一种白色芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于农业微生物技术和环境保护领域，涉及一株白色芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.氧化亚氮(n2o)，是一种温室气体，可输送到平流层，导致臭氧层破坏，引起臭氧空洞，且由于它在大气中停留时间较长，同时氧化亚氮百年尺度上单分子的增温潜势(gwp)是co2的265倍(ipcc，2013)，对全球气候变化的贡献约占全部温室气体总贡献的5
‑
6％，目前已经引起了全球范围内的重视。
3.农业土壤是氧化亚氮重要的排放源，占全球氧化亚氮排放总量的25
‑
39％，且这个比例仍在逐年生长。农业生产中氮肥的大量投入是大气中氧化亚氮的浓度增长的重要原因之一。农减排农田土壤氧化亚氮的方法主要有施肥管理(含施肥时间与方式、施肥量、肥料类型等)、使用硝化抑制剂、科学耕作、添加生物质炭、接种具有氧化亚氮减排效应的微生物等。其中，通过添加微生物菌剂相比其它方法进行氧化亚氮减排，更加经济、易于操作。
4.目前可用于土壤氧化亚氮减排的微生物菌株较少，大多采用氧化亚氮还原菌，其作用单一，仅能实现氧化亚氮减排的作用。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中具有土壤氧化亚氮减排功效的微生物菌株品种单一，且对农田土壤作用单一的缺陷，本发明提供了一种白色芽孢杆菌(bacillus albus)lv5a，能有效实现氧化亚氮减排、同时提高作物产量。
6.本发明从水稻根际土中分离得到一株微生物菌株，该菌株具有氧化亚氮减排效果，在高盐、碱性环境下具有较强的适应能力，同时可以促进作物的生长。该微生物菌株经生化鉴定为白色芽孢杆菌(bacillus albus)lv5a。其生化鉴定结果见表1。
7.本发明还提供了上述白色芽孢杆菌在减少农田温室气体氧化亚氮排放中的应用，以及在改良土壤微生物群落结构中的应用。
8.以上农田或土壤为水稻或玉米的农田、土壤。
9.本发明的另一方面是提供该白色芽孢杆菌在制备微生物菌剂中的应用。
10.具体的，上述微生物菌剂通过以下方法制备：将所述白色芽孢杆菌接入ph为7.2
‑
7.5的发酵培养基中，26
±
1℃培养，至活菌数达到2亿/毫升或2亿/克以上，即得所述微生物菌剂。
11.其中，发酵培养基包含蛋白胨5.0克/升、牛肉浸粉3.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；或包含胰蛋白胨10.0克/升、酵母浸粉5.0克/升、氯化钠10.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；或包含胰蛋白胨10.0克/升、麦芽糖5.0克/升、氯化钠10.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；或包含大豆蛋白胨10.0克/升、蔗糖10.0克/升、氯化钠5.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水。
12.本发明还提供了该白色芽孢杆菌在制备生物有机肥中的应用。
13.具体的，生物有机肥采用上述微生物菌剂接种至有机肥制备得到；其中，微生物菌剂的接种比例为每克有机肥接种1毫升微生物菌剂。
14.本发明的有益效果是：所分离得到的白色芽孢杆菌氧化亚氮减排效果强，且在胁迫环境中具有更强的适应能力，同时可以有效促进作用的生长，可广泛应用于水稻、玉米等农田土壤。
15.本发明的菌种保藏日期为2021年1月13日，保藏编号为cgmcc no.21616。分类命名为：白色芽孢杆菌(bacillus albus)lv5a。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国科学院微生物研究所，邮编100101。
附图说明
16.图1为白色芽孢杆菌lv5a的表型特征；
17.图中，a为平板上形态特征，b为液体培养的发酵液状态；
18.图2为白色芽孢杆菌lv5a的生理生化特征；
19.图3为白色芽孢杆菌lv5a在不同ph下的生长情况表征；
