一条抑制amyloid-beta聚焦的多肽及应用的制作方法

一条抑制amyloid
‑
beta聚焦的多肽及应用
技术领域
1.本发明涉及一条抑制amyloid
‑
beta聚焦的多肽及应用，属于多肽设计、药物筛选开发领域。


背景技术：

2.随着近些年来科技的不断发展，计算机应用在生物学领域中愈发重要，而基于计算机模拟的分子对接虚拟筛选技术更是近年来亲和肽的理性设计和筛选的研究热点。该方法借力于计算机的快速运算来实现多肽小分子在靶蛋白分子活性位点上的连续对接，这些多肽多来源于已经准备好的虚拟肽库，然后经过和靶蛋白的虚拟对接，找到能够和靶蛋白结合的小分子多肽，通过计算机软件计算出多肽与靶蛋白结合的方式并打分，我们依据打分结果挑选出与靶蛋白结合较好的配体，合成后用过体外实验筛选和验证。
3.我国阿尔海默症(alzheimer disease，ad)患病人数己超过900万，已经发生前期轻度认知障碍患者已超过2300万，预计到2050年患病人口将超过2000万，是世界上ad患病人口最多、增长速度最快的国家，给患者自身及家庭、社会和医疗将带来沉重负担。在60岁以上的老年人群中，年龄每增加5岁，患ad的危险约增加1.85倍。因此，由ad导致的经济负担和社会问题会日益严重，也已成为全人类共同面临的巨大挑战之一。amyloid
‑
beta结构(β
‑
淀粉样蛋白)的过度聚集和tau蛋白的过度磷酸化被我们认为是ad发生的两大主要假说。许多学者认为app裂解后形成的aβ沉积所形成的老年斑是ad发病的主要原因，因此，防止aβ的聚集是治疗ad的一种有前景的方法。已有的研究证明，可溶性aβ寡聚体毒性最大，主要通过影响细胞膜离子通道，产生氧化应激，激活神经胶质细胞引发炎症反应等途径。aβ在人体中有多种存在形式，主要以aβ1‑
42
和aβ1‑
40
为主，其中aβ1‑
42
因为其毒性更大和更易发生聚集而成为研究重点。


