包含细胞衍生的囊泡的组合物及其用途的制作方法

专利2022-05-09  126


包含细胞衍生的囊泡的组合物及其用途
1.发明背景
2.细胞外囊泡,尤其是外泌体(exosome)的研究一直在迅速增加。关于外泌体生物发生(kowal et al.,2014,curr opin cell biol.29c:116

125),它们的诊断和预后潜力(revenfeld et al.,2014,clin ther.36(6):830

846),以及组织工程和再生医药的潜在治疗应用(lamichhane et al.,2014,tissue eng part b rev.)的多篇文章已经发表。这些mrna、mirna、蛋白质和脂质介体的载体能够作用于靶细胞,从而促进细胞

细胞通讯和功能遗传信息的交换(simons and raposo,2009,curr opin cell biol.21(4):575

581;stoorvogel et al.,2002,traffic 3(5):321

330;nieuwland and sturk,2010,thrombosis research 125(supplement 1):s49

s51)
3.发明概述
4.本文尤其提供了由肾细胞(诸如生物活性的肾细胞,例如,所选择的肾细胞)产生的细胞外产物(例如,囊泡诸如微囊泡(microvesicle),例如,外泌体)。在某些实施方案中,此类产品用于治疗肾脏疾病,诸如慢性肾脏疾病。还包括改变由细胞产生的囊泡的组分(诸如mirna或蛋白质)的方法,以及产生包含各种化合物的囊泡的方法。还提供了诊断和治疗方法。
5.在一方面,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述方法包括向所述受试者施用有效量的分离的分泌的肾细胞囊泡,其中所述囊泡通过静脉内注射或通过经导管递送来施用。
6.在一方面,本文提供了用于检测囊泡中至少一种化合物的方法。在某些实施方案中,所述方法包括获得所述囊泡并检测至少一种化合物是否在所述囊泡中,其中(i)所述至少一种化合物是蛋白质,且所述蛋白质是cd9、cd81、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e和/或ssea

4;(ii)所述至少一种化合物包含mirna,其中所述mirna包括mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143和/或let7b中的至少两种;和/或(iii)所述至少一种化合物不由天然肾脏中的肾细胞表达或产生。
7.在一方面,本文提供了用于在已施用所述生物活性的肾细胞群体的受试者中监测用生物活性的肾细胞群体治疗的方法。在某些实施方案中,所述方法包括根据本文公开的方法,检测来自所述受试者的囊泡中是否存在至少一种化合物。
8.在一方面,本文提供了鉴定囊泡是否是再生性的的方法。在某些实施方案中,所述方法包括(i)根据本文公开的方法检测所述囊泡中是否存在蛋白质和/或mirna;和(ii)如果在所述囊泡中检测到所述蛋白质和/或mirna,则将所述囊泡鉴定为是再生性的。
9.在一方面,本文提供了检测来自生物活性的肾细胞群体的囊泡中至少一种mirna的水平的方法。在某些实施方案中,所述方法包括(i)检测与对照相比,在所述囊泡中以下mirna分子中的一种或多种是否增加:mir

1248、mir

3168、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p;和(ii)检测与对照相比,在所述囊泡中以下mirna分子中的一种或多种是否减少:mir
‑1‑
3p、mir
‑1‑
3p、mir

143

3p、mir

150

5p、mir

509

3p、mir

653

5p、
mir

204

5p、mir

192

5p和/或mir

363

3p。在某些实施方案中,所述mirna是哺乳动物mirna,诸如人mirna。
10.在一方面,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述方法包括向所述受试者施用有效量的来自囊泡制剂的囊泡,其中来自所述囊泡制剂的囊泡根据本文公开的方法已经鉴定是再生性的。
11.在某些实施方案中,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含生物活性的肾细胞群体的组合物,所述生物活性的肾细胞群体补充有尚未由所述生物活性的肾细胞群体分泌的肾细胞囊泡。
12.在一方面,本文提供了改变由生物活性的肾细胞群体产生的囊泡中至少一种mirna和/或蛋白质的水平的方法,所述方法包括在低氧条件下培养所述群体。
13.在一方面,本文提供了囊泡,其包含不由天然肾脏中的肾细胞产生的化合物。
14.在一方面,本文提供了组合物,其包含本文公开的囊泡和药学上可接受的载体。
15.在一方面,本文提供了组合物,其包含肾细胞囊泡和非肾细胞囊泡。
16.在一方面,本文提供了组合物,其包含由原代肾细胞产生的囊泡和由所选择的肾细胞产生的囊泡。
17.在一方面,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的组合物。
18.在一方面,本文提供了从细胞中产生囊泡(例如,微囊泡诸如外泌体)的方法,其中所述囊泡包含不由所述细胞产生的化合物。在某些实施方案中,所述方法包括从细胞培养上清液中分离所述囊泡,其中所述细胞培养上清液来自与所述化合物接触(例如,在含有其的培养基中培养)的细胞的培养物。在某些实施方案中,所述方法包括从细胞培养上清液中分离所述囊泡(例如,微囊泡诸如外泌体),然后通过使外泌体膜透化以便于(facilitate)化合物的进入(例如,通过超声处理、脂质体转染、电穿孔等),从而将所述化合物掺入所述囊泡中。
19.在一方面,本文提供了产生肾脏外泌体的方法,其中所述外泌体包含不由天然肾脏中肾细胞产生的化合物。在某些实施方案中,所述方法包括从肾细胞培养上清液分离囊泡,其中所述肾细胞培养上清液来自肾细胞培养物,所述肾细胞培养物包含已与所述化合物接触过的生物活性的肾细胞群体。
20.附图简述
21.图1:总体nka制备过程的非限制性实例的流程图。
22.图2a

d:提供图1中所示的非限制性实例过程的进一步细节的流程图。
23.图3a

d:补充有来自src的外泌体的nka的产生的非限制性实例的流程图。
24.图4a

d是显示从tchk0012和tchk0013分离的分泌的外泌体的表面蛋白分析的图。分析揭示了与brc相比,src的cd133、cd326和cd49e表达上调。尽管cd133的确切功能尚不清楚,但已提出它可以充当细胞膜拓扑结构的组织者。上皮细胞粘附分子(epcam)(也称为cd326)是一种跨膜糖蛋白,其介导上皮细胞中不依赖ca2 的同型细胞

