一种基于荧光RMA法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组的制作方法

一种基于荧光rma法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组
技术领域
1.本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光rma法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组。


背景技术：

2.性传播疾病(std)是主要通过性接触传播的一类泌尿生殖道感染性疾病，引起泌尿生殖道感染的生殖道病原体主要包括沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，ct)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，ng)、解脲脲原体(ureaplasma urealyticum，uu)等，其感染不仅可以引起尿道炎、附睾炎、子宫内膜炎、盆腔炎和输卵管炎等，严重的还可以导致育龄妇女不孕、流产、早产等不良孕产史，严重危害两性健康。而临床上存在高比例的混合感染，且多重及慢性持续性泌尿生殖道感染可导致性病的广泛传播以及发生严重的并发症，给临床诊疗和预防控制带来困难，因此快速、高通量检测生殖道病原体对性病的诊疗和防治具有重要意义。
3.目前沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌的实验室检测方法主要有培养法、免疫学方法、分子生物学方法等。培养法虽然特异性较高，但所需时间长，操作复杂，易漏检或误检，而且有些病原体如uu培养灵敏度较低；用免疫学方法检测病原体抗原灵敏度低，易出现假阴性问题，而检测抗体存在“窗口期”问题，同时不能判定是现症感染还是既往感染；pcr技术需要经过培训的专业人员和复杂的仪器设备，且存在易交叉污染等缺点。
4.因此，近年来不需要热循环仪的等温扩增方法应运而生。其中重组酶介导扩增(recombinase mediatedamplification,rma)技术，被认为是可替代pcr的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶三种酶。rma反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现核酸的快速检测。rma反应的扩增产物可以通过实时荧光法进行检测。其中，探针上携带有碱基替代物dspcacer(四氢呋喃)，dspcacer的5’端有荧光基团、3’端有淬灭基团。扩增时，核酸外切酶iii从dspcacer处切割探针使荧光基团与淬灭基团分开，荧光信号得以释放，且得到可延伸的3
’‑
oh，在dna聚合酶作用下可继续进行dna延伸。随着反应进行，荧光信号逐渐增强，可以通过实时荧光检测仪检测。
5.本发明正是在荧光rma法的基础上开发了联合检测沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)三种常见生殖道病原体的试剂盒，可广泛用于生殖道病原体的辅助诊断，指导临床用药等多个领域。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光rma法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：
7.一种基于荧光rma法联合检测三种殖道病原体的引物探针组，包括检测沙眼衣原
体(ct)的引物对及对应的探针、检测淋病奈瑟菌(ng)的引物对及对应的探针以及检测解脲脲原体(uu)的引物对及对应的探针，其中：
8.(1)ct引物和探针序列为：
9.ct
‑
f：
[0010]5’‑
ctagttggtggggtaaaggcctaccaaggctat
‑3’
；
[0011]
ct
‑
r：
[0012]5’‑
cggtgcttctttacctggtacgctcaaatccag
‑3’
；
[0013]
ct
‑
p：
[0014]5’‑
cgacgccgcgtgtgtgatgaaggctctaggg(fam
‑
dt)(thf)g(bhq1
‑
dt)aaagcactttcgct(c3
‑
spacer)
‑3’
。
[0015]
(2)ng引物和探针序列为：
[0016]
ng
‑
f：
[0017]5’‑
tgacggtacctgaagaataagcaccggctaactac
‑3’
；
[0018]
ng
‑
r：
[0019]5’‑
cggtattcctccacatctctacgcatttcactgct
‑3’
；
[0020]
ng
‑
p：
[0021]5’‑
attactgggcgtaaagcgggcgcagacgg(joe
‑
dt)(thf)ac(bhq1
‑
dt)taagcaggatgtga(c3
‑
spacer)
‑3’
。
[0022]
(3)uu引物和探针序列为：
[0023]
uu
‑
f：
[0024]5’‑
actgagaggtagaacagccacaatgggactgag
‑3’
；
[0025]
uu
‑
r：
[0026]5’‑
ttacgcccagtaaatccggataacgcttgcatc
‑3’
；
[0027]
uu
‑
p：
[0028]5’‑
agtagggaatttttcacaatgggcgcaagcc(cy5
‑
dt)(thf)a(bhq2
‑
dt)gaagcaatgccgcgt(c3
‑
spacer)
‑3’
。
[0029]
优选的，所述沙眼衣原体(ct)的检测探针上标记的荧光报告基团是fam，荧光淬灭基团是bhq1；所述淋病奈瑟菌(ng)的检测探针上标记的荧光报告基团是joe，荧光淬灭基团是bhq1；所述解脲脲原体(uu)的检测探针上标记的荧光报告基团是cy5，荧光淬灭基团是bhq2。
