间充质干细胞来源的外泌体和方法与流程

间充质干细胞来源的外泌体和方法
1.本申请要求2018年10月18日提交的序列号为62/747,605的我们共同未决的美国临时专利申请的优先权，并且将其通过引用并入本文中。
技术领域
2.本披露涉及在治疗疼痛和/或炎症中使用的外泌体、特别是来源于先前已用炎性刺激刺激的细胞的外泌体的组合物和方法。


背景技术：

3.背景技术描述包括在理解本披露中可能有用的信息。这不是承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明有关，也不是承认明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。
4.本文中所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请均被明确地和单独地指出通过引用并入一样。在并入的参考文件中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用而在该参考文件中该术语的定义不适用。
5.能以多种方式进行疼痛、尤其是术后疼痛和与(慢性)炎症相关的疼痛的控制。最常见的是，可以使用非甾体类抗炎药(nsaid)、降低中枢神经敏感性的各种药物以及阿片类镇痛药来治疗疼痛。nsaid即使在相对较高的剂量下也通常具有良好的耐受性，但往往不足以控制疼痛。另一方面，阿片类镇痛药通常在减轻疼痛方面非常有效，但通常与耐受性和依赖性风险相关。
6.例如，大多数nsaid通过抑制cox酶起作用并减少前列腺素的形成。尽管非选择性抑制cox产生了显著的抗痛觉过敏作用，并阐明了前列腺素在炎性痛觉过敏中的重要性，但临床使用往往受到严重胃肠道副作用的限制。最近，引入了选择性cox
‑
2抑制剂，以减少这些不利影响。但是，选择性cox
‑
2抑制剂伴有明显的心脏风险。为了避免与cox相关的难题，可以通过选择性受体阻滞显著降低前列腺素的作用。最有前途的方法是使用ep受体亚家族的拮抗剂，它们存在于感觉神经元上并被pge2激活。在更进一步的已知方法中，可以对nsaid进行修饰以释放一氧化氮，从而提供改善的抗伤害感受性和抗炎性作用。但是，这种治疗大多是实验性的。
7.阿片物质(opiate)由免疫细胞产生，阿片类受体存在于周围组织中。值得注意的是，在炎症过程中，初级传入神经元中μ、δ和κ受体的表达增加，而选择性激动剂阻断了使发炎的皮肤受神经支配的纤维的自发放电。此外，为外周使用而开发的阿片类激动剂在炎性病症(例如实验性关节炎)中通常表现出抗伤害感受性活性。潜在地，外周地起作用的阿片类化合物可通过全身或甚至局部应用在炎性病症中缓解疼痛。然而，最近的阿片类物质危机(opioid crisis)证明，使用阿片类物质有很高的依赖性或成瘾风险。
8.在更进一步已知的治疗疼痛的方法中，可以施用大麻素，以使用两种类型的大麻素受体cb1和cb2来以减少或抑制外周敏化。前者在中枢和周围神经元以及非神经元细胞上
表达，而后者是非神经元起源的并存在于免疫细胞上。cb1受体的激活与腺苷酸环化酶负性偶联，并阻断了初级传入受体的兴奋性和激活。cb2受体的激活可通过抑制免疫细胞功能而产生抗伤害感受性作用。然而，使用大麻素进行疼痛管理在很大程度上是实验性的，可能不适合严重疼痛。
9.因此，即使在本领域中已知各种镇痛药，它们中的全部或几乎全部都具有各种缺点。因此，需要提供改进的组合物和方法，这些组合物和方法提供有效的疼痛控制而没有高风险的不良事件。


技术实现要素：

10.本文披露了采用外泌体作为治疗剂的各种组合物和方法，其中外泌体来源于先前已用致炎剂(inflammatory agent)刺激的细胞。有利地，已经证明此类外泌体具有抗炎和/或镇痛特性。
11.在一方面，本文披露了一种减少个体对阿片类镇痛需求的方法。优选的方法包括向个体施用如下的步骤：(1)组合物，该组合物包含来自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的外泌体；和/或(2)组合物，该组合物包含分泌抗炎细胞因子(例如，肿瘤生长因子β)的细胞(例如，间充质干细胞)。例如，个体可以被诊断为患有炎性病症或癌症，或可能已接受手术(例如，关节置换术)。
12.在一些实施例中，外泌体源自(例如，脂肪)间充质干细胞，而在其他实施例中，外泌体源自肿瘤细胞。优选地，但非必须地，外泌体来自同一个体的干细胞或肿瘤细胞。关于炎性刺激，预期了刺激ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和sting(干扰素基因刺激物)激活剂。通常，将干细胞或肿瘤细胞暴露于炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达，和/或其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
‑
6、il
‑
8、il10或ccl
‑
2。需要时，组合物被配制成用于注射和/或每剂量单位将包含至少107个外泌体、或至少108或至少109个外泌体。
13.在另一方面，本文披露了治疗个体的炎性病症和相关疼痛的方法。此类方法将包括向个体施用组合物的步骤，该组合物包含来自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的外泌体。
14.最典型的是，个体被诊断为患有慢性炎性病症或癌症，或已接受过癌症治疗或关节置换术。如上文提到的，外泌体优选来自间充质干细胞，最典型地来自同一个体的干细胞。合适的炎性刺激包括ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和/或sting(干扰素基因刺激物)激活剂。此外，预期将干细胞或肿瘤细胞暴露于炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达和/或预期将干细胞或肿瘤细胞暴露于炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
‑
6、il
‑
8、il10或ccl
‑
2。
15.在又一方面，本文披露了制备药物组合物的方法。这样的方法将包括将个体的干细胞和/或肿瘤细胞在培养基中离体暴露于炎性刺激的步骤。在进一步的步骤中，从培养基收获外泌体，并且在又另一个步骤中，将收获的外泌体配制成适合注射或输注的药物组合物。
16.例如，合适的干细胞包括间充质干细胞(例如，脂肪间充质干细胞)，而预期的炎性
刺激包括ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和//或sting(干扰素基因刺激物)激活剂。最典型地，将干细胞或肿瘤细胞暴露于炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达，和/或其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
‑
6、il
‑
8、il10或ccl
‑
2。在进一步预期的实施例中，将干细胞或肿瘤细胞暴露于炎性刺激至少24小时、或至少36小时、或至少48小时。
17.在一些实施例中，使用超速离心步骤或聚合物沉淀步骤收获外泌体，而在其他实施例中，用抗体或其片段使用亲和分离步骤收获外泌体。优选的药物组合物每剂量单位包含至少107个外泌体、或至少108、或至少109个外泌体。如果需要的话，抗炎剂和/或镇痛药可以包括在药物组合物中。
18.因此，本文披露了药物组合物，其包含多个经刺激的干细胞来源的外泌体或经刺激的肿瘤细胞来源的外泌体，其中该组合物被配制成用于注射或输注。例如，经刺激的干细胞来源的外泌体来自间充质干细胞，并且对于接受外泌体的个体，这些外泌体可以是自体外泌体。关于细胞刺激和配制，适用与上文相同的考虑。合适的组合物还可以包含nsaid和/或抗炎细胞因子或趋化因子。
19.本文还披露了来自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的外泌体，用于在医药中使用。在不限制本披露的情况下，优选地，外泌体的平均颗粒大小在约70nm至约130nm之间、外泌体来自间充质干细胞、和/或外泌体来自肿瘤细胞。最典型地，外泌体来自同一个体的干细胞或肿瘤细胞(自体外泌体)。关于细胞刺激和配制，适用与上文相同的考虑。另外，预期优选的在医药中使用包括治疗炎性病症和/或治疗疼痛。