细胞粘附。epcam还参与细胞信号转导、迁移、增殖和分化。除了粘附以外,已知整联蛋白诸如cd49e参与细胞表面介导的信号转导。箭头已添加到图4b

d以强调来自brc

3a和src的外泌体之间的比较。
25.图5:外泌体融合至细胞的fac分析图。细胞的荧光标记表明亲脂性染料从外泌体
转移到细胞膜,导致直方图线的从左向右的移动。外泌体在4摄氏度时不会附着并与细胞膜整合。这是阴性对照。在37摄氏度培养下允许附着和整合,从而对细胞进行荧光标记,从而使直方图从左向右移动。
26.图6:显示响应来自肾细胞群体的可变剂量的外泌体(以1x=x ng/ml外泌体的剂量/响应),细胞增殖作为平均细胞计数(y轴)的图。
27.图7a

c:细胞的图像。处理后将培养物培养9小时。a.无血清、无生长因子的培养基(阴性对照)。b.补充了10e10外泌体的无血清、无生长因子的培养基(测试的物品)。c.补充有生长因子的无血清培养基(阳性对照)。
28.图8:在火山图中揭示了在实验条件e1相对d1之间存在显著性差异的mirna组。火山图显示了根据倍数变化(x轴)和显著性(y轴上的p值的负对数)的差异表达mirna的分布。水平虚线是p值截断(cut

off)(0.05),垂直虚线是倍数变化截断(log2倍数变化|≥1)。另参见表11

13。
29.图9:在火山图中揭示了在实验条件f1相对a1之间存在显著性差异的mirna组。另参见表14

16。
30.图10:外泌体制备过程的非限制性实例的流程图。
31.发明详述
32.本文尤其提供了由肾细胞(诸如生物活性的肾细胞,例如,所选择的肾细胞)产生的细胞外产物(例如,囊泡诸如微囊泡,例如,外泌体)。
33.贯穿本公开引用的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文。如果所并入的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾,包括但不限于所定义的术语,术语用法,所描述的技术等,则以本申请为准。
34.定义
35.除非另外定义,否则本文所用的技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员常理解的相同含义。principles of tissue engineering,第三版(edited by r lanza,r langer,&j vacanti),2007为本领域技术人员提供本申请中使用的许多术语的一般指南。本领域技术人员将认识到类似或等同于本文所述的许多方法和材料,其可用于本发明的实践中。实际上,本发明决不限于所描述的方法和材料。
36.如本文所用,单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“the(该)”旨在也包括复数形式,除非上下文另有明确说明。如本文所使用的,术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
37.在本公开中,“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“含有”和“具有”等可以具有在美国专利法中赋予它们的含义,并且可以意味着“包括(include)”、“包括(including)”等。“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially)”同样具有在美国专利法中赋予的含义,该术语是开放式的,只要所列举的基本或新颖特征不因所列举的内容的存在而改变,则允许存在比所列举的更多的特征,但是排除现有技术的实施例。
38.如本文所用,在数值或范围的上下文中,术语“约”是指所列举或要求保护的数值或范围
±
10%,除非上下文要求更有限的范围。
39.如本文所用,术语“细胞群体”是指通过直接从合适的组织来源(通常从哺乳动物)
中分离获得的许多细胞。在某些实施方案中,分离的细胞群体可随后在体外培养。本领域普通技术人员将理解,用于分离和培养供本公开使用的细胞群的各种方法,以及适合于本公开使用的细胞群体中的多种细胞。在某些实施方案中,细胞群体可以是源自器官或组织(例如,肾脏)的未分级的异质细胞群体(heterogeneous cell population)或富集的同源细胞群体。在某些实施方案中,异质细胞群体可以从组织活组织检查或从整个器官组织中分离。在某些实施方案中,异质细胞群体可以源自哺乳动物细胞的体外培养物,其是从组织活组织检查或整个器官组织建立的。未分级的异质细胞群体也可以称为未富集的细胞群体。在某些实施方案中,细胞群体含有生物活性的细胞。与未分级的异质细胞群体相比,同源细胞群体包含更大比例的相同细胞类型、具有共同表型或具有相似物理特性的细胞。在某些实施方案中,可以从异质肾细胞群体中分离、提取或富集同源细胞群体。在某些实施方案中,通过在异质细胞悬液的密度边界、屏障或界面离心用于分离来获得富集的细胞群体作为细胞级分。在某些实施方案中,使用异质细胞悬液的连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离,获得富集的细胞群体作为细胞级分。在某些实施方案中,细胞群体可以包含1、2、3、4或多种类型的肾细胞。在某些实施方案中,将源自肾脏的同源或异质细胞群体与源自肾脏以外的组织或器官的同源或异质细胞群体组合,而没有进一步限制。
40.如本文所用,术语“生物活性的”是指“具有生物活性”,例如药理学或治疗活性。在某些实施方案中,生物活性是增强肾功能和/或对肾脏稳态的作用。在某些实施方案中,生物学活性是但不限于镇痛;抗病毒;抗炎;抗肿瘤;免疫刺激;免疫调节;增强细胞活力、抗氧化、氧载体、细胞募集、细胞附着、免疫抑制、血管生成、伤口愈合活性、宿主干细胞或祖细胞动员、细胞增殖、刺激细胞迁移至损伤部位、改善细胞和组织纤维化、干扰上皮

