一种重组凝血因子VIII及其应用的制作方法

专利2022-05-09 55

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组凝血因子viii及其应用。

背景技术：

a型血友病(hemophiliaa，ha)又名遗传性抗血友病球蛋白缺乏症或fⅷ缺乏症，是一种是由凝血因子viii的基因(fⅷ基因或f8基因)的遗传缺陷引起的凝血障碍。目前对ha的治疗主要为基于血浆源性凝血因子或外源培养的重组蛋白的蛋白置换疗法(proteinreplacementtherapy，rpt)，但prt存在半衰期短、成本高及治疗周期长等局限性。

基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。目前，基因治疗被认为是最有前景的ha治疗方法。

有研究对人类f8基因的分析显示其表达蛋白具有明显的结构域，表示为a1-a2-b-a3-c1-c2，b结构域由非常大的外显子编码，含有由连接寡糖的天门冬酰胺(n)组成的高度保守区。miao等人指出，b结构域的部分缺失，保留n端226-氨基酸延伸，其中包含六个完整的天门冬酰胺连接的糖基化位点，能够使f8的体外分泌增加10倍(参见miao,h.z.,sirachainan,n.,palmer,l.,kucab,p.,cunningham,m.a.etal.bioengineeringofcoagulationfactorviiiforimprovedsecretion.blood,2004,103(9),3412-3419.)。但目前利用b结构域缺失的f8基因(f8-bdd)进行基因治疗的方法存在蛋白分泌和功能较低、f8病毒载体转染效率低以及产生抗体和抑制物反应(免疫排斥)等问题。

综上所述，提供一种重组凝血因子viii，具备高效的凝血功能，且体内抗体反应低，对于ha基因治疗领域具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种重组凝血因子viii及其应用，所述重组凝血因子viii富含糖基化位点，具备高效的凝血功能且易于分泌到胞外，能够高效纠正a型血友病，且抗体反应低。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种重组凝血因子viii，所述重组凝血因子viii的b结构域包括80％以上的seqidno.1或seqidno.2所示的氨基酸序列。

本发明的重组凝血因子viii中富含糖基化位点序列，具备高效的凝血功能且易于分泌到胞外，易于与辅助因子如凝血酶(fiia)等相互作用，此外，抗体反应低，能够有效保障治疗效果，降低免疫排斥风险，节约治疗成本。

seqidno.1：

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seqidno.2：

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第二方面，本发明提供一种重组凝血因子viii的编码基因，所述重组凝血因子viii的编码基因包括seqidno:3或seqidno:4所示的核酸序列。

seqidno:3：

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seqidno:4：

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优选地，所述重组凝血因子viii的编码基因包括seqidno:5或seqidno:6所示的核酸序列。

seqidno:5：

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seqidno:6：

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本发明的重组凝血因子viii的编码基因中富含糖基化位点序列，所表达的凝血因子viii(f8蛋白)具备高效的凝血功能且易于分泌到胞外，易于与辅助因子如凝血酶(fiia)等相互作用，此外，抗体反应低，能够有效保障治疗效果，降低免疫排斥风险，节约治疗成本。

第三方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因。

优选地，所述重组表达载体包括含有第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因的病毒载体或质粒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体pegwi。

优选地，所述慢病毒载体pegwi的5’剪接供体位点gt突变为ca；

优选地，所述慢病毒载体pegwi的u3区中的增强子缺失；

优选地，所述慢病毒载体pegwi的u3区中含有静默子。

优选地，所述重组表达载体中包括ef1α启动子。

本发明中，对慢病毒载体pegwi进行改造，将野生型5’剪接供体位点gt突变为ca，将u3区中的增强子删除，并在u3区中加入静默子(ch4silencer)，不仅能够有效提高pegwi的转染效率和表达效率，从而降低载体使用成本，还能提高安全性。