20.从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。
附图说明
21.图1描绘的结果表明用ifnγ/tnfα混合物刺激诱导形态变化并抑制amsc增殖。(a)与10、20和40ng/ml浓度的ifnγ/tnfα一起孵育48小时，amsc的代表性相位对比图(放大10倍)。(b
‑
c)通过锥虫蓝排除测定法测量细胞增殖和活力。柱，平均值；条，sd*与未刺激的细胞有显著差异；
§
与10ng/ml浓度的ifnγ/tnfα处理有显著差异，p<0.05。
22.图2描绘的结果表明用ifnγ/tnfα混合物刺激诱导amsc中免疫抑制因子、细胞因子和趋化因子表达。用10、20和40ng/ml浓度的ifnγ/tnfα处理amsc 48小时。通过流式细胞术测量ido的表达，通过elisa试剂盒测量上清液中pge2和细胞因子/趋化因子产生。柱，平均值；条，sd，*与未刺激的细胞有显著差异；
§
与10ng/ml浓度的ifnγ/tnfα处理有显著差异，p<0.05。
23.图3描绘了表征amsc来源的外泌体的结果。(a)amsc来源的外泌体、exoquick来源的上清液(sn)和amsc裂解物的cd9、cd63、cd81和tsg101胞外蛋白及钙连蛋白、grp94和risc污染物的免疫印迹。(b)通过exocet试剂盒测量外泌体ache酶的酶活性，定量外泌体的浓度。颗粒大小通过qnano系统(d)进行定量，并且显示了频率大小分布的代表性曲线图(c)。柱，平均值；条，sd。
24.图4描绘的结果表明用促炎性细胞因子预激活的、amsc来源的外泌体诱导抗炎性m2表型回复m1分化。(a)单独gm
‑
csf(ctrl)或与分离自未刺激的(exo unstim)或细胞因子
激活的(exo ifnγ/tnfα10、20和40ng/ml)amsc的上清液的外泌体组合存在下，单核细胞分化为巨噬细胞的代表性相位对比显微图(放大20倍)。绿色圆圈表示细胞具有细长的纺锤状形态，这是m2巨噬细胞的典型特征。对巨噬细胞上细胞表面分子cd163(b)cd206(c)和cd80(d)的流式细胞分析。表达水平表示为相对于未处理的细胞的中值荧光强度(mfi)倍数变化。柱，平均值；条，sd，*与未刺激的细胞有显著差异，p<0.05。
25.图5描绘的结果表明，用炎性细胞因子预激活的、amsc来源的外泌体含有参与m2巨噬细胞极化的mirna。通过qrt
‑
pcr，在由amsc产生的、经或未经10、20和40ng/ml ifnγ/tnfα处理的外泌体中测量mir
‑
34(a)、mir
‑
127(b)、mir
‑
21(c)、mir
‑
135(d)、mir
‑
146(e)和mir
‑
155(f)的浓度。柱，平均值；条，sd，*与未刺激的细胞的外泌体有显著差异，p<0.05。(g)在分离自未刺激的(exo unstim)或细胞因子激活的(exo ifnγ/tnfα10、20和40ng/ml)amsc的上清液的外泌体存在下，gm
‑
csf使巨噬细胞中的单核细胞分化。用针对irak1、notch1、sirp
‑
β1和β
‑
肌动蛋白的特异性抗体对细胞裂解液进行western印迹分析。
26.图6描绘了表征来自经刺激的肿瘤细胞的外泌体的结果；(a)肿瘤来源的外泌体、exoquick来源的上清液和细胞匀浆的免疫印迹分析，用于检测指定的蛋白质。(b)将外泌体与exoflow珠偶联，用exofitc染料或cd81、cd9和cd63的特异性单克隆抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。将抗体(白色峰)与其合适的同种型对照(灰色峰)进行比较。显示了来自一个代表性实验的直方图。(c)直方图表示cd9阳性珠与未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的细胞(lps，黑色柱)释放的外泌体结合的百分比。数据显示为平均值(n＝4)
±
sd。(d)通过exocet试剂盒(d)或通过lm10 nanosight的纳米颗粒跟踪分析(nta)(e)测量外泌体ache酶的酶活性，估算外泌体的数量。数据显示为平均值(n＝8)
±
sd。*p<0.05。(f
‑
g)通过nanosight评估颗粒大小分布，并且显示了频率大小分布的代表性曲线图。数据显示为平均值(n＝8)
±
sd。*p<0.05。
27.图7描绘的结果表明lps处理后释放的外泌体以剂量依赖性方式抑制t细胞增殖；(a)将分离自健康供体的cfse标记的pbmc用标量剂量(从5
×
106至5
×
109)的由未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的肿瘤细胞(lps，黑色柱)释放的外泌体预处理24小时。直方图显示cd3 t细胞在增殖中的百分比，将100％的值指定为未处理的细胞的增殖活性。数据显示为平均值(n＝5)
±
sd。
§
与未处理的cd3 t细胞相比，p<0.05；*与由未刺激的肿瘤细胞释放的外泌体处理的cd3 t细胞的增殖相比，p<0.05；(b)代表性的细胞计数cfse直方图显示了未处理的(ctrl)和外泌体处理的(exo ctrl和exo lps)cd3 t细胞的增殖分数。将cfse标记的pbmc用5
×
108个外泌体预处理24小时，将未处理的细胞的增殖视为100％，直方图显示增殖的cd3 (c)、cd4 (d)和cd8 (e)t细胞在pbmc中的分数。数据显示为平均值(n＝6)
±
sd。*p<0.05。
28.图8描绘的结果表明外泌体表面上的tgfβ的表达及其对调节性t细胞扩增的影响。使用tgf
‑
β磁性luminex性能测定(magnetic luminex performance assay)针对由未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的肿瘤细胞(lps，黑色柱)释放的外泌体，评估tgf
‑
β1(a)和tgf
‑
β2(b)在外泌体表面上的表达。数据显示为平均值(n＝8)
±
sd。*与由未刺激的肿瘤细胞释放的外泌体有差异，p<0.05。(c
‑
d)在由未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的肿瘤细胞(lps，黑色柱)释放的外泌体存在下，将通过阴性选择从pbmc分离的cd4 t细胞用抗cd3、抗cd28和il
‑
2进行刺激。在第4天通过荧光激活流式细胞术(facs)测量效应子(cd4 /cd25
‑
/
foxp3
‑
)或调节性t细胞(cd4 /cd25 /foxp3 )的百分比。显示了cd25和foxp3染色的代表性图，直方图表示效应子与调节性t细胞之比(t
eff
/t
reg
)。数据显示为平均值(n＝6)
±
sd；*与未处理的细胞有差异，p<0.05；**与未处理的细胞有差异，p<0.005。
29.图9描绘的结果表明外泌体表面上的nkg2d配体的表达以及nk和cd8 t细胞上的nkg2d表达的调节；将外泌体与exoflow珠偶联，用针对mica/b或ulbp
‑
1的单克隆抗体染色，并通过facs进行分析。(a)显示了对照(黑色线)和lps来源的外泌体(红色线)的mica/b染色的facs分析的代表性图。直方图表示mica/b
‑
(b)和ulbp
‑
1(c)阳性珠与未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的细胞(lps，黑色柱)释放的外泌体结合的百分比。数据显示为平均值(n＝6)；条，sd；*与由未刺激的肿瘤细胞释放的外泌体有差异，p<0.05。将pbmc或分离的cd16 cd56 nk细胞用由未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的肿瘤细胞(lps，黑色柱)释放的外泌体处理24小时。通过facs分析cd8 (d)和nk细胞(e)的nkg2d表达。数据显示为平均值(n＝6)；条，sd；
§
与未处理的细胞有差异；*与用未刺激的肿瘤细胞释放的外泌体处理的细胞有差异，p<0.05。
30.图10描绘的结果表明mir
‑
21和mir
‑
34a在肿瘤来源的外泌体中表达；通过qrt
‑
pcr，在由未刺激的(ctrl，白色柱)或lps激活的肿瘤细胞(lps，黑色柱)产生的外泌体中测量mir