技术实现要素：

4.本发明借助于计算机辅助设计，在amyloid
‑
beta晶体结构的基础上，通过分子对接虚拟筛选技术，搜寻虚拟多肽数据库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体p2696，其多肽序列为yekkgm。固相合成yekkgm，利用aβ1‑
42
蛋白标品分别进行硫磺素t(thioflavint,tht)tht荧光、表面等离子共振(surface plasmon resonance，spr)和细胞毒性实验，结果表明，多肽p2696对aβ1‑
42
蛋白聚集有良好的结合能力，由此证明，借助本发明设计而成的多肽，可用于抑制aβ1‑
42
聚集的毒性。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.一条抑制amyloid
‑
beta聚焦的多肽序列p2696，所述的多肽序列p2696为yekkgm。
7.所述的多肽序列p2696，包括以所述的多肽序列p2696为核心，对该多肽序列p2696所进行的相应修饰；修饰材料包括纳米材料、荧光材料、酶类及生物素。
8.所述的多肽序列p2696在抑制amyloid
‑
beta结构毒性中的应用。
9.所述的多肽序列p2696在检测amyloid
‑
beta结构中的应用。
10.所述的多肽序列p2696在制备amyloid
‑
beta结构的药物中的应用。
11.本发明的有益效果：
12.1、本发明基于amyloid
‑
beta晶体结构(pdb id:6shs)，通过分子对接虚拟筛选技术，获得一条与β
‑
淀粉样蛋白特异性结合的多肽序列p2696，其多肽序列为yekkgm。固相合成多肽，并与amyloid
‑
beta进行亲和力鉴定，p2696序列与aβ1‑
42
蛋白之间相互作用的平衡解离常数k
d
为2.693
×
10
‑6m，说明亲和力较好。
13.2、本发明p2696多肽序列在一定程度上对pc12细胞没有毒性，且对aβ1‑
42
蛋白造成的pc12细胞损伤具有较好的保护作用。本发明设计合成的多肽具有方便高效及成本低的优势。
附图说明
14.图1为p2696序列与aβ1‑
42
蛋白的对接结果展示。
15.图2为p2696序列抑制aβ1‑
42
蛋白聚集的效果图。
16.其中，abeta表示，仅含有aβ1‑
42
样品；p812696表示，p2696与aβ1‑
42
的混合样品。
17.图3为p2696序列与aβ1‑
42
蛋白的lspr亲和力鉴定结果。
18.其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。
19.图4为p2696序列自身对pc12细胞活力的影响。
20.其中，横坐标表示多肽浓度，纵坐标表示细胞活力。
21.图5为不同浓度的p2696序列与aβ1‑
42
蛋白共孵育后对aβ1‑
42
蛋白毒性的影响。
具体实施方式
22.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
23.实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选
24.1、aβ1‑
42
蛋白晶体结构的准备
25.借助计算机辅助设计软件对aβ1‑
42
蛋白的晶体结构(pdb id:6shs)进行分析，选定其第16
‑
23位氨基酸残基作为设定的对接区域，进行分子对接。
26.2、虚拟多肽库的设计
27.本发明采用逐个氨基酸残基延长的方式，首先将评分最高的几种氨基酸库逐个与靶标蛋白的结构实施对接，依据对接情况选择最佳的氨基酸残基为核心，再依次增加相应的氨基酸数量直至达到最佳的对接结果为止。虚拟多肽库生成的肽序列以3
‑
12位氨基酸残基为宜。
28.3、对接结果的评断
29.分别计算多肽与蛋白结合的自由能，氢链，范得华力等力学参数进行综合评定，以此来判定筛选结果，并筛选得到p2696，其多肽序列为yekkgm，其与aβ1‑
42
蛋白对接的相互作用结果见图1。
30.实施例2 p2696序列与aβ1‑
42
蛋白结合的荧光强度鉴定
31.1、首先是aβ1‑
42
单体的制备，将aβ1‑
42
以1mg/ml溶解于六氟异丙醇(hfip)中，静置1小时，充分溶解后超声10分钟，然后在通风橱中使hfip挥发完全，保存于
‑
80℃冰箱，使用时
将其溶解于pbs缓冲液(含100mm pb，10mm nacl，ph 7.4)中。
32.2、将获得的p2696序列溶解于pbs缓冲液(含100mm pb，10mm nacl，ph 7.4)中。实验时将aβ1‑
42
单体溶液和p2696溶液混合，aβ1‑
42
终浓度为25μm，p2696终浓度为50μm。
33.3、将混合后的样品在37℃培养箱中共同孵育24小时，取20μl样品。用tht染液(含25μm tht，25mm pb)稀释20倍后，在激发波长440nm，发射波长480nm下测定tht荧光强度。将仅含有aβ1‑
42
样品的荧光强度设为100％，进行归一化处理(见图2)。
34.结果表明，p2696序列对于合成的aβ1‑
42
蛋白的体外聚集具有良好的抑制效果。
35.实施例3 p2696序列与aβ1‑
42
蛋白的亲和力鉴定
36.1、确定合适的ph作为偶联条件。在把aβ1‑
42
蛋白固定到cm5芯片上之前，需要筛选合适的缓冲液ph，使配体通过静电吸附作用富集到cm5芯片表面附近，达到较好的偶联效果。分别使用ph 5.5、5.0、4.5、4.0的醋酸钠溶液稀释aβ1‑
42
样品为50μg/ml。上样时间180s，50mm的naoh作为清洗溶液，根据结果确定使用ph 4.5作为偶联条件。
37.2、配体偶联。使用氨基直接偶联法固定aβ1‑
42
蛋白至cm5芯片表面。选择flow cell 1作为参照通道，flow cell 2作为样品通道。选择偶联模式为specify contact time。然后按照样品位置示意图，一一对应放入hbs
‑
ep缓冲液、edc/nhs溶液、溶解于ph4.5醋酸钠的aβ1‑
42
溶液和乙醇胺溶液至样品盘中，检查缓冲液，保存方法和结果文件；点击run，开始正式偶联。