[0030]
一种基于荧光rma法联合检测三种殖道病原体的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
[0031]
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。所述扩增反应试剂包括rma引物对及检测探针组、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。
[0032]
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白
的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓度为60ng/μl；所述核酸外切酶iii的终浓度为80ng/μl。
[0033]
优选的，所述标准阳性质粒为含有沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)基因片段的重组质粒，用于ct、ng、uu核酸检测的阳性对照。
[0034]
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
[0035]
一种基于荧光rma法联合检测三种殖道病原体的方法，包括以下步骤：
[0036]
(1)提取待测样本的核酸，待测样本为泌尿生殖道分泌物；
[0037]
(2)设计用于ct、ng、uu检测的引物对及探针；
[0038]
(3)以提取的待测样本核酸作为模板，加入上述生殖道病原体检测用的引物对和探针进行荧光rma扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min；
[0039]
(4)结果分析：在荧光rma扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)的阴、阳性。若待检样本包含ct，则标记fam的探针产生荧光信号；若待检样本包含ng，则标记joe的探针产生荧光信号；若待检样本包含uu，则标记cy5的探针产生荧光信号。这样，同一反应管内可确定三种病原体。
[0040]
有益效果：本发明能在同一反应管内同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体三种常见生殖道病原体核酸，同时采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本，同时减少患者不便，减轻患者经济负担。
附图说明
[0041]
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0042]
图1荧光rma法检测ct的灵敏度实验；
[0043]
图2荧光rma法检测ng的灵敏度实验；
[0044]
图3荧光rma法检测uu的灵敏度实验；
[0045]
图4荧光rma法检测ct的特异性实验；
[0046]
图5荧光rma法检测ng的特异性实验；
[0047]
图6荧光rma法检测uu的特异性实验。
具体实施方式
[0048]
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
[0049]
实施例1
[0050]
1、阳性标准质粒的制备
[0051]
提取沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)的核酸为模板，对ct、ng、
uu的特异性基因进行pcr扩增，pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pmd18
‑
t载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落pcr验证，将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒dna，获得阳性质粒(p
‑
ct、p
‑
ng、p
‑
uu)。
[0052]
2、荧光rma引物与探针的设计
[0053]
针对ct、ng、uu的16s rrna基因分别设计了荧光rma引物与探针，具体如表1所示：
[0054]
表1引物与探针序列
[0055][0056]
注：ct
‑
探针的荧光基团用fam修饰，ng
‑
探针的荧光基团用joe修饰，uu
‑
探针的荧光基团用cy5修饰，淬灭基团用bhq1/2修饰，3’末端被阻断基团c3
‑
spacer修饰。
[0057]
3、荧光rma反应体系的建立
[0058]
将42.5μl缓冲液和5μl提取的病原体核酸模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μl的280mm醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min；每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照。
[0059]
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。所述扩增反应试剂包括rma引物对及检测探针组、大肠杆菌reca蛋白、uvsy蛋白、单链结合蛋白gp32、bst聚合酶、核酸外切酶iii、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、atp、dntps、肌酸激酶和磷酸肌酸。
[0060]
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μm；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mm；所述甘露醇的终浓度为2.5mm；所述atp的终浓度为10mm；所述dntps的终浓度为2mm；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/ml；所述磷酸肌酸的终浓度为25mm；所述大肠杆菌reca蛋白的终浓度为100ng/μl；所述uvsy蛋白的终浓度为40ng/μl；所述单链结合蛋白gp32的终浓度为800ng/μl；所述bst聚合酶的终浓