‑
21(a)和mir
‑
34a(b)的浓度。数据表示为平均值(n＝3)；条，sd，*与由未刺激的肿瘤细胞释放的外泌体有差异，p<0.05。
具体实施方式
31.疼痛，尤其是与手术和/或炎性病症相关的疼痛，可通过施用具有明显镇痛和抗炎活性的外泌体来治疗，这些外泌体减少了对阿片类镇痛药的需求，并且还下调了炎症。特别合适的外泌体包括源自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的那些。进一步预期的治疗还可以包括施用分泌抗炎细胞因子例如tgf
‑
β的细胞(例如干细胞)，其中这些细胞先前也已暴露于一种或多种炎性刺激。同样，应当理解，预期的组合物和方法还可仅包括外泌体的一部分，特别是从外泌体分离的调节蛋白、rna和/或mirna。
32.例如，可以通过将药物组合物注射到修复部位(例如，在膝的滑囊中)来治疗与关节置换(例如，膝或髋关节置换)相关的疼痛，每次施用通常使用至少107(例如，至少108或至少109)个外泌体。最优选地，外泌体将源自接受外泌体的同一患者的脂肪间充质干细胞，从而降低针对外泌体组分的免疫应答的风险。通常，外泌体的施用将是经由注射典型地施用到疼痛和炎症的部位或附近至少一次、且更典型地至少两次(例如，经2
‑
6周的时段)。在不限制本披露的情况下，本文预期的外泌体的镇痛作用将通过至少两种不同的作用方式来实现：外泌体可直接或间接抑制或减少与疼痛相关的效应子，并通过抗炎信号下调炎症。
33.当然，应当注意，除关节置换以外的各种疼痛病症也被认为适于本文使用，并且通常包括与炎症、组织创伤和肿瘤相关的所有疼痛病症。例如，与炎症相关的疼痛病症包括自身免疫性疾病、与慢性炎症相关的疼痛，而与组织创伤相关的疼痛可是由于意外伤害、手术等引起的。同样，与许多肿瘤相关的疼痛通常也不依赖于特定的肿瘤类型。在至少一些实施例中，特别优选的细胞是干细胞，例如间充质干细胞。但是，其他类型的干细胞，例如表皮或内胚层干细胞也被认为适于本文使用。此外，应注意的是，合适的干细胞还可包括多能和全能干细胞(即发育上更“上游”)，以及特定组织的祖细胞(即发育上更“下游”)。在仍另外的
实施例中，合适的细胞不必限于干细胞或祖细胞，而是还可包括肿瘤细胞、各种白细胞和凝血细胞(thrombocyte)。因此，合适的干细胞可以来源于骨髓、脂肪组织、脐带血等。
34.不管用于产生外泌体的特定细胞类型如何，优选地，细胞相对于接受外泌体的个体是自体的。可替代地，细胞也可来自不同的个体。在那种情况下，通常优选细胞与接受外泌体的个体之间存在的hla相容性为至少两位数且更典型至少四位数深度的至少四种hla亚型(例如hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c、hla
‑
dr、hla
‑
dq、hla
‑
dp)。
35.并非来自所有细胞的所有外泌体均会表现出镇痛和/或抗炎作用，但是具有镇痛和/或抗炎作用的外泌体通常将来源于先前受到过促炎或其他细胞应激刺激的细胞。值得注意的是，各种炎性病症将促进具有明显抗炎活性的外泌体的产生，这可用作各种治疗和治疗组成中的组分。例如，如本文所述制备的外泌体将抑制或减少cd4 和cd8 t细胞增殖、将调节巨噬细胞极化、和/或有利于treg发育。此外，观察到外泌体也可存在nkg2d配体，因此可以充当可溶性nkg2d配体，从而导致nk细胞失活。
36.例如，为了产生具有镇痛和/或抗炎作用的外泌体，将在炎性(或其他应激)刺激的存在下离体培养细胞，最通常持续至少6小时、或至少12小时、或至少24小时、或至少36小时、或至少48小时的时段。取决于细胞的类型，可以在常氧或低氧条件下进行细胞培养。例如，能以约21vol％o2、或15
‑
20vol％、或10
‑
15vol％、或5
‑
10vol％、或1
‑
5vol％培养干细胞和肿瘤细胞。最典型地，细胞培养将在35℃
‑
39℃进行，且在某些情况下在37℃
‑
42℃之间进行。技术人员将容易地为所选细胞确定合适的细胞培养基。在某些非限制性实施例中，然后可以通过超速离心来收获外泌体，例如以大于10g(例如，大于50g、大于100g、大于500g、大于1000g、或大于5000g)的力持续至少15min(例如，至少30min、至少45min、至少1hr、至少5hr、至少10hr或至少12hr)进行。另外地或可替代地，外泌体可以从培养基中收获或通过聚合物沉淀从离心的沉淀物中收获，如由(例如)peterson等人(2015)methods[方法]87:31
‑
45所述。
[0037]
关于炎性刺激，预期刺激以连续(例如，通过泵)或间歇(例如，通过培养基置换)的方式提供给培养中的细胞，使用的浓度将触发适当的应答(例如，诱导基因表达、可溶性因子的分泌或受体的呈递、细胞信号传导的激活等)。例如，预期的炎性刺激包括促炎性细胞因子，如ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、一种或多种tlr配体、一种或多种nod配体和/或一种或多种sting(干扰素基因刺激物)激活剂。发挥生物学作用的这些刺激的浓度在本领域中通常是众所周知的，并且所有这样的浓度都被认为适于本文使用。在又其他实施例中，(例如，干细胞或肿瘤)将细胞暴露于炎性刺激，其量为增加所暴露的细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达，和/或其量为增加细胞中的il
‑
6、il
‑
8、il10或ccl
‑
2。因此，选择特别合适的细胞和刺激，使得促炎性刺激将触发抗炎细胞应答。
[0038]
还进一步预期的刺激包括多甘露糖醛酸和其他常见于细菌、藻类和真菌中的免疫刺激(杂)多糖，例如多糖a、蛋白质结合多糖psk或psp、脂多糖(lps)、透明质酸和各种β
‑
(1,3)
‑
葡聚糖。
[0039]
在适当的细胞培养时间之后，然后可以使用本领域已知的所有方式从培养基中收集外泌体。例如，可以通过首先从培养基中去除细胞，然后通过超速离心培养基以沉淀外泌体来收集外泌体。可替代地，也可以使用聚合沉淀(例如，使用来自sbi biosystems的exoquick
tm
)或膜联蛋白v沉淀、或使用各种亲和试剂(例如，针对外泌体特异性标志物cd9、
cd81和hsp70的抗体)分离外泌体。不论分离方式如何，通常优选在配制用于注射的外泌体之前进一步纯化(例如，使用透析或膜过滤)分离的外泌体。合适的药物组合物将通常每剂量单位(例如1
‑
5ml)包含至少106、或至少107、或至少108、或至少109个外泌体的量的一种或多种不同类型的外泌体(源自一种或多种不同类型的经处理的细胞)。如将容易理解的，用于输注注射的合适的液体载体包括等渗溶液，尤其是等渗盐水、右旋糖和/或乳酸盐溶液。此外，预期的组合物可进一步包含一种或多种已知的镇痛药和/或抗炎剂，典型地其数量为通常在相应的处方信息中规定和公开的。
[0040]
可替代地，也可以进一步处理分离的外泌体以分离或鉴定外泌体中发挥抗炎和/或镇痛作用的一种或多种介质分子，尤其考虑到的介质包括mrna、mirna和各种蛋白质组分(可以被或可以不会被膜锚定)。在这种情况下，介质将被表征并单独使用或与其他镇痛药和/或抗炎药组合使用，以配制成药物组合物。另外地，观察到来自经刺激的癌细胞(例如sw
‑
480)的外泌体具有大量的选择的整联蛋白，尤其是整联蛋白
‑
α5和整联蛋白
‑
β5。由于据报道这些整联蛋白与癌症来源的外泌体在转移性靶组织中的归巢有关，这些分子的阻滞剂(例如抗体、其片段、或其他高亲和力结合剂)可用于药物组合物中，以减少外泌体向远端部位的归巢。
[0041]
因此，来自受刺激细胞的外泌体在治疗有需要的个体中特别有用，特别是在个体具有炎性病症(尤其是具有与炎性病症相关的疼痛)和/或遭受疼痛的情况下。照此，预期的方法和组合物将减少对阿片类镇痛药的需求，从而大大降低习惯性和依赖性的风险。因此，预期的组合物可用于治疗炎症并减轻与炎症相关的疼痛。
[0042]
实例
[0043]
脂肪间充质干细胞的分离和培养：从脂肪抽吸物(lipoaspirate)获得的脂肪组织中分离出脂肪间充质干细胞(amsc)。在获得捐助者的知情同意后，收集了总共六个脂肪抽吸物样品。在37℃使用0.05％胶原酶ii溶液将脂肪抽吸物酶解20分钟(worthington)，并且酶中和后，以500
×