间充质信号转导级联放大,分泌细胞因子、生长因子、蛋白质、核酸、外泌体、微囊泡或其任何组合。
41.如本文所用,术语“生物活性的肾细胞”或“brc”是指当施用于受试者的肾脏时具有一种或多种以下特性的肾细胞:减轻(例如减慢或停止)慢性肾脏疾病或其症状的恶化或进展的能力,增强肾脏功能的能力,影响(改善)肾脏动态平衡的能力,以及促进肾脏组织或肾脏的愈合、修复和/或再生的能力。在某些实施方案中,可以将来自brc的微囊泡和/或brc施用于患者,其中brc的单倍型不同于患者的单倍型。在某些实施方案中,brc是能够增强肾功能、影响(改善)肾脏动态平衡,和/或促进肾脏组织或肾脏的愈合、修复和/或再生而没有免疫排斥的细胞。在某些实施方案中,这些细胞可包括功能性肾小管细胞(例如,基于肌酐排泄和蛋白质保留的改善)、肾小球细胞(例如,基于蛋白质保留的改善)、血管细胞和/或皮髓质交界处的其他细胞。在某些实施方案中,brc对肾脏具有再生作用。在某些实施方案中,brc包含,基本上由所选择的肾细胞(src)组成或由所选择的肾细胞(src)组成。在某些实施方案中,brc是src。在某些实施方案中,brc获自来自肾组织的肾细胞的分离和扩增。在某些实施方案中,brc获自使用选择生物活性的细胞(例如,具有再生能力的细胞)的方法从肾脏组织中分离和扩增的肾细胞。
42.在某些实施方案中,src是获自从合适的肾脏组织来源分离和扩增的肾细胞的细胞,其中与起始肾细胞群体相比,src含有较大百分比的一种或多种细胞类型,而缺乏或具有较低百分比的一种或多种其他细胞类型。在某些实施方案中,与起始肾细胞群体相比,src含有增加比例的brc。在某些实施方案中,src群体是富集了特定生物活性成分和/或细胞类型和/或消耗了特定的非活性和/或不需要的成分或细胞类型的肾细胞的分离群体,用
于治疗肾脏疾病,即,提供稳定和/或改善和/或再生肾脏功能。在某些实施方案中,可以将来自src的微囊泡和/或src施用于患者,其中src的单倍型不同于患者的单倍型。在某些实施方案中,src能够提供稳定和/或改善和/或再生肾脏功能。与起始群体相比,src提供更好的治疗和再生效果。在某些实施方案中,src是通过肾脏活组织检查从患者的肾皮质组织中获得的。在某些实施方案中,基于它们的一种或多种标志物的表达来选择src(例如,通过macs或facs)。在某些实施方案中,基于细胞类型上一种或多种标志物的表达,对src消减一种或多种细胞类型(例如,通过macs或facs)。在某些实施方案中,细胞的消减或选择包含珠子/抗体偶联,以拉出(pull out)细胞表面具有某些蛋白质的细胞。在某些实施方案中,src选自生物活性的肾细胞群体。在某些实施方案中,通过扩增肾细胞的密度梯度分离来选择src。在某些实施方案中,通过在密度边界、屏障或界面离心分离扩增的肾细胞或单步不连续步梯度分离来选择src。在某些实施方案中,通过在低氧条件下培养的扩增肾细胞的连续或不连续密度梯度分离来选择src。在某些实施方案中,通过在低氧条件下培养的至少约8、12、16、20或24小时的扩增肾细胞的密度梯度分离来选择src。在某些实施方案中,通过在低氧条件下培养的扩增肾细胞的密度边界、屏障或界面离心分离来选择src。在某些实施方案中,通过密度边界、屏障或界面离心(例如,单步不连续密度梯度分离)在低氧条件下培养的至少约8、12、16、20或24小时的扩增肾细胞的分离来选择src。在某些实施方案中,src主要由肾小管细胞组成。在某些实施方案中,src中可以存在其他实质(parenchymal)(例如,血管)和基质(例如,集合管)细胞。在某些实施方案中,src群体中少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的细胞是血管细胞。在某些实施方案中,src群体中少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的细胞是集合管细胞。在某些实施方案中,src群体中少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的细胞是血管或集合管细胞。例如,在本文的实施例1中,公开了获得src的方法。presnell et al.wo/2010/056328,ilagan et al.pct/us2011/036347,和jain et al.pct/us2016/044866。
43.术语“天然器官”应是指存活的受试者的器官。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可能患有与所述特定器官相关的疾病。
44.术语“天然肾脏”应是指存活的受试者的肾脏。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可能患有肾脏疾病。
45.术语“再生作用”应是指对天然器官(诸如肾脏)提供益处的作用。作用可以包括但不限于降低对天然器官的损伤程度或改善、恢复或稳定天然器官的功能或结构。肾脏损伤可以是以纤维化、炎症、肾小球肥大、萎缩等的形式,且与受试者中天然器官相关的疾病有关。
[0046]“富集的”细胞群体或制剂是指源自起始细胞群体的细胞群(例如,来自器官(诸如肾脏)的未分级的异质细胞群体),其含有的特定细胞类型的百分比大于起始细胞群体中所述细胞类型的百分比。例如,起始肾脏细胞群体可富集感兴趣的第一、第二、第三、第四、第五等细胞群。如本文所用,术语“细胞群体”、“细胞制剂”和“细胞表型”可互换使用。
[0047]
如本文所用,术语“低氧的”培养条件是指相对于标准培养条件(其中细胞在大气中的氧气水平(约21%)下培养),使细胞在培养系统中的可用氧气水平降低的培养条件。在某些实施方案中,低氧培养条件其中培养系统中的氧气水平少于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%。
[0048]
如本文所用,术语“生物材料”是指天然或合成的生物相容性材料,其适于以可存活的状态引入支持所选择的生物活性的细胞的活体组织中。天然生物材料是由活体系统制成或源于其的材料。合成生物材料是不由活体系统制成或不源于其的材料,而是通过本领域普通技术人员熟知的特定化学程序和实验方案合成或组成的。本文公开的生物材料可以是天然和合成生物相容性材料的组合。如本文所用,生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域普通技术人员将理解,生物材料可以以各种形式配置,例如,作为多孔泡沫、凝胶、液体、珠子、固体,并且可包含一种或多种天然或合成的生物相容性材料。在某些实施方案中,生物材料是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
[0049]
本文所用术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然的或合成的)通过共价、离子或氢键交联时形成的物质,以产生捕获水分子以形成凝胶的三维结构(例如,开放式晶格结构)。可用于形成水凝胶的材料的实例包括多糖,诸如藻酸盐(alginate)、聚磷嗪(polyphosphazine)和聚丙烯酸酯,其为分别通过温度或ph交联的交联的补剂(tonically),或嵌段共聚物,诸如普朗尼克(pluronics
tm
)或tetronics
tm
、聚环氧乙烷