第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因。

优选地，所述重组慢病毒的制备方法包括：

使用包装质粒对第三方面所述的慢病毒载体进行包装，得到所述重组慢病毒。

优选地，所述包装质粒包括pnhp和phef-vsv-g。

优选地，所述重组慢病毒的制备方法包括以下步骤：

(1)将第三方面所述的慢病毒载体与包装辅助质粒pnhp和phef-vsv-g共转染哺乳细胞hek293t中培养24～72h；

(2)进行纯化和浓缩，得到所述重组慢病毒。

第五方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因。

优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因。

优选地，所述重组细胞含有第三方面所述的重组表达载体。

第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的重组细胞的制备方法，所述方法包括：

将第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因、第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的重组慢病毒导入宿主细胞中，获得所述重组细胞。

优选地，所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或直接基因注射中的任意一种。

优选地，所述宿主细胞包括造血干细胞。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的重组凝血因子viii、第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供第一方面所述的重组凝血因子viii、第二方面所述的重组凝血因子viii的编码基因、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的重组细胞或第七方面所述的药物组合物在制备治疗血友病药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的重组凝血因子viii经过基因改造，富含糖基化位点，具备高效的凝血功能且易于分泌到胞外，易于与辅助因子如凝血酶(fiia)等相互作用，此外，抗体反应低，能够有效保障治疗效果，降低免疫排斥风险，节约治疗成本；

(2)本发明中，对慢病毒载体pegwi进行改造，不仅能够有效提高pegwi的转染效率和表达效率，从而降低载体使用成本，而且能提高安全性；

(3)本发明中，利用所述重组凝血因子viii的编码基因和慢病毒载体构建表达载体，能够成功在a型血友病小鼠体内表达，能一定程度地纠正a型血友病小鼠的出血表型，且抗体反应低，对于保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的a型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。

附图说明

图1为慢病毒载体pegwi的结构示意图；

图2a为正常f8-bdd基因结构图；

图2b为f8-bdd-n8基因结构图；

图2c为f8-bdd-299基因结构图；

图2d为重组慢病毒载体结构图；

图3为重组慢病毒载体拷贝数；

图4为分析重组慢病毒转染细胞的蛋白质表达量的流程示意图；

图5为重组慢病毒转染细胞的蛋白质表达量结果图；

图6为体外血浆aptt法检测结果图；

图7为体外血浆底物发光法检测结果图；

图8为糖基化抑制剂处理的凝血因子viii的westernblot结果图；

图9为体外凝血因子viii活性图；

图10为治疗a型血友病小鼠的治疗流程示意图；

图11为小鼠体内凝血因子viii活性图；

图12为小鼠血浆aptt法检测结果图；

图13为小鼠血浆酶联免疫吸附检测结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种慢病毒载体的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)慢病毒载体pegwi的结构示意图如图1所示，将野生型5’剪接供体位点gt突变为ca，将u3中的增强子删除，在u3中加入静默子(ch4silencer)，具体的改造方法可参见“contributionsofviralsplicesitesandcis-regulatoryelementstolentivirusvectorfunction,cuietal.journalofvirology,july1999,p.6171–6176”；

(2)启动子以及f8-bdd，f8-bdd-n8或f8-bdd-299基因的插入：

通过全基因，与选出可能的糖基化位点序列，进行化学合成正常f8-bdd(序列如seqidno.7所示)、f8-bdd-n8(序列如seqidno.5所示)、f8-bdd-299(序列如seqidno.6所示)基因序列，以及加入人类ef1α启动子序列；正常f8-bdd基因结构图如图2a所示，f8-bdd-n8和f8-bdd-299分别插入了糖基化位点相关序列，基因结构如图2b和2c所示，将其经限制性酶切位点连接入慢病毒载体pegwi中，通过测序及双酶切(最佳反应条件参照neb原厂建议)，5’端用bamhi克隆位点(ggatccacc)–aug，3’端用spei克隆位点(actagt)，对所获产物进行鉴定以获得正确连接的hef1α启动下携带正常f8-bdd，f8-bdd-n8或f8-bdd-299基因的慢病毒载体，具体的连接位置以及慢病毒载体构成如图2d所示。