g离心5分钟并通过70μm尼龙网(默克密理博公司(merck millipore))过滤。将细胞接种在补充有10％fbs(gibco公司)、青霉素/链霉素溶液(10ml/l)、丙氨酸/谷氨酰胺溶液(2mm)、人表皮生长因子(10ng/ml)、胰岛素溶液(10μg/ml)、2
‑
磷酸
‑
l
‑
抗坏血酸三钠盐(100μm)和地塞米松(0.01μm)(均来自西格玛奥德里奇公司(sigma
‑
aldrich))的最低必需培养基
‑
α(mem
‑
α)中。将培养基保持在37℃、5％co2和95％湿度下，并使用msc阳性标志物(cd29、cd73、cd90和cd105)和造血阴性标志物(cd34和cd45)通过流式细胞术对细胞进行表征。使用第2代到第5代之间的细胞进行实验。
[0044]
用ifnγ和tnfα激活脂肪间充质干细胞：为了用炎性因子激活amsc，以15,000个细胞/cm2的密度接种细胞，并在24小时后将上清液替换为新鲜培养基，该培养基补充有5％认证的无外泌体血清(gibco公司)以及不同浓度(10、20和40ng/ml)的重组人ifnγ和tnfα(prepotech公司)。10ng/ml的浓度相当于200u/ml。48小时后，收获amsc，并通过锥虫蓝排除测定法测量细胞增殖/活力。对于流式细胞术分析，将amsc固定并用细胞内fix/perm溶液(ebiosciences公司)透化，与fitc偶联的吲哚胺
‑
吡咯2,3
‑
二加氧酶(ido)抗体(ebiosciences公司)一起孵育15分钟，然后用pbs洗涤两次。在facscalibur(becton dickson)上进行流式细胞术，并使用flowing软件分析数据。还收获上清液，以14,000
×
g离心10分钟，并保存在
‑
80℃进行外泌体分离或细胞因子检测。il
‑
6、il
‑
10、il
‑
8和ccl
‑
2的浓
度采用基于磁珠的多重测定法(bio
‑
plex测定，伯乐实验室(bio
‑
rad laboratories))测量，而前列腺素e2释放(pge2)则用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(英杰公司(invitrogen))定量。
[0045]
外泌体rna分离、文库制备/测序和rt
‑
pcr：为了保留小rna，添加cel
‑
mir39 spike
‑
in作为外源对照(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))，使用mirvana paris试剂盒(生命技术公司(life technologies))从5
×
109个amsc来源的外泌体提取总rna。通过nanodrop
tm 1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)评估提取的rna的质量和数量，并保存在
‑
80℃直至使用。
[0046]
对于mirna性能分析，检查了五种不同纯化中获得的一系列amsc来源的外泌体。按照制造商的说明，已用“truseq smallrna样品制备试剂盒”(依诺米那公司(illumina))进行文库制备。rna样品和最终文库均使用qubit 2.0荧光计(英杰公司)进行了定量，并通过agilent 2100生物分析仪rna纳米测定(安捷伦技术公司(agilent technologies))进行了质量检测。然后按照制造商的说明，使用illumina cbot处理文库以在流动池中生成簇，并在nextseq 500(依诺米那公司，圣地亚哥，加利福尼亚)上以单端模式进行测序。使用illumina管道(pipeline)casava 1.8.2版处理原始数据，以进行格式转换和多路分解。
[0047]
除了cdna模板以1:2稀释而不是推荐的1:10稀释之外，根据制造商的说明，使用advanced mirna测定(赛默飞世尔科技公司)评估了参与调节巨噬细胞m1(has
‑
mir
‑
21
‑
5p、has
‑
mir
‑
127
‑
3p和has
‑
mir
‑
155
‑
5p)和m2(has
‑
mir
‑
34a
‑
5p、has
‑
mir124
‑
3p、has
‑
mir135b
‑
5p和hsa
‑
mir146a
‑
5p)极化的mirna的相对浓度。
[0048]
实时反应在applied biosystems quantstudio 3系统上进行。使用相对标准曲线方法对mirna相对浓度进行归一化，该相对标准曲线方法是通过cel
‑
mir39的系列稀释(1nm
‑
100fm)获得的。
[0049]
单核细胞分离和分化为m1巨噬细胞：通过ficoll梯度离心(密理博公司(millipore))从供血者的edta抗凝结血液中分离出人外周血单核细胞(pbmc)。根据制造商的说明，使用人cd14 细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(stemcell technologies))通过阴性选择从pbmc中分离单核细胞，并将其重悬于补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸盐、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素、1％hepes(均来自euroclone公司)的rpmi培养基中。为了去除fbs中存在的外泌体部分，将血清以100,000
×
g超速离心4小时。通过用抗cd14(ebiosciences公司)染色来判断单核细胞的纯度超过95％(数据未示出)。
[0050]
对于巨噬细胞分化，将cd14 单核细胞以5
×
105/cm2接种在多孔板中的完全rpmi培养基中，该培养基存在有8
×
108个amsc来源的外泌体，补充有100ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf，派普泰克公司(peprotech))；每3天彻底更换一次培养基。在第9天，使用tryple tm表达分离溶液(gibco公司)收获巨噬细胞，并使用cd80、cd206和cd163抗体(ebiosciences公司)通过流式细胞术对m1和m2巨噬细胞标志物的表达进行表征。还将巨噬细胞在ripa缓冲液中裂解，并通过免疫印迹分析irak1、notch1和sirpb1的表达。将抗irak1(1:1000，细胞信号转导公司(cell signalling))、抗β
‑
肌动蛋白(1:5000，细胞信号转导公司)、抗notch1(1:500，细胞信号转导公司)和抗sirp
‑
β1(1:200，圣克鲁斯生物技术公司(santa cruz biotecnologies))用作一抗。将辣根过氧化物酶(hrp)偶联的igg抗体(1:
1000，dako公司)用作二抗。
[0051]
细胞因子ifnγ和tnfα刺激对amsc的影响：使用特异性表面标志物通过流式细胞仪测试了由脂肪组织分离的amsc：测试的amsc的造血标志物(cd34和cd45)几乎完全阴性，而间充质干细胞标志物(cd29、cd73、cd90和cd105)的阳性率>95％(附图1)。为了测量炎性刺激是否会影响amsc的形态和活力，将细胞在10、20和40ng/ml浓度的ifnγ/tnfα存在下孵育48小时。用细胞因子处理会诱导形态改变，因为细胞变得更加细长并具有不规则形状的特征(图1(a))。
[0052]
与细胞因子一起孵育以浓度依赖性方式降低了amsc增殖(图1(b))，而细胞活力未受到影响(图1(c))。检查了炎性刺激对amsc释放免疫抑制因子和细胞因子/趋化因子的影响。ifnγ/tnfα处理以浓度依赖性方式增加了ido酶的表达(图2，(a))，而pge2(图2(b))、il
‑
10(图2(c))和il
‑
8(图2(d))的释放仅在用至少20ng/ml的ifnγ/tnfα混合物处理后才被显著诱导。最后，仅在用40ng/ml的ifnγ/tnfα处理后，il
‑
6(图2(e))和ccl
‑
2(图2(f))的上调才显著。
[0053]
促炎性细胞因子刺激后，amsc来源的外泌体的表征：将amsc用浓度递增(10、20和40ng/ml)的ifnγ/tnfα进行预处理，然后使用exoquick聚合物基策略从上清液中获得富外泌体的级分。如图3(a)中所示，amsc来源的外泌体和amsc裂解物表达了特异性外泌体标志物cd9、cd63、cd81和tsg101，而未观察到exoquick来源的上清液样品(将其用作阴性对照)的信号。为了评估外泌体制剂中的杂质，测定了与亚细胞区室相关的蛋白质的表达。推测这些蛋白质在外泌体中不存在或不足以表现出。外泌体级分中缺乏钙连蛋白(内质网蛋白)和risc复合物(核蛋白)表明成功富集。grp94(内质网蛋白)在外泌体级分中也出现一条微弱的条带，可能是由于凋亡小体的轻微污染所致。