20.图4为其他菌株在不同ph下的生长情况表征；
21.图5为白色芽孢杆菌lv5a在不同盐度下的生长情况表征；
22.图6为其他菌株在不同盐度下的生长情况表征；
23.图7为白色芽孢杆菌lv5a与有机肥混合时(不加入土壤)对氧化亚氮累积排放通量的影响；
24.图8为微宇宙条件下，白色芽孢杆菌lv5a对水稻土壤氧化亚氮累计排放量的影响；
25.图9为微宇宙条件下，白色芽孢杆菌lv5a对玉米土壤氧化亚氮累计排放量的影响；
26.图10为微宇宙条件下，白色芽孢杆菌lv5a在高盐环境下氧化亚氮累计排放量的影响。
具体实施方式
27.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
28.实施例1白色芽孢杆菌lv5a的分离与筛选
29.称取10g水稻根际土(本实施例于2018年8月从江苏省宜兴市大铺镇水稻根际土中采样)，转移至在超净工作台中进行操作。将土样放入装有90ml 0.87％nacl溶液的锥形瓶中，于28℃、200r/min振荡1h，制备成稀释度为10
‑1的土壤悬液；取10
‑1的土壤悬液10ml，放入装有90ml 0.87％nacl溶液的锥形瓶中，混合均匀，配成稀释度为10
‑2的土壤悬液；以此类推。分别配成稀释度为10
‑3、10
‑4、10
‑5的土壤悬液。然后用移液器分别移取10
‑3、10
‑4、10
‑5的稀释液100μl涂布于固氮固体培养基(每升含kh2po4，0.2g；k2hpo4，0.8g；mgso4·
7h2o，0.2g；caso4·
2h2o，0.1g；fecl3，微量；na2mo4·
2h2o，微量；酵母提取物，0.5g；甘露醇，20g，琼脂，15g；ph7.2，溶剂为水)上，每个梯度三个重复。在28℃恒温生化培养箱中倒置培养2～4d，每天观察其生长情况。出现单菌落后，在超净工作台中，用接种环挑取比较大的菌落接种到1/100nbns(蛋白胨5g
·
l
‑1，牛肉浸粉3g
·
l
‑1，0.3mm nano3和4mm琥珀酸钠，ph7.2
‑
7.5，溶剂为
水)培养基平板上进行纯化，纯化5～6代后，用30％的甘油保藏在
‑
80℃中，待用。
30.实施例2白色芽孢杆菌lv5a的鉴定
31.在nbns琼脂培养基上培养呈淡黄色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，边缘不规则，在多种培养基上均不产色素；液体培养静止时有菌膜形成，见图1。革兰氏染色呈阳性，杆状，可形成内生芽孢，呈椭圆形，两端钝圆，芽孢囊不膨大，中生到次端生，有运动性；水解淀粉和明胶，乙酰甲基甲醇(v
‑
p)试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，苯丙氨酸脱氨酶试验、吲哚试验、甲基红(mr)试验、硫化氢试验均为阴性。
32.通过16s rdna序列分析(见核苷酸序列seq id no：1)，经ncbi中blast比对后与白色芽孢杆菌同源；生理生化特征见表1和图2。
33.表1白色芽孢杆菌lv5a的生理生化性质
34.[0035][0036]
实施例3在不同的ph下，白色芽孢杆菌lv5a的生长能力分析
[0037]
将100微升调好od值的白色芽孢杆菌lv5a菌液接种到ph分别为4、6、8和10的10ml nbns液体培养基中(体积比约为1:100)，26℃,160r/m下摇床振荡培养12、24和36小时，以不添加菌株的nbns液体培养基作对照，通过测定od600值绘制菌株生长曲线。每组试验设置三组重复，结果如图3所示。
[0038]
我们与其他菌株(pseudomonas stutzeri施氏假单胞菌nrcb010、achromobacter denitrificans反硝化无色杆菌的nrcb029和nrcb028)进行对比，结果发现白色芽孢杆菌lv5a在最适宜在中性环境下生存，但在碱性环境下也具有良好的生存能力，在碱性环境下
具有较好的耐受能力，结合图3、图4所示。
[0039]
实施例4在不同的盐度下，白色芽孢杆菌lv5a的生长能力分析
[0040]