聚丙二醇嵌段共聚物。在某些实施方案中,水凝胶是可生物降解的基于明胶的水凝胶。
[0050]
在某些实施方案中,生物材料包括,例如,源自现存人或动物来源的肾脏的细胞外基质,其中通过应用本领域普通技术人员已知的洗涤剂和/或其他化学试剂已消除了天然细胞群体。在某些实施方案中,生物材料是溶液的液体形式,其能够变成水凝胶,并且通过应用本领域技术人员已知的三维生物打印方法而在具有或不具有某些细胞群体的情况下分层。在某些实施方案中,生物材料配置成模仿脱细胞(decellurized)肾脏的三维分形组织。
[0051]
术语“调节释放(modified release)”或等同术语“受控释放”、“延迟释放”或“缓慢释放”是指在施用于个人后,随时间或在多个时间点释放活性剂诸如如生物活性的细胞的制剂。取决于制剂的可以在期望的时间范围内,例如在数分钟、数小时、数天、数周或更长时间内发生的活性剂的调节释放与在施用后立即可获得基本上整个剂量单位的制剂相反。在某些实施方案中,对于组织工程和再生医学应用,调节释放制剂提供了在局部施用(例如,直接向实体器官施用活性剂)后的多个时间点释放活性剂。例如,生物活性的细胞的调节释放制剂可以在施用时立即提供细胞的初始释放,并在稍后的时间提供细胞的第二次释放。在某些实施方案中,第二次释放活性剂的时间延迟可以是初次施用后的数分钟、数小时或数天。通常,延迟释放的时间段对应于活性剂的生物材料载体失去其结构完整性所花费的时间段。活性剂的延迟释放从完整性开始降低就开始,并在完整性完全丢失(fail)时完成。本领域普通技术人员将理解其他合适的释放机制。
[0052]
术语“环境(ambient)温度”是指将本公开的制剂施用于受试者的温度。通常,环境温度是温度控制环境的温度。环境温度范围从约18℃至约30℃。在某些实施方案中,环境温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃,或约30℃。
[0053]
肾脏疾病的非限制性实例包括与急性或慢性肾衰竭的任何阶段或程度有关的病症,所述病症会导致执行血液过滤功能以及消除来自血液的多余的液体、电解质和废物的肾脏能力的丧失。在某些实施方案中,肾脏疾病还可包括内分泌功能失常,诸如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质不平衡(维生素d缺乏)。肾脏疾病可以起源于肾脏,或者也可以
继发于多种病况,包括(但不限于)心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝脏疾病。肾脏疾病可能是慢性肾衰竭的一种病况,其在肾脏急性损伤后形成。例如,通过局部缺血和/或暴露于有毒物质对肾脏的损伤可能会导致急性肾衰竭;急性肾损伤后不完全恢复可能会导致慢性肾衰竭的形成。
[0054]
术语“治疗”是指针对肾脏疾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的治疗性(therapeutic)治疗和预防性(prophylactic)或预防措施,其中目的是逆转、预防或减慢(例如,减轻其恶化)目标病症。需要治疗的人包括已经患有肾脏疾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的人,以及容易患有或有患肾脏疾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷风险的人或要预防肾脏疾病、贫血、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的人。如本文所用,术语“治疗”包括肾功能的稳定和/或改善。
[0055]
在某些实施方案中,用活性剂“体内接触”天然器官(诸如细胞和/或其产物的富集群体)是指在活性剂和天然器官之间在体内直接接触。例如,由富集的肾细胞群体分泌的产物可以在体内与天然肾脏接触(单独或与细胞一起,例如,在构建体中)。在某些实施方案中,直接体内接触可以是天然的旁分泌、内分泌或近分泌(juxtacrine)。在某些实施方案中,分泌的产物可以是本文所述的不同产物的异质群体。
[0056]
在某些实施方案中,本文提供了“构建体”或“制剂”,其包含一种或多种细胞群体,和/或沉积在生物材料上或在生物材料(诸如由一种或多种合成的或天然存在的生物相容性材料组成的支架或基质)表面的一种或多种细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,一种或多种细胞群体可以被由一种或多种合成的或天然存在的生物相容性生物材料、聚合物、蛋白质或肽组成的生物材料包被、沉积、嵌入、附着、接种或捕获。在某些实施方案中,天然存在的生物材料是人或动物来源的脱细胞肾脏。在某些实施方案中,生物材料已经通过三维生物打印进行了结构性人工改造。在某些实施方案中,一种或多种细胞群体和/或细胞产物可以在体外或体内与生物材料或支架或基质组合。在某些实施方案中,可以选择用于产生构建体或制剂的一种或多种生物材料,以引导、便于或允许构建体的细胞组分与内源宿主组织的分散和/或整合,或者引导、便于或允许构建体或制剂的细胞组分的存活、植入、耐受或功能性能。在某些实施方案中,选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料以引导、便于或允许沉积在其上的至少一种细胞群体的多细胞、三维组织的形成。在某些实施方案中,生物材料引导、促进或便于清晰的(defined)三维细胞聚集物或类器官的组装,所述三维细胞聚集物或类器官概括天然肾脏组织的各个方面,包括但不限于组织的极性。在某些实施方案中,生物材料引导清晰的肾小管结构的组装,所述肾小管结构概括了天然肾脏组织的各方面,包括内腔。在某些实施方案中,生物材料促进或便于来自细胞群体的蛋白质、核酸和微囊泡的分泌。在某些实施方案中,还可以选择用于产生构建体的一种或多种生物材料,以模拟或概括在天然肾脏或肾实质中代表细胞群体源自的原始生物环境的特定三维组织或环境生态位的各方面。不受任何科学理论的束缚,认为这些细胞群体源自的原始生物生态位的再生进一步促进或便于细胞活力和效价。
[0057]
术语“细胞聚集体”或“球状体”是指培养的细胞的聚集体或组装,以允许3d生长,而不是生长为单层。应注意,术语“球状体”并不意味着聚集体是几何球体。在某些实施方案中,聚集体可以高度组织化,具有良好清晰的形态和极性,或者它可能是无组织的团;它可以包括单个细胞类型或多于一种细胞类型。在某些实施方案中,细胞可以是初级分离物,或
永久性细胞系,或两者的组合。本定义中包括类器官和类器官培养。在某些实施方案中,在旋转烧瓶中形成球状体(例如,细胞聚集体或类器官)。在某些实施方案中,在三维基质中形成球状体(例如,细胞聚集体或类器官)。
[0058]
术语“neo肾脏增强剂(neo