[0054]
通过exocet试剂盒测量ache的活性，确定amsc来源的外泌体的浓度。如图3(b)中报告的，未处理的细胞释放的外泌体的平均浓度为7.6
±
2.6
×
109/百万个生产细胞，其大小分布如图3(c)中所示。用细胞因子处理不会影响amsc释放的外泌体的数量。最后，通过qnano技术测定的、收集的囊泡的平均大小为115
±
11.5nm，在外泌体适当大小的范围内，不受amsc细胞因子处理的影响(图3(d))。
[0055]
用促炎性细胞因子预激活的、amsc来源的外泌体诱导抗炎性m2表型回复m1分化：为了检查amsc来源的外泌体诱导巨噬细胞抗炎性表型的能力，在分离自经ifnγ/tnfα预激活的amsc上清液的外泌体存在下，用gm
‑
csf诱导从献血者pbmc分离的cd14 单核细胞分化为m1巨噬细胞。如图4(a)中所示，在第9天，对照单核细胞产生“煎蛋形”形态，这是m1样巨噬细胞的典型特征。当在从预激活的amsc获得的外泌体存在下分化单核细胞时，一些细胞表现出细长的纺锤状形态，这是m2巨噬细胞的典型特征。这种作用在与外泌体一起孵育的单核细胞中尤为明显，这些外泌体是从用40ng/ml的ifnγ/tnfα预激活的amsc中分离出来的。实际上，与未处理的m1样巨噬细胞相比，仅从预激活的amsc中分离出的外泌体能够上调m2巨噬细胞标志物cd163的表达(图4(b))。关于cd206的表达，只有在用40ng/ml的ifnγ/tnfα预激活的细胞产生的外泌体处理后，它才显著(图4(c))。相比之下，在amsc来源的外泌体的存在下，m1巨噬细胞标志物cd80的表达没有显著变化(图4(d))。
[0056]
为了评估外泌体制剂中ifnγ和tnfα的可能的污染，用exoquick处理补充有不同浓度(10、20和40ng/ml)细胞因子的培养基，并通过基于磁珠的多重测定法测量ifnγ和tnf
α的浓度。
[0057]
这些测试仅显示了痕量的ifnγ(0.096
±
0.003pg/ml)和tnfα(0.039
±
0.001pg/ml)，与文献中用于刺激单核细胞或巨噬细胞的那些相比是最低的。此外，这些污染物不影响cd80和cd163的表达中的巨噬细胞极化。
[0058]
用炎性细胞因子预激活的、amsc来源的外泌体含有参与m2巨噬细胞极化的mirna：外泌体相关的微rna使用下一代小rna测序进行分析，将未处理的细胞释放的外泌体设置为对照样品，并将经20ng/ml ifnγ/tnfα处理的amsc释放的外泌体设置为测试样品。将测试样品的归一化基因表达谱除以相应的对照样品的，计算倍数变化。amsc的细胞因子激活在释放的外泌体中诱导了23种不同mirna的过表达和低表达(under
‑
expression)。
[0059]
接下来，rna测序的重点是参与巨噬细胞极化的调节的特异性mirna。通过定量rt
‑
pcr对mirna的表达调节朝向m1(mir
‑
127
‑
3p和mir
‑
155
‑
5p)或m2(mir
‑
34a
‑
5p、mir124
‑
3p、mir135b
‑
5p和mir146a
‑
5p)表型的分化进行评估。值得注意的是，mir
‑
21
‑
5p能够重定向m1和m2极化(取决于蛋白质靶标)。除无法检测到的mirna
‑
124
‑
3p外，所有受研究的mirna在未刺激的amsc来源的外泌体中均以低水平表达(图6)。与未处理的细胞相比，用20和40ng/ml ifnγ/tnfα预激活的amsc产生的外泌体中mirna
‑
34(图5(a))和mirna
‑
146(图5(b))的表达显著更高，而mirna
‑
21表达仅在40ng/ml细胞因子预刺激下显著上调(图5(c))。对于mir
‑
135的表达，未观察到差异(图5(d))。mir
‑
127(图5(e))和mir
‑
155(图5(f))的表达仅在以最高(40ng/ml)细胞因子浓度激活的amsc产生的外泌体中显著增加，但与描述的其他mirna相比，程度要小得多。
[0060]
最后，为了评估amsc实验模型中mirna表达上调的下游影响，分析了巨噬细胞裂解物中某些特定mirna靶标的蛋白质表达。特别地，分析了notch1(mir
‑
34a21靶向的)、irak1(mir
‑
14622靶向的)和sirp
‑
β1(mir
‑
2123靶向的)的表达。如图5(g)所例示，用预刺激的amsc的外泌体处理后，irak1表达急剧降低，而仅有用20ng/ml细胞因子处理的细胞释放的外泌体处理后，notch1的表达才降低。sirp
‑
β1的表达不受外泌体处理的影响。
[0061]
肿瘤细胞培养和lps处理：人肿瘤细胞系sw480(原发性结肠腺癌)、sw620(转移性结肠腺癌)、mda
‑
mb
‑
231(转移性乳腺腺癌)和u87
‑
mg(胶质母细胞瘤)购自西格玛奥德里奇公司。将细胞在添加有10％fbs(gibco公司)和1％青霉素/链霉素溶液(gibco公司)的两种不同的杜氏改良基本培养基(对于sw480和sw620为高葡萄糖dmem，而对于mda
‑
mb
‑
231和u87
‑
mg为低葡萄糖dmem)中在37℃下在5％co2的潮湿空气下生长。
[0062]
为了激活tlr4，将细胞与[1μg/ml]lps(大肠杆菌055:b5 lps，西格玛奥德里奇公司)一起孵育24小时，用pbs洗涤3次，然后将培养基替换为补充有10％认证的无外泌体血清(gibco公司)的新鲜培养基。24小时后，收集上清液并保存在
‑
20℃下直至使用，同时收获细胞，并通过锥虫蓝排除测定法测量其增殖/活力。
[0063]
外泌体分离和表征：用聚合物沉淀法使用exoquick
‑
tc(系统生物科学公司)从细胞系的上清液中分离外泌体。将含外泌体的沉淀重悬于pbs或裂解缓冲液中，以进行后续分析。根据制造商的说明，使用exocet试剂盒(系统生物科学公司)测量外泌体的数量，并使用配备有532nm激光的nanosight lm10系统(马尔文仪器有限公司(malvern instrument ltd.))通过纳米颗粒跟踪分析(nta)评估大小分布。
[0064]
通过免疫印迹分析细胞裂解物、外泌体和exoquick来源的上清液的外泌体标志物
的表达和污染物。将人抗cd9(1:1000，系统生物科学公司)、抗cd63(1:1000，ls bio公司)、抗cd81(1:500，艾博抗公司)、抗tsg101(1:500，艾博抗公司)、抗钙连蛋白(1:1000，恩佐生命技术公司(enzo life technologies))、抗grp94(1:1000,genetex)和抗risc(1:1000，艾博抗公司)用作一抗。使用与辣根过氧化物酶偶联的抗igg抗体作为二抗。
[0065]
外泌体也可通过免疫亲和exo
‑
flow试剂盒(系统生物科学公司)纯化，用试剂盒提供的exo
‑
fitc或特异性单克隆抗体抗cd81 fitc(百进生技公司(biolegend))、抗cd63 fitc(圣克鲁斯公司(santa cruz))、抗cd9 pe(ebiosciences公司)、抗mica/b alexa fluor 488(英杰公司)和抗ulbp
‑
1apc(英杰公司)染色，并通过流式细胞仪进行分析。
[0066]
使用tgf
‑
β磁性luminex性能测定试剂盒(r&d systems公司)对tgf
‑
β同种型的表达进行定量。根据制造商的说明，将外泌体(1
×
108)用hcl激活、中和并在rd6
‑
50缓冲液中稀释，然后在bio
‑
plex200系统(伯乐公司(bio
‑
rad))上进行分析。
[0067]
肿瘤外泌体的标记：为了研究cd14 单核细胞和cd3 t细胞内化肿瘤外泌体的能力，根据制造商的说明，将囊泡用did(英杰公司)标记。简言之，将1
×
10
10
个外泌体重悬于pbs中，并在37℃下用5μm did染色30分钟。将did标记的外泌体与2
×
105个分离的pbmc一起孵育6、14、24、18小时，然后通过流式细胞术通过cd14 或cd3 pbmc设门来分析细胞。
[0068]