将100微升调好od值的白色芽孢杆菌lv5a菌液接种到盐度分别为0％，4％，8％和10％的10ml nbns液体培养基中(体积比约为1:100)，26℃,160r/m下摇床振荡培养12、24和36小时，以不添加菌株的nbns液体培养基作对照，通过测定od600值绘制菌株生长曲线。每组试验设置三组重复，结果如图5所示。
[0041]
我们与其他菌株(bacillus amyloliquefaciens解淀粉芽孢杆菌nrcb006、bacillus subtilis枯草芽孢杆菌的lv6和nrcb002)进行对比，从试验结果发现白色芽孢杆菌lv5a更适合在高盐环境下生存：相比其他菌株白色芽孢杆菌lv5a在盐度为8％和10％时生长能力远远优于其他菌株，结合图5、图6所示。
[0042]
实施例5白色芽孢杆菌lv5a与有机肥混合时(不加入土壤)对氧化亚氮的减排效果分析
[0043]
菌悬液制备：挑取白色芽孢杆菌单菌落，接种到nbns(蛋白胨5g
·
l
‑1，牛肉浸膏3g
·
l
‑1，0.3mm nano3和4mm琥珀酸钠，ph 7.2
‑
7.5，溶剂为水)培养基中，置于28℃摇床中160rpm培养24小时以上。用nbns液体培养基调od600＝1.0。将20g含氮量7％的有机肥(本实施例中有机肥选用南京明珠肥料有限责任公司所生产的“地得益”牌商品有机肥料)与20mlod值为1的白色芽孢杆菌lv5a菌液放入培养瓶中。保持有机肥处于淹水状态。将有机肥
‑
菌液混合物置于玻璃瓶(500ml)中，该玻璃瓶用具有若干小孔的塑料盖覆盖，然后在26℃下培养。为了测量氧化亚氮通量，通过硅隔膜的塑料盖封闭瓶盖后1小时，再使用玻璃注射器从瓶子中取样1.0ml顶空气体，然后进行气相色谱电子捕获检测器(ecd
‑
gc)分析。与不接种菌液的无菌nbns液体培养基(ck1组)进行对照比较。结果见图7。白色芽孢杆菌lv5a与有机肥混合时(不加入土壤)对氧化亚氮的减排效果。由图7可见，接种白色芽孢杆菌lv5a(lv5a组)显著降低有机肥氧化亚氮的累计排放量；与对照相比，减少有机肥氧化亚氮的累计排放量33％以上。
[0044]
实施例6在微宇宙条件下，白色芽孢杆菌lv5a减少土壤氧化亚氮的排放分析
[0045]
供试土壤：采集江苏宜兴蔬菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，待用。江苏宜兴蔬菜地表层土壤性质如下：ph：7.69；电导率：140.5μs/cm；tc：37.98mg/g(每克风干土)；tn：0.87mg/g(每克风干土)；c/n：46.72。菌悬液制备：挑取白色芽孢杆菌单菌落，接种到nbns(蛋白胨5gl
‑1，牛肉浸膏3gl
‑1，0.3mm nano3和4mm琥珀酸钠，ph 7.2
‑
7.5，溶剂为水)培养液中，置于28℃摇床中160rpm培养24小时以上。用nbns液体培养基调od600＝1.0。微宇宙接种试验：称取100g风干土到500ml培养瓶中，加入5ml菌液与5g有机肥的混合物，充分混匀(lv5a组)；对照2加入等量的nbns液体培养基与5g有机肥的混合物(nbns组)；添加适量的无菌水，保证土壤水分达到最大田间持水量的80％；最后置于26℃暗培养。氧化亚氮采集：采用密封培养采气法，密闭1小时，采集培养瓶顶部的气体样品，利用含ecd检测器的气相色谱分析氧化亚氮的浓度，计算氧化亚氮排放通量和累积排放量。结果见图8。为微宇宙条件下，白色芽孢杆菌lv5a对水稻土壤氧化亚氮排放通量的影响。由图8可见，接种白色芽孢杆菌lv5a(lv5a组)显著降低水稻土土壤氧化亚氮的累计排放量；与对照(nbns组)相比，减少旱地土壤氧化亚氮的累计排放量接近50％。
[0046]
实施例7在微宇宙条件下，白色芽孢杆菌lv5a减少玉米土壤氧化亚氮的排放分析
[0047]
供试土壤：采集山东德州华北平原表层土壤，自然风干，过2mm筛，待用。山东德州玉米土壤性质如下：ph：7.33；电导率：163.35μs/cm；tc：0.026g(每克风干土)；tn：0.00087g(每克风干土)；c/n：30.54。菌液制备、微宇宙接种试验和氧化亚氮采集同实施例6。如图9所示，结果表明，接种白色芽孢杆菌lv5a(lv5a组)显著降低玉米土壤氧化亚氮的累计排放量；与对照(nbns组)相比，减少玉米土壤氧化亚氮的累计排放量16.5％。