kidney augment)(nka)”是指生物活性的细胞制剂,其是由配制在包含基于明胶的水凝胶的生物材料中的src组成的可注射产品。术语“先进细胞疗法(advance cell therapy)(act)”也用于指代用nka治疗。在某些实施方案中,nka是包含配制在由基于明胶的水凝胶组成的生物材料中的免疫相容性肾细胞群体(例如,免疫相容性src)的可注射产品。在某些实施方案中,nka是由基因改造的免疫豁免的、同源的src组成的可注射产品,所述src不能免疫排斥,其配制在由基于明胶的水凝胶组成的生物材料中。
[0059]
术语“受试者”应是指正在经历或已经经历一种或多种肾脏疾病的体征、症状或其他指示物的任何单个人类受试者,包括有资格接受治疗的患者。此类受试者包括但不限于无论原因为何,新诊断或先前诊断以及现在正经历重现(recurrence)或复发(relapse),或有患肾脏疾病风险的受试者。受试者可能先前已经接受过肾脏疾病治疗,或者没有接受过如此治疗。
[0060]
术语“患者”是指需要治疗的任何动物,更优选地是哺乳动物(包括此类非人类动物,例如狗、猫、马、兔子、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人类灵长类动物)。最优选地,患者是人。
[0061]
术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”应通常是指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其他来源获得的任何生物样品。该术语包括组织活组织检查,诸如肾脏活组织检查。该术语包括培养的细胞诸如,例如,培养的哺乳动物肾细胞。从哺乳动物获得组织活组织检查和培养的细胞的方法是本领域众所熟知的。根据上下文,如果单独使用术语“样品”,则仍应是指“样品”是“生物样品”或“患者样品”,即,这些术语可以互换使用的。
[0062]
术语“测试样品”是指已经通过本公开的方法处理的来自受试者的样品。测试样品可以源自哺乳动物受试者中的各种来源,包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘膜、组织等。
[0063]
术语“对照”或“对照样品”是指阴性或阳性对照,其中预期阴性或阳性结果有助于关联测试样品中的结果。适用于本公开的对照包括但不限于已知表现出正常肾功能的指标特征的样品,获自已知未患肾脏疾病的受试者的样品和获自已知患有肾脏疾病的受试者的样品。在某些实施方案中,对照可以是在通过本公开的方法处理之前从受试者获得的样品。在某些实施方案中,合适的对照可以是获自已知患有任何类型或阶段的肾脏疾病的受试者的测试样品,以及获自已知未患任何类型或阶段的肾脏疾病的受试者的样品。对照可以是正常健康匹配的对照。本领域技术人员将理解适合于在本公开中使用的其他对照。
[0064]“再生预后(regeneration prognosis)”、“再生的预后(regenerative prognosis)”或“用于再生的预后(prognostic for regeneration)”通常是指对本文所述的细胞群体、细胞产物或构建体的施用或植入的可能的再生过程或结果的预测(forecast)或预测(prediction)。对于再生预后,可以通过以下一种或多种方式来获知预测或预测:植入或施用后功能器官(例如,肾脏)的改善、植入或施用后功能肾脏的发展、植入或施用后改
善的肾脏功能或能力的发展,以及植入或施用后天然肾脏某些标志物的表达。
[0065]“再生器官”是指植入或施用如本文所述的细胞群体、细胞产物或构建体后的天然器官。在某些实施方案中,再生器官特征在于各种指标,包括但不限于天然器官中功能或能力的发展、天然器官中功能或能力的改善、某些标志物和与疾病有关的生理指标的改善,和/或在天然器官中某些标志物的表达。本领域普通技术人员将理解,其他指标可能适用于表征再生器官。
[0066]“再生的肾脏”是指在植入或施用如本文所述的细胞群体、添加物或构建体后的天然肾脏。在某些实施方案中,再生的肾脏特征在于各种指标,包括但不限于,天然肾脏中功能或能力的发展、天然肾脏中功能或能力的改善、某些标志物和与肾脏疾病有关的生理指标的改善,以及在天然肾脏中某些标志物的表达。本领域普通技术人员将理解,其他指标可能适用于表征再生肾脏。
[0067]“小分子”是质量小于2000道尔顿的化合物。小分子的分子量优选小于1000道尔顿,更优选小于600道尔顿,例如,化合物小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。在某些实施方案中,小分子是有机化合物。
[0068]“微囊泡”是细胞来源的膜性细胞外囊泡,直径在30至1,000纳米(nm)之间。“外泌体”是直径为约30