t细胞群的分离：对于体外实验，在获得知情同意后，由输血科(乌迪内大学医院(university hospital ofudine))在edta管中收集了健康供体的全血样品。
[0069]
人外周血单核细胞(pbmc)通过用ficoll hypaque密度梯度(密理博公司)以700
×
g离心20分钟来分离，并以1
×
106个细胞/ml重悬于补充有10％fbs、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素、1％hepes(均来自西格玛奥德里奇公司)的rpmi 1640完全培养基中。为了去除fbs中存在的外泌体级分，始终以100,000
×
g对血清进行4小时超速离心。
[0070]
根据制造商的说明，使用免疫磁珠(干细胞技术公司)通过阴性选择从pbmc纯化cd16 /cd56 nk和cd4 t细胞。通过特异性抗体染色和流式细胞术分析(facscalibur)评估纯化效率超过95％。
[0071]
cfse增殖测定：pbmc在37℃下用含0.1％牛血清白蛋白的pbs中的5μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse，英杰公司)标记10分钟，然后立即用冷培养基淬灭。为了确定外泌体对pbmc的免疫调节作用，将重悬于200μl培养基中的2
×
105个细胞与肿瘤细胞产生的5
×
109、5
×
108、5
×
107和5
×
106个外泌体预孵育24小时，然后接种到预结合0.5μg/ml抗cd3(克隆okt3，ebiosciences公司)和0.5μg/ml抗cd28(克隆cd28.6，ebiosciences公司)的96孔板中。3天后，将体外刺激的pbmc用抗cd3 apc、抗cd4 apc或抗cd8 apc(均来自ebiosciences公司)染色，并通过流式细胞术测试细胞增殖。
[0072]
treg细胞诱导：将分离的cd4 t淋巴细胞与5
×
108个外泌体一起孵育，并用上述浓度的抗cd3和抗cd28刺激。还添加了浓度为250u/ml的重组il2作为刺激。3天后，使用foxp3/转录因子染色缓冲液组(ebiosciences公司)通过cd25表面染色和foxp3细胞内染色确定foxp3 调节性t细胞在受刺激的cd4 细胞总群体中的百分比。
[0073]
nkg2d表达水平：将获得自健康供体的静息pbmc或纯化的nk细胞与5
×
108个外泌体一起或不与其一起共孵育24小时，然后用抗nkg2d apc和抗cd8 fitc或抗cd16 fitc/抗cd56 pe(全部来自ebiosciences公司)染色，并通过流式细胞仪进行测试。
[0074]
外泌体rna分离和rt
‑
pcr：为了保留小rna，添加cel
‑
mir39spike
‑
in作为外源对照(100pm)(赛默飞世尔科技公司)，使用mirvana paris试剂盒(生命技术公司)，从1
×
10
10
个外泌体提取总rna。将提取的rna保存在
‑
80直至使用。已用nanodrop
tm 1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)评估其数量和质量。
[0075]
除了cdna模板以1:2稀释而不是推荐的1:10稀释之外，根据制造商的说明，使用advanced mirna测定(赛默飞世尔科技公司)评估了mirna(has
‑
mir
‑
21
‑
5p、has
‑
mir
‑
155
‑
5p、和has
‑
mir
‑
34a
‑
5p)的相对浓度。
[0076]
实时反应在applied biosystems quantstudio 3系统上进行。使用相对标准曲线方法对mirna相对浓度进行归一化，该相对标准曲线方法是通过cel
‑
mir39的系列稀释(1nm
‑
100fm)获得的。
[0077]
验证由lps激活tlr4后肿瘤细胞释放的外泌体：用lps预处理肿瘤细胞，然后使用exoquick聚合物基方法从上清液中获得富外泌体的级分。
[0078]
如图6(a)中所示，外泌体和细胞裂解物表达了特异性外泌体标志物cd63、tsg101、cd81和cd9，而未观察到exoquick来源的上清液(将其用作阴性对照)的信号。为了评估外泌体制剂中的杂质，测定了与亚细胞区室相关的蛋白质的表达。推测这些蛋白质在外泌体中不存在或不足以表现出。钙连蛋白和grp94(内质网蛋白)的缺乏表明成功富集。通过与exo
‑
flow珠偶联的外泌体的流式细胞术分析进一步证实了外泌体标志物的表达。如图6(b)中所示，与外泌体结合的珠表达高水平的cd81、cd9和cd63，并与exofitc试剂反应。有趣的是，注意到cd9的表达谱突出了三个不同的外泌体亚群的存在，并且在用lps处理后其表达没有改变(图6(c))。
[0079]
用exocet试剂盒(图6(d))和纳米颗粒跟踪分析(nta)(图6(e))测量ache的活性，确定肿瘤细胞释放的外泌体的浓度。这些定量方法提供了不同的绝对值，这可能是由于各个分析所基于的原理不同。具体来说，nta分析报告的浓度比用exocet试剂盒测量的浓度高约100倍。然而，尽管观察到u87
‑
mg产生的外泌体的轻微非显著增加，但两种定量方法均显示lps的tlr4刺激的细胞激活不影响释放的外泌体的数量。有趣的是，报告未处理的mda
‑
mb
‑
231细胞释放的外泌体数量最多。
[0080]
如代表性nta分析的尺寸谱所报道(图6(f))，肿瘤外泌体被检测为纳米颗粒，其尺寸与生理外泌体所描述的尺寸相当(直径范围为50至120nm)。具体而言，sw480来源的外泌体的收集的囊泡的平均大小为113
±
21.1nm，sw620来源的外泌体的为81.5
±
19.7，mda
‑
mb
‑
231来源的外泌体的为86.4
±
15.1，且u87
‑
mg的为129
±
16.1。最后，外泌体的大小不受生产细胞的lps处理的影响(图6(g))。
[0081]
lps处理后释放的外泌体以剂量依赖性方式抑制t细胞增殖：为了确定肿瘤细胞上表达的tlr4的激活是否影响释放的外泌体的免疫调节特性，将分离自健康供体的cfse标记的pbmc用标量剂量(从5
×
106至5
×
109)的外泌体一起孵育24小时，然后用结合抗cd3和可溶性抗cd28的板刺激。只有lps处理后释放的外泌体(高达5
×
108)才以剂量依赖性方式显著抑制cd3 t细胞增殖。在所有其他情况下，只有最高剂量(5
×
109)的由未处理的细胞释放的外泌体才能抑制cd3 t细胞的增殖。在较低剂量下，未刺激的细胞释放的外泌体的抑制作用消失，而对t细胞增殖的刺激作用出现(图7(a)(b))。
[0082]
为了评估外泌体对不同t细胞亚型增殖的影响，将pbmc与5
×
108个外泌体一起孵
育，并标记cd4和cd8的表达。作为在实验中使用的外泌体的剂量，基于先前的结果，选择能够诱导对照和lps处理的外泌体之间的对t淋巴细胞增殖的不同影响的最小剂量。只有lps处理后释放的外泌体才能显著抑制cd4 (图7(d))和cd8 (图7(e))t细胞的增殖。
[0083]
tgfβ在外泌体表面上的表达及其对调节性t细胞扩增的影响：为了研究肿瘤细胞释放的外泌体对tlr4的lps激活的抑制作用的分子机制，在外泌体表面上检测了tgfβ，因为该细胞因子与免疫逃逸的机制密切相关，并且可能是研究中观察到的抗增殖作用的原因。通过多重测定法分析了三种不同的tgfβ同种型的表达，发现外泌体样品中仅tgfβ1和tgfβ2可测量，而tgfβ3不可测量(数据未显示)。具体而言，与其他细胞系相比，mda
‑
mb
‑
231释放的外泌体表面上tgfβ1的表达水平非常低(图8(a))。有趣的是，在tlr4被lps激活后，sw480、sw620和u87
‑
mg细胞释放的外泌体中tgfβ1的表达增加，而mda
‑
mb
‑
231来源的外泌体中没有观察到差异。细胞tlr4被lps激活不会影响外泌体表面上tgfβ2的表达(图8(b))。
[0084]
假设外泌体表面表达的tgfβ1也可以诱导cd4 cd25
‑
t细胞转化为表达foxp3的调节性t细胞。未处理的sw480和u87
‑
mg分泌的外泌体的刺激增加了pbmc群体中cd4 /cd25 /foxp3 细胞的百分比(图8(c
‑
d))，并且这种刺激作用在tlr4激活后细胞释放的外泌体的情况下统计学上更显著。有趣的是，只有sw620细胞在tlr4激活后产生的外泌体才能够诱导向调节性t细胞的转化。