seqidno.7：

atgcagatcgaactgagcacctgcttcttcctgtgtctcctgagattctgctttagtgctaccagacggtattacctgggagccgtcgagctgagttgggattacatgcagtccgacctcggagaactgcctgtggatgcacgctttccaccaagagtgcctaagtcattcccattcaacacctcagtcgtgtataagaagactctgttcgtcgagtttactgatcacctgttcaatatcgctaaacctagaccaccctggatgggactgctgggtcctacaatccaggcagaggtctatgacactgtggtgattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttttctcagaatcctcctgtcctcaaacgccatcaacgggagattacacggaccacactccaaagcgatcaggaggagatcgactatgacgataccatatctgtggaaatgaagaaagaggacttcgacatctacgacgaagatgagaaccaaagtccaagatccttccagaagaagactaggcactacttcatcgctgccgtggaacgcctctgggattacggaatgtccagttctccacatgtcctcaggaatagggcacagtctggctctgttccacagtttaagaaagttgtctttcaggagttcacagatggctcattcactcaaccactgtatagaggcgaactgaatgagcacctgggactgctgggtccctacatcagagccgaagtggaggataacattatggtcacctttcggaaccaagcctccaggccatacagtttctacagttctctgatctcatacgaggaagatcagaggcaaggagcagaaccaaggaagaacttcgtgaaaccaaacgagacaaagacctatttctggaaagttcagcatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga。

实施例2

本实施例将实施例1构建得到的慢病毒载体进一步包装、纯化和浓缩，得到所述重组慢病毒，实验方法参考([1]changlj,urlacherv,iwakumat,etal.efficacyandsafetyanalysesofarecombinanthumanimmunodeficiencyvirustype1derivedvectorsystem[j].genetherapy,1999,6(5):715-728.[2]changlj,zaissak.chang,ljandzaiss,ak.lentiviralvectors.preparationanduse.methodsmolmed69:303-318[j].methodsinmolecularmedicine,2002,69:303-318.)

具体步骤可以参考上列文献，并简单描述如下：

(1)将实施例1中构建的慢病毒载体与包装辅助质粒pnhp和phef-vsv-g共转染哺乳细胞hek293t中培养48h，收取上清液病毒载体；

(2)将培养收取得到的慢病毒进行纯化和浓缩，得到所述重组慢病毒；

(3)检测慢病毒载体拷贝数(vcn)，检测结果如图3所示，运用相同的感染复数，lv-f8-bdd，lv-f8-bdd-n8和lv-f8-bdd-299慢病毒的拷贝数基本相同。

实施例3

本实施例对实施例2制备的重组慢病毒进行体外(invitro)测试。

将实施例2制备的携带正常f8-bdd、f8-bdd-n8或f8-bdd-299基因的3种慢病毒(lv-f8-bdd，lv-f8-bdd-n8和lv-f8-bdd-299)分别转染ea-hy926内皮细胞，慢病毒转染方法包括：

在六孔板(美国康宁)中加入含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基，每孔接种4×10⁴个ea-hy926细胞，于37℃、5％co2条件下培养18h，以moi＝50进行慢病毒转染，并补充聚凝胺(polybrene，8μg/ml，sigma-aldrich)至培养基终体积为600μl，转染24h，随后每天置换新鲜培养基，待细胞汇合度(confluence)达到90％，将细胞转至t75cm²培养瓶(美国康宁)。