150nm的细胞来源的膜性微囊泡。在某些实施方案中,外泌体是直径为约50

100nm的细胞来源的膜性微囊泡。外泌体通常共有的其他特征在本领域中是已知的。在zhang et al.(2016)am j physiol renal physiol.311(5):f844

f851中提供了与微囊泡和外泌体有关的非限制性描述,其全部内容通过引用并入本文。
[0069]
如本文所用,当指治疗剂(诸如微囊泡,例如,外泌体,单独或与生物活性的肾细胞组合)的量时,“有效的”是指当以本公开的方式使用时,足以产生所需的治疗反应而没有与合理的益处/风险比相应的不适当的不良副作用(诸如毒性、刺激性或过敏反应)的药剂的量。
[0070]
分泌的产物
[0071]
本文提供了由生物活性的肾细胞(例如,src)分泌的产物,诸如囊泡。在某些实施方案中,所述囊泡包含微囊泡。
[0072]
在某些实施方案中,所述微囊泡直径为约30

150、30

200、30

500、30

1000、500

1000、50

1000、50

200、50

150、50

100、100

150、100

200或100

300nm。
[0073]
在某些实施方案中,囊泡包含外泌体、基本上由外泌体组成或由外泌体组成。在某些实施方案中,所述外泌体直径为约50

100nm。在某些实施方案中,所述外泌体直径为30

100、50

150、50

100、100

150或30

150nm。在某些实施方案中,外泌体直径为约30、35、40、45、50、55或60nm至约100、110、120、130、140或150nm。
[0074]
在某些实施方案中,囊泡在其外表面上、在其脂质双层中和/或在其内腔中包含活性剂(诸如化合物)。在某些实施方案中,所述化合物减弱一种或多种细胞途径。在某些实施方案中,所述化合物是蛋白质、小分子或多核苷酸。在某些实施方案中,所述蛋白质是在囊泡的膜中的跨膜蛋白质。在某些实施方案中,所述化合物是亲脂性的并且是在外泌体的脂质双层中。在某些实施方案中,所述多核苷酸是mirna分子。
[0075]
在某些实施方案中,所述化合物由生物活性的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,所述化合物不由生物活性的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,将所述化合物添
加到产生囊泡的细胞的培养基中(例如,将细胞在含有所述化合物的培养基中培养)。在某些实施方案中,所述化合物进入细胞并包括在由细胞产生的囊泡中。在某些实施方案中,从细胞中纯化或分离囊泡,然后在含有所述化合物的溶液(例如,培养基)中培养。在某些实施方案中,从细胞分离或纯化囊泡,然后通过透化囊泡膜以便于所述化合物进入的技术(诸如通过超声处理、脂转染、电穿孔等)将化合物掺入囊泡中。
[0076]
在某些实施方案中,所述化合物不是由天然存在的肾细胞产生的。在某些实施方案中,所述化合物是细胞因子。在某些实施方案中,所述化合物是人工化合物。在某些实施方案中,所述人工化合物是药物。在某些实施方案中,所述人工化合物是小分子。在某些实施方案中,所述人工化合物是生物学的。在某些实施方案中,所述人工化合物不由天然肾脏中的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,所述化合物是细胞活性剂。在某些实施方案中,所述化合物是用于治疗疾病(诸如肾脏疾病或一些其他疾病)的化合物。在某些实施方案中,所述化合物是致耐受性的(tolerogenic)或抗炎的。
[0077]
在某些实施方案中,所述化合物被美国食品和药物管理局批准用于施用于人以治疗疾病。在某些实施方案中,所述化合物用于治愈、减轻、治疗或预防疾病。在某些实施方案中,所述化合物用于改变哺乳动物细胞或生物体的结构或功能。
[0078]
在某些实施方案中,所述囊泡包含减弱纤溶酶原激活物抑制剂

1(plasminogen activation inhibitor

1)(pai

1)信号转导和/或转化生长因子β(tgfβ)信号转导的化合物。在某些实施方案中,所述囊泡包含减弱规范wnt信号转导的化合物。在某些实施方案中,所述囊泡包含减弱非规范wnt信号转导的化合物。在某些实施方案中,所述囊泡包含减弱cxcr4介导的信号转导的化合物。在某些实施方案中,所述囊泡包含下调炎性细胞因子的化合物。在某些实施方案中,所述炎性细胞因子是il8。在某些实施方案中,所述囊泡包含减弱notch信号转导的化合物。
[0079]
在某些实施方案中,所述化合物是用于细胞的免疫表型分型的细胞表面分子。在某些实施方案中,所述化合物是cd9、cd63、cd81、cd133、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44或cd49e。
[0080]
在某些实施方案中,所述化合物是蛋白受体。在某些实施方案中,所述蛋白受体是类视黄醇相关受体(ror4)。
[0081]
在某些实施方案中,所述化合物是发育阶段标志物。在某些实施方案中,所述发育阶段标志物是阶段特异性胚胎抗原

4(ssea

4)。
[0082]
在某些实施方案中,所述化合物是应激保护蛋白(stress

protecting protein)。在某些实施方案中,所述应激保护蛋白是热休克蛋白(hsp)70或hsp90。
[0083]
在某些实施方案中,所述化合物是支架蛋白。在某些实施方案中,所述支架蛋白是tst101。
[0084]
在某些实施方案中,所述化合物是mirna,并且在囊泡的内腔中。
[0085]
在某些实施方案中,所述mirna是细胞周期调节mirna。在某些实施方案中,所述细胞周期调节mirna是let7a、mir