[0085]
外泌体表面上的nkg2d配体的表达以及nk和cd8 t细胞上的nkg2d表达的调节：越来越多的证据表明，肿瘤细胞通过释放可溶性nkg2d配体逃逸免疫监视，这触发了nk细胞和cd8 t细胞上nkg2d受体的总体下调。通过facs分析评估与exo
‑
flow珠偶联的外泌体表面上mica/b和ulbp
‑
1(nkg2d配体)的表达。如facs分析的代表性图中所示，即使在低水平下，肿瘤外泌体仍表达mica/b(图9(a
‑
b))，而不表达ulpb
‑
1(图9(c))。有趣的是，仅在sw480和sw620释放的外泌体中，tlr4被lps激活后，mica/b的表达增加。此外，它们能够减少t淋巴细胞中nkg2d的表达。相比之下，从所有肿瘤细胞系释放的外泌体都会使纯化的nk细胞中nkg2d的表达略有降低，但在用lps激活tlr4后未观察到进一步的作用。(图9(e))。
[0086]
mir
‑
21、mir
‑
34a和mir
‑
155在肿瘤来源的外泌体中的表达：在不同的实体瘤的背景下，几种特定的mirna最近已成为免疫细胞功能的重要调节剂。其中，mir
‑
21、mir
‑
155和mir
‑
34a是免疫抑制的介质，因为它们促进免疫抑制因子的表达并调节t细胞分化。为了分析这些mirna的表达，从tlr4激活后细胞释放的肿瘤来源的外泌体中提取总rna。与来自未处理的细胞的外泌体相比，用lps预处理的sw480产生的外泌体中mirna
‑
21的表达显著更高(图10(a))。其他细胞系产生的外泌体中没有观察到差异。另一方面，仅在由u87
‑
mg产生的外泌体中发现了mir
‑
34a，且lps处理后mir
‑
34a的表达显著下降(图10(b))。最后，任何分析的细胞系产生的外泌体均未显示mirna
‑
155的表达(数据未显示)。
[0087]
数据表明，肿瘤细胞上tlr4的激活不影响释放的tex的数量或大小。相反，增加了它们的免疫抑制潜力。如文献中已经报道的，未处理的肿瘤细胞分泌的外泌体能够抑制t细胞增殖。然而，只有在高剂量处理时才会出现这种效果，而低剂量刺激t细胞的增殖。相反，tlr4激活后肿瘤细胞产生的外泌体总是具有免疫抑制作用，这表明该处理对tex负荷有影响。分子图谱表明，tex可表达介导免疫抑制或免疫刺激的双重能力，推测这取决于微环境。tlr4激活后释放的tex的免疫刺激特性可能是由于tex表面上存在肿瘤相关抗原(taa)和共刺激分子，它们刺激了免疫应答。据报道，热休克后淋巴瘤细胞产生的外泌体含有高水平的
hsp70，并据报道在自体和同种异体鼠模型中以mhc独立的方式刺激直接的th1极化免疫应答。
[0088]
从细胞表面释放后，外泌体具有与受体细胞的质膜融合以将其内容物递送到细胞质中的能力。可替代地，存在于其表面上的蛋白质可与靶细胞上的细胞表面受体结合并影响细胞内信号传导。尽管单核细胞快速摄入外泌体，但即使在共孵育48小时后，t细胞也不会使tex内化。与显示t淋巴细胞不内化外泌体(这和其他单核细胞不同)的其他研究一致，这一数据表明tex递送信号给存在于t细胞表面的受体。癌细胞产生的外泌体可通过其表面表达的tgf
‑
β1诱导调节性t细胞生长。数据表明，tlr4激活增加了tex表面上tgf
‑
β1的表达并促进了调节性t细胞的扩增，这又可能是导致tex对t细胞的报告的抗增殖作用的原因。与其他细胞系释放的外泌体相比，乳腺癌细胞系mda
‑
mb
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231分泌的外泌体即使在tlr4细胞激活后也能以非常低的水平表达tgf
‑
β1，并且不能诱导调节性t细胞。
[0089]
带有nkg2d配体的外泌体的产生是癌细胞免疫逃避的新近描述的机制。尽管tlr4激活仅增加了来源于大肠癌的外泌体其表达的mica/b表达，分析的所有细胞系释放的外泌体在其表面上表达mica/b(一种nkg2d配体)。因此，有可能假设大肠癌细胞对tlr4的激活更为敏感。实际上，已经广泛显示了tlr4的慢性激活与通过促进肿瘤逃逸的免疫抑制因子的释放实现的crc进展之间的相关性。
[0090]
越来越多的证据表明，癌细胞分泌的外泌体微rna可以被递送到局部微环境中的其他细胞，从而导致靶细胞转录组的重新编程并以旁分泌方式影响癌症生长、血管生成、转移和免疫功能。mir
‑
21和mir
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155是特征明确的oncomir，其通过靶向多种mrna来促进癌症生长和转移。相比之下，已显示mir
‑
34a通过诱导细胞凋亡、细胞周期停滞和衰老来抑制癌症生长和转移。在tlr4激活后，sw480来源的外泌体中mir
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21的表达增加。同样，已经证明存在于癌细胞分泌的外泌体中的mir
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21可以被转移到周围的免疫细胞中，并可以与toll样受体结合。通过与tlr结合，mir
‑
21诱导免疫细胞分泌细胞因子，导致促转移性炎性应答，最终可导致癌症的生长和转移。
[0091]
从本文提供的数据中应该理解，来源于先前已用促炎性(或其他激活/应激)刺激刺激的细胞的外泌体在炎性标志物和方法的调节(并且尤其是下调)中具有显著活性。因此，如上文已讨论的，预期这些外泌体特别适合于治疗各种炎性病症以及治疗与炎性病症相关的疼痛。
[0092]
如本文所使用的，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物的步骤，以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)。最优选地，经由皮下或真皮下注射施用细胞或外泌体。然而，在其他设想的方面，施用还可以是静脉内注射。可替代地或另外地，可以从患者的细胞中分离抗原呈递细胞或使其生长，在体外感染，并然后输送至患者。因此，应理解，可以将设想的系统和方法视为用于高度个性化癌症治疗的完整药物发现系统(例如，药物发现、治疗方案、验证等)。
[0093]
本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都将并入说明书中，就如同在本文中单独引用一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能
以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本披露的全部范围，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践要求保护的发明所必需的。
[0094]
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不背离本文所披露的概念的全部范围的情况下，除了已经描述的那些以外，还可以进行许多其他修改。因此，本披露主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求书提及选自由a、b、c
……
和n组成的组的某物的至少一种的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个要素，而不是a加n、或b加n等。

技术特征：
1.一种减少个体对阿片类镇痛需求的方法，该方法包括：对该个体施用组合物，该组合物包含来自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的外泌体。2.如权利要求1所述的方法，其中该个体被诊断为患有炎性病症或癌症，或其中该个体已接受手术。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中这些外泌体来自间充质干细胞。4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中这些外泌体来自肿瘤细胞。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些外泌体来自同一个体的干细胞或肿瘤细胞。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述炎性刺激选自由以下组成的组：ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和sting(干扰素基因刺激物)激活剂。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