进行蛋白质表达量检测，以明确f8-bdd，f8-bdd-n8和f8-bdd-299基因在细胞中的表达情况，具体过程如图4所示，收集转染后ea-hy926分泌的上清液，进行浓缩，同时收集胞内萃取物，采用westernblot法检测蛋白质表达量，未经慢病毒转染的细胞作为阴性对照(nc)，gapdh为内参，结果如图5所示，其中l为细胞萃取物检测结果，s为细胞培养上清液检测结果，由图5可知，未经慢病毒转染的细胞中，存在少量凝血因子viii(f8蛋白)的表达(低活性，43kda)，而经携带正常f8-bdd，f8-bdd-n8或f8-bdd-299基因慢病毒转染后细胞中，可见明显较大量的f8-bdd、f8-bdd-n8或f8-bdd-299表达，且相较于f8-bdd，转染f8-bdd-n8和f8-bdd-299的细胞的上清液中均可获得更完整的f8蛋白(110～200kda)，表明本发明经遗传改造后的f8-bdd基因f8-bdd-n8和f8-bdd-299所表达的凝血因子viii更易分泌到胞外，从而保证有效发挥凝血效果。

评估凝血功能主要有两种方法，一种为活化部分凝血活酶时间(aptt)测试法，另一种为底物发光测定法。aptt(德国siemenshealthcarediagnosticsproductsgmbh公司)测试方法为在37℃条件下，在50μl受检血浆中加入50μl细胞上清液，再加入100μlaptt中的actin试剂(xii因子激活剂和脑磷脂)，充分混匀，7℃孵育3分钟，最后加入100μl钙离子(cacl2)，观察血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间。

底物发光测定法是一种使用f8chromogenicassay试剂盒进行活性测定的方法(法国hyphenbiomed公司)。底物发光测试方法为，首先将待测试血浆和空白对照组使用tris-bsa缓冲液(r4 )稀释40倍后取50μl加入微孔板，然后分别加入x因子(r1)，活化的ix因子混合物(r2)和sxa-11底物(r3)各50μl，37℃孵育5分钟，加入50μl20％乙酸停止反应，在吸光度405nm处读取吸光值。

从-80℃取出上述收集好的病毒转染ea-hy926细胞的上清液，放于冰上融化，分别将各上清液与f8缺陷者血浆混合，以f8缺陷者血浆作为阴性对照(nc)，以健康志愿者血浆为阳性对照(pc)，采用aptt法和底物发光法进行检测。

图6为aptt法检测的结果，与阴性对照相比，转染f8-bdd细胞的上清液、转染f8-bdd-n8细胞的上清液和转染f8-bdd-299细胞的上清液均有明显的凝血活性效果，血浆凝固时间明显缩短，其中转染f8-bdd-299细胞的上清液效果最佳，凝血时间为94.3秒，与阳性对照(57.5秒)相比，有一定的统计学差异(p<0.05)，转染f8-bdd-n8细胞的上清液的凝血时间为113.7秒，与f8-bdd-299和阳性对照相比，也有一定的统计学差异(p均<0.05)，转染f8-bdd细胞的上清液的凝血时间为156.7秒，与f8-bdd-n8、f8-bdd-299和阳性对照相比，均有较大的统计学差异(p均<0.001)，表明本发明改造的f8-bdd基因f8-bdd-n8和f8-bdd-299所表达的凝血因子viii具备高效的凝血作用。

图7为底物发光法的检测结果，使用f8chromogenicassay试剂盒获得活性，再通过elisa的凝血因子viii定量，得到单位活性，f8-bdd-299表达的凝血因子viii的单位活性是f8-bdd表达的凝血因子viii的100倍，是f8-bdd-n8表达的凝血因子viii的2.8倍。

综上所述，本发明利用改造的f8-bdd基因f8-bdd-n8和f8-bdd-299分别构建慢病毒载体并在细胞中成功表达，f8-bdd-n8和f8-bdd-299所表达的凝血因子viii更易分泌到胞外，且具备高效的凝血作用。

实施例4

本实施例检测凝血因子viii的n-糖基化。

使用糖基化抑制剂—神经氨酸苷酶(n)和肽-n-糖苷酶f(g)分别处理f8-bdd、f8-bdd-n8和f8-bdd-299转导的内皮细胞的上清液，糖基化抑制剂可以诱导去糖基化并降低分子量，westernblot结果如图8所示，其中“ ”表示使用相应酶处理，“-”表示未使用相应酶处理，糖基化抑制剂处理后，如箭头所示为去糖基化后蛋白分子量降低的蛋白条带，f8-bdd-n8和f8-bdd-299表达的凝血因子viii的分子量明显减少( 泳道对比–泳道)，但f8-bdd表达的凝血因子viii的分子量却没有减少，表明本发明对f8-bdd基因改造后能够有效引入糖基化位点。