143或mir22。
[0086]
在某些实施方案中,所述mirna是细胞衰老调控mirna。在某些实施方案中,所述细胞衰老调控mirna是mir

34。
[0087]
在某些实施方案中,所述mirna是细胞迁移调控mirna。在某些实施方案中,所述细
胞迁移调控mirna是mir30

c。
[0088]
在某些实施方案中,所述mirna是细胞生长调节mirna。在某些实施方案中,所述细胞生长调节mirna是mir194

2。
[0089]
在某些实施方案中,所述mirna是细胞信号途径调控mirna。在某些实施方案中,所述细胞信号途径调控mirna是mir

142。
[0090]
在某些实施方案中,所述mirna是炎症调控mirna。在某些实施方案中,所述炎症调控mirna是mir

10a。
[0091]
在某些实施方案中,所述mirna是血管生成调控mirna。在某些实施方案中,所述血管生成调控mirna是mir

296和/或mir

146a。
[0092]
在某些实施方案中,所述mirna是激酶活性调控mirna。在某些实施方案中,所述激酶活性调控mirna是mir

83。
[0093]
在某些实施方案中,所述化合物是抑制pai

1、tgfβ、规范wnt信号转导、非规范wnt信号转导、cxcr4介导的信号转导和/或notch信号转导的mirna。
[0094]
在某些实施方案中,通过抑制上皮到间充质转化(mesenchymal transition)(emt)来降低或预防肾脏纤维化。
[0095]
在某些实施方案中,本文提供的囊泡包含mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143和/或let7b。
[0096]
在某些实施方案中,本文提供的囊泡包含mir

1248、mir

3168、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p。
[0097]
在某些实施方案中,本文提供囊泡,囊泡包含cd9、cd63、cd81、cd133、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e和/或ssea

4。
[0098]
在某些实施方案中,本文提供囊泡,所述囊泡包含cd63、cd9和/或cd81,且所述cd63、cd9和/或cd81或其一部分在所述囊泡的外表面上。在某些实施方案中,这些蛋白质中的一种或多种的一部分在囊泡的内部。
[0099]
在某些实施方案中,本文提供的囊泡包含cd133、cd326和/或cd49e,且所述cd133、cd326和/或cd49e在所述囊泡的外表面上。
[0100]
在某些实施方案中,与未与囊泡接触的肾细胞相比,与囊泡接触的肾细胞的增殖增加。在某些实施方案中,与未与囊泡接触的内皮细胞相比,与囊泡接触的内皮细胞的血管形成增加。在某些实施方案中,与未与囊泡接触的肾细胞相比,与囊泡接触的肾细胞的肾单位肾小管(nephron tubule)形成增加。
[0101]
在某些实施方案中,囊泡包含磷脂、鞘磷脂、胆固醇、神经酰胺(cerimide)和/或磷脂酰胆碱。
[0102]
在某些实施方案中,囊泡处于包含药学上可接受的载体的组合物中。在某些实施方案中,所述药学上可接受的载体包含水性溶液。在某些实施方案中,所述药学上可接受的载体是温度敏感的。在某些实施方案中,所述药学上可接受的载体是水凝胶。在某些实施方案中,所述药学上可接受的载体是包含明胶。
[0103]
在某些实施方案中,所述囊泡已经通过brc(诸如原代肾细胞)产生。在某些实施方案中,所述囊泡已经通过src产生。本文包括包含来自原代肾细胞的囊泡以及来自src的囊
泡的组合物。还提供了进一步包含由内皮细胞或间充质干细胞(mesenchymal stem cell)分泌的囊泡的组合物。在某些实施方案中,本文提供的组合物包含非肾细胞囊泡。在某些实施方案中,非肾细胞囊泡已由非肾内皮祖细胞、非肾间充质干细胞或非肾脂肪来源的祖细胞分泌。
[0104]
在一方面,本文提供了用于检测囊泡中至少一种化合物的方法。在某些实施方案中,所述方法包括获得所述囊泡并检测至少一种化合物是否在所述囊泡中,其中(i)所述至少一种化合物是蛋白质,且所述蛋白质是cd9、cd81、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e和/或ssea

4;(ii)所述至少一种化合物包含mirna,其中所述mirna包括mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143和/或let7b中的至少两种;和/或(iii)所述至少一种化合物不由天然肾脏中的肾细胞表达或产生。
[0105]
在某些实施方案中,所述囊泡在来自受试者的生物样品中获得或从来自受试者的生物样品中获得。在某些实施方案中,所述生物样品是尿液。在某些实施方案中,所述囊泡是在肾细胞的培养物的上清液中获得或从肾细胞的培养物的上清液中获得。在某些实施方案中,所述囊泡已由肾细胞分泌。在某些实施方案中,所述肾细胞是生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,所述肾细胞为所选择的肾细胞。
[0106]
在某些实施方案中,检测蛋白质是否在囊泡中包括免疫测定。在某些实施方案中,检测蛋白质是否在囊泡中包括酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、蛋白质印迹(western blot)或蛋白质免疫染色。在某些实施方案中,检测蛋白质是否在囊泡中包括光谱测定法。在某些实施方案中,检测蛋白质是否在囊泡中包括高效液相色谱(hplc)或液相色谱

