第一和第二核酸区段经由ires序列偶联。11.如前述权利要求中任一项所述的表达盒，该表达盒进一步包含编码免疫刺激细胞因子的第四核酸区段。12.如权利要求11所述的表达盒，其中该免疫刺激细胞因子是与il
‑
7和il
‑
21中的至少一种偶联的il
‑
15超激动剂(alt803)。13.一种病毒，其包含如权利要求1
‑
12中任一项所述的表达盒。14.如权利要求13所述的病毒，其中该病毒是腺病毒。15.如权利要求14所述的病毒，其中该腺病毒是adv5[e1
‑
、e2b
‑
]。16.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求13
‑
15中任一项所述的病毒。17.如权利要求16所述的方法，该方法进一步包括向该患者施用检查点抑制剂。18.如权利要求16或17所述的方法，该方法进一步包括向该患者施用与il
‑
7和il
‑
21中的至少一种偶联的il
‑
15超激动剂(alt803)。19.如权利要求16
‑
18中任一项所述的方法，该方法进一步包括共施用经基因修饰的细菌或经基因修饰的酵母作为该病毒的佐剂。20.如权利要求19所述的方法，其中这些经基因修饰的细菌按不足以诱导cd
‑
14介导的脓毒症的水平表达内毒素。21.如权利要求20所述的方法，其中该经基因修饰的酵母属于gi
‑
400系列重组免疫治
疗酵母菌株。22.一种经基因修饰的免疫细胞，其包含如权利要求1
‑
12中任一项所述的表达盒。23.如权利要求22所述的经基因修饰的免疫细胞，其中该经基因修饰的免疫细胞源自树突细胞。24.如权利要求1
‑
12中任一项所述的表达盒、如权利要求13
‑
15中任一项所述的病毒、或者如权利要求22或23所述的免疫细胞用于产生用来治疗患有癌症的患者的药物组合物的用途。25.如权利要求24所述的用途，其中该经基因修饰的免疫细胞对该患者是同种异体的，并且是离体扩增的。26.一种产生用于增强免疫疗法的表达载体的方法，该方法包括：构建重组核酸，该重组核酸具有编码以下的序列：(a)可操作地连接至第一启动子以驱动多表位的表达的多表位，以及(b)可操作地连接至第二启动子以驱动佐剂多肽的表达的佐剂多肽；其中该多表位包含将该多表位引导至选自下组的亚细胞位置的运输元件，该组由以下组成：细胞质、再循环内体、分选内体、溶酶体、和胞外膜，或其中该运输元件将该多表位引导至胞外空间；并且其中该多表位包含多个经过滤的新表位序列。27.如权利要求26所述的方法，其中该佐剂多肽是钙网蛋白或hmgb1。28.如权利要求26或27所述的方法，其中该第一和第二启动子中的至少一个是组成型启动子。29.如权利要求26或27所述的方法，其中该第一和第二启动子中的至少一个是诱导型启动子。30.如权利要求29所述的方法，其中该启动子可被低氧、ifn
‑
γ或il
‑
8诱导。31.如权利要求26
‑
30中任一项所述的方法，其中该运输元件选自由以下组成的组：可切割的泛素、不可切割的泛素、cd1b前导序列、cd1a尾、cd1c尾和lamp1
‑
跨膜序列。32.如权利要求26
‑
31中任一项所述的方法，其中通过将相同患者的肿瘤与匹配的常态进行比较来过滤经过滤的新表位序列，并且任选地其中过滤这些经过滤的新表位序列以对mhc复合物具有等于或小于200nm的结合亲和力。33.如权利要求26
‑
32中任一项所述的方法，其中这些经过滤的新表位序列在该多表位内具有排列，使得该多表位具有疏水序列或信号肽的存在可能性，和/或具有低于预定阈值的疏水序列或信号肽强度。34.如权利要求26
‑
33中任一项所述的方法，其中这些经过滤的新表位序列与mhc
‑
i结合，并且其中该运输元件将该多表位引导至细胞质或蛋白酶体。35.如权利要求26
‑
33中任一项所述的方法，其中这些经过滤的新表位序列与mhc
‑
i结合，并且其中该运输元件将该多表位引导至再循环内体、分选内体、或溶酶体。36.如权利要求26
‑
33中任一项所述的方法，其中这些经过滤的新表位序列与mhc
‑
ii结合，并且其中该运输元件将该多表位引导至再循环内体、分选内体、或溶酶体。37.如权利要求26
‑
36中任一项所述的方法，其中该重组核酸进一步包含编码第二多表位的序列，其中该第二多表位包含将该第二多表位引导至不同亚细胞位置的第二运输元