[0048]
实施例8胁迫环境下，白色芽孢杆菌lv5a减少土壤氧化亚氮的排放分析
[0049]
采集江苏宜兴8年棚龄塑料大棚表层土壤作为供试设施栽培次生盐渍化土壤，土壤类型为沙质土，硝态氮含量为0.82g/kg，自然风干，过2mm筛，待用。菌悬液制备同实施例1。盆栽试验：称取1kg风干土到培养盆中，浇入20ml菌悬液；对照浇入等量的1/100nbns；正常水肥管理，利用含ecd检测器的气相色谱分析氧化亚氮的浓度，计算氧化亚氮排放通量和累积排放量。如图10所示，结果表明，接种白色芽孢杆菌lv5a后，土壤中硝酸盐含量降低24％，土壤ec值降低18.4％，同时，与对照相比，接种白色芽孢杆菌lv5a后与对照(nbns组)相比，减少土壤氧化亚氮的累计排放量可达70％。
[0050]
实施例9在田间试验中白色芽孢杆菌lv5a减少水稻土氧化亚氮的排放和促进水稻生长的分析
[0051]
供试土壤：南京六合水稻土。试验地每个小区大小为4
×
5m、梗宽0.6m、保护行宽2.5m、渠宽1m。基肥：分别施入白色芽孢杆菌lv5a的生物有机肥2kg(lv5a组，菌液、菌液及有机肥的混合同实施例6)和0.35kg的尿素(对照组)；分蘖肥：施入0.33kg的尿素；拔节孕穗肥：施入0.11kg的尿素。稻季收获时加入白色芽孢杆菌lv5a(lv5a组)的小区产量为8860.28(kg
·
ha
‑1)，高于同等施氮量的对照组约10％。
[0052]
本发明提供了一株白色芽孢杆菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一种白色芽孢杆菌(bacillus albus)lv5a，其保藏编号为cgmcc no.21616。2.一种根据权利要求1所述白色芽孢杆菌在制备微生物菌剂中的应用。3.一种根据权利要求1所述白色芽孢杆菌在制备生物有机肥中的应用。4.一种根据权利要求1所述白色芽孢杆菌在减少农田温室气体氧化亚氮排放中的应用。5.一种根据权利要求1所述白色芽孢杆菌在改良土壤微生物群落结构中的应用。6.一种微生物菌剂，含有权利要求1所述的白色芽孢杆菌，其特征在于，所述微生物菌剂通过以下方法制备：将所述白色芽孢杆菌接入ph为7.2
‑
7.5的发酵培养基中，26
±
1℃培养，至活菌数达到2亿/毫升或2亿/克以上，即得所述微生物菌剂。7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述发酵培养基包含蛋白胨5.0克/升、牛肉浸粉3.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；或包含胰蛋白胨10.0克/升、酵母浸粉5.0克/升、氯化钠10.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；或包含胰蛋白胨10.0克/升、麦芽糖5.0克/升、氯化钠10.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；或包含大豆蛋白胨10.0克/升、蔗糖10.0克/升、氯化钠5.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水。8.一种生物有机肥，含有权利要求6或7所述微生物菌剂，其特征在于，所述生物有机肥采用所述微生物菌剂接种至有机肥制备得到；所述微生物菌剂的接种比例为每克有机肥接种1毫升微生物菌剂。
技术总结
本发明公开了一种白色芽孢杆菌及其应用。该白色芽孢杆菌(Bacillus albus) Lv5A，其保藏编号为CGMCC NO.21616。本发明分离得到的白色芽孢杆菌氧化亚氮减排效果强，且在胁迫环境中具有更强的适应能力，同时可以有效促进作用的生长，可广泛应用于水稻、玉米等农田土壤。玉米等农田土壤。玉米等农田土壤。


技术研发人员：申卫收 于心纯 高南 杨思琪
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：2021.03.01
技术公布日：2021/6/29