‑
6、il
‑
8、il10或ccl
‑
2。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物被配制成用于注射。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物每剂量单位包含至少109个外泌体。11.一种治疗个体的炎性病症和相关疼痛的方法，该方法包括：对该个体施用组合物，该组合物包含来自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的外泌体。12.如权利要求11所述的方法，其中该个体被诊断为患有慢性炎性病症。13.如权利要求11至12中任一项所述的方法，其中该个体已接受癌症治疗或关节置换术。14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中这些外泌体来自间充质干细胞。15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中这些外泌体来自同一个体的干细胞。16.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述炎性刺激选自由以下组成的组：ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和sting(干扰素基因刺激物)激活剂。17.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达。18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
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6、il
‑
8、il10或ccl
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2。19.如权利要求11至18中任一项所述的方法，其中该组合物被配制成用于注射。20.如权利要求11至19中任一项所述的方法，其中该组合物每剂量单位包含至少109个外泌体。
21.一种制备药物组合物的方法，该方法包括：将个体的干细胞和/或肿瘤细胞在培养基中离体暴露于炎性刺激下；从该培养基收获外泌体；以及将收获的外泌体配制成适合注射或输注的药物组合物。22.如权利要求21所述的方法，其中这些干细胞是间充质干细胞，并且任选地是脂肪间充质干细胞。23.如权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述炎性刺激选自由以下组成的组：ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和sting(干扰素基因刺激物)激活剂。24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
‑
2,3
‑
二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达。25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
‑
6、il
‑
8、il10或ccl
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2。26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于炎性刺激下至少24小时。27.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其中使用超速离心步骤或聚合物沉淀步骤收获这些外泌体。28.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其中用抗体或其片段使用亲和分离步骤收获这些外泌体。29.如权利要求21至28中任一项所述的方法，其中该药物组合物每剂量单位包含至少109个收获的外泌体。30.如权利要求21至29中任一项所述的方法，该方法还包括将抗炎剂和/或镇痛药包括在该药物组合物中的步骤。31.一种药物组合物，其包含多个经刺激的干细胞来源的外泌体或经刺激的肿瘤细胞来源的外泌体，其中该组合物被配制成用于注射或输注。32.如权利要求31所述的药物组合物，其中该经刺激的干细胞来源的外泌体来自间充质干细胞。33.如权利要求31至32中任一项所述的药物组合物，其中相对于接受这些外泌体的个体，这些外泌体是自体外泌体。34.如权利要求31至33中任一项所述的药物组合物，其中该经刺激的干细胞或经刺激的肿瘤细胞是用炎性刺激刺激的。35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述炎性刺激选自由以下组成的组：ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和sting(干扰素基因刺激物)激活剂。36.如权利要求31至35中任一项所述的药物组合物，其中该组合物被配制成用于注射或输注。37.如权利要求31至36中任一项所述的药物组合物，其中该组合物每剂量单位包含至少109个外泌体。
38.如权利要求31至37中任一项所述的药物组合物，该药物组合物还包含抗炎剂和/或镇痛药。39.如权利要求38所述的药物组合物，其中该抗炎剂和/或镇痛药是nsaid(非甾体类镇痛药)。40.如权利要求38所述的药物组合物，其中该抗炎剂和/或镇痛药是抗炎细胞因子或趋化因子。41.来自先前已暴露于一种或多种炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞的外泌体，用于在医药中使用。42.如权利要求41所述的外泌体，其中这些外泌体的平均颗粒大小在约70nm至约130nm之间。43.如权利要求41至42中任一项所述的外泌体，其中这些外泌体来自间充质干细胞。44.如权利要求41至43中任一项所述的外泌体，其中这些外泌体来自肿瘤细胞。45.如权利要求41至44中任一项所述的外泌体，其中这些外泌体来自同一个体的干细胞或肿瘤细胞。46.如权利要求41至45中任一项所述的外泌体，其中所述炎性刺激选自由以下组成的组：ifnγ(干扰素γ)、tnfα(肿瘤坏死因子α)、tlr配体、nod配体和sting(干扰素基因刺激物)激活剂。47.如权利要求41至46中任一项所述的外泌体，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中ido(吲哚胺
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2,3
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二加氧酶)或pge2(前列腺素e2)的表达。48.如权利要求41至46中任一项所述的外泌体，其中将这些干细胞或肿瘤细胞暴露于所述炎性刺激，其量为增加这些干细胞或肿瘤细胞中的il
‑
6、il
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8、il10或ccl
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2。49.如权利要求41至48中任一项所述的外泌体，其中这些外泌体被配制成用于注射。50.如权利要求41至49中任一项所述的外泌体，其中用于在医药中使用是治疗炎性病症和/或治疗疼痛。
技术总结
提出了包含外泌体的组合物和方法，这些外泌体来自先前已暴露于炎性刺激的干细胞和/或肿瘤细胞。有利地，当对个体施用时，此类外泌体表现出抗炎和镇痛作用。因此，优选使用此类外泌体将减少对阿片类镇痛药的需求，并减少疼痛和炎症。和炎症。和炎症。


技术研发人员：P
受保护的技术使用者：南特生物公司
技术研发日：2019.10.17
技术公布日：2021/6/29