度为60ng/μl；所述核酸外切酶iii的终浓度为80ng/μl。
[0061]
优选的，所述标准阳性质粒为含有沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)基因片段的重组质粒，用于ct、ng、uu核酸检测的阳性对照。
[0062]
4、结果判读
[0063]
根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有ct、ng、uu。仅产生标记fam的荧光信号表示为ct阳性；仅产生标记joe的荧光信号表示为ng阳性；仅产生标记cy5的荧光信号表示为uu阳性。
[0064]
5、荧光rma法检测ct、ng、uu的灵敏度分析
[0065]
将标准阳性质粒经pbs进行10倍系列稀释(包括2
×
105、2
×
104、2
×
103、2
×
102和2
×
101拷贝/反应)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光rma反应，每个浓度重复3次试验。根据图1
‑
3可知，2
×
105‑2×
102结果均为阳性。即，荧光rma法检测试剂盒的灵敏度达到2
×
102个拷贝/反应。
[0066]
6、荧光rma法检测ct、ng、uu的特异性分析
[0067]
用建立的荧光rma方法分别检测沙眼衣原体(ct)、淋病奈瑟菌(ng)、解脲脲原体(uu)、单纯疱疹病毒2型(hsv2)、生殖支原体(mg)、人型支原体(mh)、阴道加特纳菌(gv)、阴道毛滴虫(tv)等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图4
‑
6可知，若仅标记fam的探针产生荧光信号，则检测为ct阳性，而对ng、uu和其他病原体检测为阴性；若仅标记joe的探针产生荧光信号，则检测为ng阳性，而对ct、uu和其他病原体检测为阴性；若仅标记cy5的探针产生荧光信号，则检测为uu阳性，而对ct、ng和其他病原体检测为阴性，说明该荧光rma法具有良好的检出效果和特异性。
[0068]
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于荧光rma法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组，其特征在于，包括检测沙眼衣原体(ct)的引物对及对应的探针、检测淋病奈瑟菌(ng)的引物对及对应的探针以及检测解脲脲原体(uu)的引物对及对应的探针，其中：(1)ct引物和探针序列为：ct
‑
f：5
’‑
ctagttggtggggtaaaggcctaccaaggctat
‑3’
；ct
‑
r：5
’‑
cggtgcttctttacctggtacgctcaaatccag
‑3’
；ct
‑
p：5
’‑
cgacgccgcgtgtgtgatgaaggctctaggg(fam
‑
dt)(thf)g(bhq1
‑
dt)aaagcactttcgct(c3
‑
spacer)
‑3’
。(2)ng引物和探针序列为：ng
‑
f：5
’‑
tgacggtacctgaagaataagcaccggctaactac
‑3’
；ng
‑
r：5
’‑
cggtattcctccacatctctacgcatttcactgct
‑3’
；ng
‑
p：5
’‑
attactgggcgtaaagcgggcgcagacgg(joe
‑
dt)(thf)ac(bhq1
‑
dt)taagcaggatgtga(c3
‑
spacer)
‑3’
。(3)uu引物和探针序列为：uu
‑
f：5
’‑
actgagaggtagaacagccacaatgggactgag
‑3’
；uu
‑
r：5
’‑
ttacgcccagtaaatccggataacgcttgcatc
‑3’
；uu
‑
p：5
’‑
agtagggaatttttcacaatgggcgcaagcc(cy5
‑
dt)(thf)a(bhq2
‑
dt)gaagcaatgccgcgt(c3
‑
spacer)
‑3’
。2.如权利要求1所述的一种基于荧光rma法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组，其特征在于，所述沙眼衣原体(ct)的检测探针上标记的荧光报告基团是fam，荧光淬灭基团是bhq1；所述淋病奈瑟菌(ng)的检测探针上标记的荧光报告基团是joe，荧光淬灭基团是bhq1；所述解脲脲原体(uu)的检测探针上标记的荧光报告基团是cy5，荧光淬灭基团是bhq2。
技术总结
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法联合检测三种生殖道病原体的引物探针组，属于生物检测技术领域。该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。所述含有扩增反应试剂的检测管中同时包括检测沙眼衣原体（CT）、淋病奈瑟菌（NG）、解脲脲原体（UU）的引物对及对应的探针。本发明能在同一反应管内同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体三种常见生殖道病原体核酸，操作简单，价格低廉，可高效、快速、准确地检测出相关的生殖道病原体，对性病的诊疗和防治具有重要意义。对性病的诊疗和防治具有重要意义。对性病的诊疗和防治具有重要意义。


技术研发人员：陈龙 陈大为 张瑶
受保护的技术使用者：济南国益生物科技有限公司
技术研发日：2021.04.25
技术公布日：2021/6/29