凝血酶(fiia)是凝血因子viii的重要辅助因子，使用fiia处理转导内皮细胞的上清液，以研究b结构域修饰是否也影响与促凝辅因子的相互作用，凝血酶的添加增强了f8的激活，并产生更多与凝血因子viiia2区相关的蛋白(分子量43kda)。加入凝血酶后，每隔2分钟进行一次活性检测(如上描述底物发光测定法)，结果如图9所示，从第2分钟开始，f8-bdd-299表达的凝血因子viii的活性大幅度增加，而f8-bdd和f8-bdd-n8的活性增加较平缓。

实施例5

将实施例2制备得到的携带f8-bdd，f8-bdd-n8或f8-bdd-299的3种慢病毒(lv-f8-bdd，lv-f8-bdd-n8和lv-f8-bdd-299)转染小鼠造血干细胞，治疗a型血友病小鼠的治疗流程示意图如图10所示，所使用a型血友病小鼠为敲除f8基因的c57bl/6雌性小鼠(6周龄，购买于北京百奥赛博生物科技有限公司)，所有小鼠均被安置在无病原体的环境中，使用x射线照射柜(faxitron,tucson，az，usa)对小鼠进行照射(9.5gy/只)，从血友病小鼠的胫骨和股骨收集骨髓细胞，并分离其中的造血干细胞，分别以lv-f8-bdd，lv-f8-bdd-n8和lv-f8-bdd-299慢病毒转染，获得携带f8-bdd、f8-bdd-n8或f8-bdd-299基因的干细胞，将转染后的干细胞，以静脉注射的方式回输入a型血友病小鼠体内进行疾病治疗。

分别在同种异体骨髓移植的第15、30、45和60天时，抽取小鼠的血液，从中分离出血浆，分别以未经处理的血友病小鼠(mock)和野生型小鼠(wt)为对照用底物发光两步法测定血浆凝血因子viii活性，结果如图11所示，f8-bdd-299表达的凝血因子viii活性从第15天的5％，增加到第60天的8％，持续增长；而f8-bdd和f8-bdd-n8表达的凝血因子viii的活性一直维持在3％左右，且均与f8-bdd-299有一定的统计学差异(p<0.05)，用aptt法测定血浆凝血功能，结果如图12所示，f8-bdd-299表达的凝血因子viii的凝血时间最短，最接近于野生型小鼠(p<0.05)。

此外，针对抗体反应，采集上述经过治疗的小鼠眼眶外周血，3000rpm离心15min获得血浆，将血浆1:200用tris-bsabuffer稀释，置于pvc微孔板中，加入过氧化物酶标记羊抗鼠igg(peroxidase-conjugatedgoatanti-mousetotaligg)，随后加发光底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，进行酶联免疫吸附试验(elisa)，以评估抗凝血因子viii的抗体反应，以注射抗凝血因子viii单克隆抗体的a型血友病小鼠作为阳性对照(ctrl )，结果如图13所示，f8-bdd-n8和f8-bdd-299表达的凝血因子viii的igg抗体反应均低于f8-bdd表达的凝血因子viii，且f8-bdd-299表达的凝血因子viii的igg抗体反应最低。

综上所述，本发明对f8-bdd基因进行遗传改造，添加糖基化位点序列，并利用改造后慢病毒载体构建表达载体，所述表达载体具备高转染和表达效率，所表达凝血因子viii易分泌到胞外，具备高效凝血功能，能一定程度地纠正a型血友病小鼠的出血表型，且抗体反应低，对于保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的a型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>北京美康基免生物科技有限公司

<120>一种重组凝血因子viii及其应用

<130>20210425

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>317

<212>prt

<213>人工序列

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859095

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