件，并且其中该第二多表位包含第二多个经过滤的新表位序列。38.如权利要求37所述的方法，其中多个经过滤的新表位序列中的至少一些和第二多个经过滤的新表位序列中的一些是相同的。39.如权利要求26
‑
38中任一项所述的方法，其中该重组核酸进一步包含编码共刺激分子、免疫刺激细胞因子和干扰或下调检查点抑制的蛋白质中的至少一种的序列。40.如权利要求39所述的方法，其中该共刺激分子选自由以下组成的组：ox40l、4
‑
1bbl、cd80、cd86、cd30、cd40、cd30l、cd40l、icos
‑
l、b7
‑
h3、b7
‑
h4、cd70、gitr
‑
l、tim
‑
3、tim
‑
4、cd48、cd58、tl1a、icam
‑
1和lfa3。41.如权利要求39所述的方法，其中该免疫刺激细胞因子选自由以下组成的组：il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
15超激动剂(alt803)、il
‑
21、ips1和lmp1。42.如权利要求39所述的方法，其中该进行干扰的蛋白质是ctla
‑
4、pd
‑
1、tim1受体、2b4或cd160的抗体或拮抗剂。43.如权利要求26
‑
42中任一项所述的方法，其中该运输元件选自由以下组成的组：可切割的泛素、不可切割的泛素、cd1b前导序列、cd1a尾、cd1c尾和lamp1
‑
跨膜序列。44.如权利要求26
‑
43中任一项所述的方法，其中该表达载体选自由以下组成的组：缺失了e1和e2b基因的腺病毒表达载体、酵母表达载体、和细菌表达载体。45.一种改善患有肿瘤的个体对癌症免疫疗法的免疫应答的方法，该方法包括：向该肿瘤施用癌症疫苗组合物；并且基本上同时向该肿瘤共施用佐剂多肽、atp、或atp类似物。46.如权利要求45所述的方法，其中该癌症疫苗组合物包含重组腺病毒、重组酵母、或重组细菌。47.如权利要求45或46所述的方法，其中该癌症疫苗组合物包含或编码该患者的肿瘤新表位。48.如权利要求45
‑
47中任一项所述的方法，其中将该癌症疫苗组合物直接施用至该肿瘤。49.如权利要求45
‑
48中任一项所述的方法，其中该佐剂多肽是钙网蛋白或hmgb1。50.如权利要求45
‑
49中任一项所述的方法，其中该佐剂是不可水解的atp类似物。51.如权利要求45
‑
50中任一项所述的方法，其中将该佐剂多肽、atp、或atp类似物注射到该肿瘤中。52.一种通过以下方法制备的经基因工程化的激活的树突细胞(dc)，该方法包括：用具有第一和第二核酸区段的重组核酸感染肿瘤细胞；其中该第一核酸区段编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白具有通过柔性接头与cd40l偶联的cd40的胞外部分；并且其中该第二核酸区段编码肿瘤相关抗原。53.如权利要求52所述的dc，其进一步包含编码影响肿瘤微环境的抗体分泌部分的重组核酸。54.如权利要求52或53所述的dc，其中该抗体分泌部分包含以下中的一种或多种：pd1、ctla4和tgfβ阱以及il
‑
8。55.一种治疗有需要的患者的肿瘤的方法，该方法包括向该患者施用包含如权利要求
52
‑
54中任一项所述的dc的组合物。56.如权利要求55所述的方法，其中该施用是肿瘤内的。57.如权利要求55所述的方法，其中该施用是局部的。58.如权利要求55所述的方法，其中该施用通过注射到患者的组织中进行。59.如权利要求55所述的方法，其中该施用通过吸入进行。60.如权利要求55所述的方法，其中该施用是鞘内的。61.如权利要求55
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60中任一项所述的方法，其中该肿瘤是膀胱肿瘤、脑肿瘤、皮肤肿瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、和/或肺癌。
技术总结
提供了一种癌症疫苗，其包括编码自激活嵌合信号传导蛋白、并且尤其是嵌合TNF家族配体


技术研发人员：P
受保护的技术使用者：南特细胞公司
技术研发日：2019.10.07
技术公布日：2021/6/29