38.3、亲和力的测定。选择run kinetics/affinityassay点击kinetics/affinity设定相关实验参数，选择flow cell为1，2和芯片种类为cm5。startup的solution为hbs
‑
ep缓冲液，结合时间120s，解离时间120s，再生溶液为0.25％的十二烷基硫酸钠(sds)，稳定时间30s。填写填写样品名称为p2696，将样品溶解于hbs
‑
ep缓冲液，稀释成浓度为25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.56μm、0.78μm的多肽溶液，并设置一个零浓度和一个最低浓度重复的样品，按照要求放置样品，检查缓冲液，保存文件，点击run开始实验。配体偶联和亲和力的测定均使用biacore x100 control software完成。
39.4、数据处理。实验结束后，使用evaluation软件对结果进行分析，使用flow cell 2扣除flow cell 1的背景信号为实验结果。使用1:1binding拟合方式进行拟合(见图3)。图中从上到下各曲线对应的溶液浓度逐渐降低。
40.结果表明，随着p2696浓度的升高，结合量也越大，且响应时间快，p2696序列对于合成的aβ1‑
42
蛋白具有较好的亲和性结合，p2696序列对于合成的aβ1‑
42
蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数k
d
为2.693
×
10
‑6m。
41.实施例4 p2696多肽的毒性鉴定
42.1、多肽样品准备。将p2696多肽溶解于dmem完全培养基(含10％胎牛血清的dmem高糖培养基，高糖培养基中含4.5g/l葡萄糖，含l
‑
谷氨酰胺，不含丙酮酸钠)中，制成不同浓度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μm)的多肽溶液，用于下一步实验。
43.2、细胞铺板。挑选处于生长对数期的pc12细胞，pbs清洗两遍，加入1
‑
2ml胰蛋白酶，于37℃消化1min，轻拍培养瓶侧面，在倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞间隙变大、变圆时加入dmem完全培养基终止消化，将细胞轻轻吹打下来转移至离心管中，以1000r/min的速度离心5分钟，弃上清，加入新的dmem完全培养基，细胞计数板计数，稀释成密度为5
×
104个/ml的细胞悬液，以100μl/孔(5
×
103个/孔)铺板。
44.3、cck
‑
8法检测细胞活力。待细胞贴壁后，加入不同浓度的多肽溶液，每个浓度5个复孔，为给药组，只加入培养基溶液的为对照组，加入100μl培养基和10μl cck
‑
8溶液但没有加入细胞的孔作为空白组。于37℃培养24h后，每孔加入10μl cck
‑
8溶液，在细胞培养箱中继续培养2小时，在450nm处测定吸光度。细胞活力＝(给药组
‑
空白组)/(对照组
‑
空白组)
×
100％(见图4)。
45.结果表明，随着多肽p2696浓度的增加，p2696在较高浓度下对pc12细胞产生了一定的毒性，在低浓度条件下效果较好，p2696序列在一定程度上对pc12细胞没有毒性。
46.实施例5 p2696多肽抑制aβ1‑
42
毒性的鉴定
47.1、样品准备。将前期制得的aβ1‑
42
单体和p2696多肽分别溶解于dmem完全培养基中，终浓度为aβ1‑
42
25μm，p2696多肽样品50μm，37℃孵育72h。
48.2、细胞铺板。挑选处于生长对数期的pc12细胞，pbs清洗两遍，加入1
‑
2ml胰蛋白酶，于37℃消化1min，轻拍培养瓶侧面，在倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞间隙变大、变圆时加入dmem完全培养基终止消化，将细胞轻轻吹打下来转移至离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清，加入新的dmem完全培养基，细胞计数板计数，稀释成密度为5
×
104个/ml的细胞悬液，以100μl/孔(5
×
103个/孔)铺板。
49.3、cck
‑
8法检测细胞活力。待细胞贴壁后，分别加入只含aβ1‑
42
单体的样品、及p2696多肽抑制剂存在下的aβ1‑
42
单体样品(aβ1‑
42
单体和p2696多肽的混合体积比如图5)，每个浓度5个复孔，为给药组；只加入培养基溶液的为对照组，加入100μl培养基和10μl cck
‑
8溶液但没有加入细胞的孔作为空白组，37℃培养24h后，每孔加入10μl cck
‑
8溶液，在细胞培养箱中继续培养2小时，在450nm处测定吸光度。细胞活力＝(给药组
‑
空白组)/(对照组
‑
空白组)
×
100％(见图5，a25表示aβ浓度为25μm)。
50.结果表明，aβ1
‑
42对pc12细胞活力有较大影响，p2696和aβ1
‑
42共孵育后，细胞活力有所增加，在aβ：多肽为1:4时，达到最高，p2696序列对aβ1‑
42
造成的pc12细胞损伤具有较好的保护作用。

技术特征：
1.一条抑制amyloid
‑
beta聚焦的多肽序列p2696，其特征在于，所述的多肽序列p2696为yekkgm。2.根据权利要求1所述的多肽序列p2696，其特征在于，包括以所述的多肽序列p2696为核心，对该多肽序列p2696所进行的相应修饰；修饰材料包括纳米材料、荧光材料、酶类及生物素。3.一种如权利要求1或2所述的多肽序列p2696在抑制amyloid
‑
beta结构毒性中的应用。4.一种如权利要求1或2所述的多肽序列p2696在检测amyloid
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beta结构中的应用。5.一种如权利要求1或2所述的多肽序列p2696在制备amyloid
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beta结构的靶向药物中的应用。
技术总结
本发明涉及一条抑制amyloid


技术研发人员：张改平 王方雨 邢广旭 金前跃 孙雪峰 魏啬 曹帅
受保护的技术使用者：河南省农业科学院动物免疫学重点实验室
技术研发日：2021.04.02
技术公布日：2021/6/29