质谱(lc/ms)。
[0107]
在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中包括聚合酶链式反应(pcr)。在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中包括反转录酶pcr。在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中包括微阵列分析。在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中包括rna测序。在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中包括使所述囊泡、或怀疑包含来自所述囊泡的核酸的经处理的样品与和所述mirna互补的探针或引物接触。在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中不包括微阵列分析。在某些实施方案中,检测mirna是否在囊泡中包括用微阵列进行微阵列分析,其中所述微阵列包含针对少于1000、500或100种不同mirna的探针。
[0108]
在某些实施方案中,所述化合物是小分子。
[0109]
在某些实施方案中,所述化合物通过生物活性的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,所述化合物不通过生物活性的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,所述化合物通过生物活性的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,所述化合物不通过生物活性的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,将化合物加入到产生囊泡的细胞的培养基中(例如,将细胞在含所述化合物的培养基中培养)。在某些实施方案中,所述化合物进入细胞并包括在由细胞产生的囊泡中。在某些实施方案中,所述囊泡从细胞纯化或分离,然后在含有所述化合物的溶液(例如,培养基)中培养。在某些实施方案中,所述囊泡从细胞分离或纯化,然后通过透化外泌体膜以便于化合物进入的技术(例如通过超声处理、脂质体转染、电穿孔等)将化合物掺入囊泡中。
[0110]
在某些实施方案中,所述化合物不是通过天然存在的肾细胞产生的。在某些实施方案中,所述化合物是细胞因子。在某些实施方案中,所述化合物是人工化合物。在某些实
施方案中,所述化合物是药物。在某些实施方案中,所述人工化合物不由天然肾脏中的肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,化合物是细胞活性剂。在某些实施方案中,化合物是用于治疗疾病(诸如肾脏疾病或一些其他疾病)的化合物。在某些实施方案中,化合物是致耐受性的或抗炎的。在某些实施方案中,化合物被美国食品和药物管理局批准用于施用于人以治疗疾病。在某些实施方案中,化合物用于治愈、减轻、治疗或预防疾病。在某些实施方案中,化合物用于改变哺乳动物细胞或生物体的结构或功能。
[0111]
在一方面,本文提供了用于在已施用所述生物活性的肾细胞群体的受试者中监测用生物活性的肾细胞群体治疗的方法。在某些实施方案中,所述方法包括根据本文公开的方法,检测来自所述受试者的囊泡中是否存在至少一种化合物。
[0112]
在某些实施方案中,所述方法包括根据本文公开的方法,在第一时间点和第二时间点检测来自所述受试者的囊泡中是否存在至少一种化合物。在某些实施方案中,所述第一时间点是在所述受试者已经施用了所述生物活性的肾细胞群体之前,而所述第二时间点是在所述受试者已经施用了所述生物活性的肾细胞群体之后。在某些实施方案中,所述第一时间点和所述第二时间点是在所述受试者已经施用了所述生物活性的肾细胞群体之后。在某些实施方案中,所述方法进一步包括如果所述化合物的水平在所述第一时间点相比于所述第二时间点更高,则鉴定所述受试者中的再生作用。
[0113]
在某些实施方案中,所述方法进一步包括如果所述化合物的水平高于对照,则鉴定所述受试者中的再生作用。在某些实施方案中,所述方法进一步包括所述对照是在尚未施用所述生物活性的肾细胞群体的相应受试者中的水平。
[0114]
本文还包括鉴定囊泡是否是再生性的
[0115]
的方法。在某些实施方案中,所述方法包括:(i)根据本文公开的方法检测所述的囊泡中是否存在蛋白质和/或mirna;和(ii)如果在所述囊泡中检测到所述蛋白质和/或mirna,则将所述囊泡鉴定为是再生性的。
[0116]
在一方面,本文提供了检测来自生物活性的肾细胞群体的囊泡中至少一种mirna的水平的方法。在某些实施方案中,所述方法包括:(i)检测与对照相比,在所述囊泡中以下mirna分子中的一种或多种是否增加:mir

1248、mir

3168、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p;和/或(ii)检测与对照相比,在所述囊泡中以下mirna分子中的一种或多种是否减少:mir
‑1‑
3p、mir
‑1‑
3p、mir

143

3p、mir

150

5p、mir

509

3p、mir

653

5p、mir

204

5p、mir

192

5p和/或mir

363

3p。在某些实施方案中,生物活性的肾细胞是所选择的肾细胞。在某些实施方案中,所述对照是来自原代肾细胞群体的一种或多种mirna分子囊泡的水平。在某些实施方案中,所述对照是来自另一种生物活性的肾细胞群体的一种或多种mirna分子囊泡的水平。
[0117]
本主题还提供了改变由生物活性的肾细胞群体产生的囊泡中至少一种mirna和/或蛋白质的水平的方法,所述方法包括在低氧条件下培养所述群体。在某些实施方案中,在低氧条件下培养所述群体包括在少于约5%、4%、3%、2%或1%氧气存在下培养所述群体,例如8

72小时。在某些实施方案中,在低氧条件下培养所述群体包括在约1

5%、2

5%、2

4%、1

3%或1.5

2.5%氧气存在下培养所述群体,例如8

72小时。在某些实施方案中,在低氧条件下培养所述群体包括在少于5%的氧气存在下培养所述群体至少约8、12、16、20、24
或48小时。在某些实施方案中,在低氧条件下培养所述群体包括在约1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5%氧气存在下培养所述群体约8、12、16、20、24或48小时。
[0118]
在某些实施方案中,所述方法进一步包括传代所述生物活性的肾细胞至少约1、2或3次,之后在低氧条件下培养所述群体。
[0119]
在某些实施方案中,(a)所述至少一种mirna是mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143、let7b、mir

1248、mir

3168、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p;和/或(b)所述至少一种蛋白质是cd9、cd63、cd81、cd133、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e、ssea

4、tst101、hsp70、hsp90和/或ror4。
[0120]
在一方面,本文提供了从细胞产生外泌体的方法,其中外泌体包含不由所述细胞产生的化合物。在某些实施方案中,所述方法包括从细胞培养上清液分离所述外泌体,其中所述细胞培养上清液来自与所述化合物接触的细胞培养物。在一方面,本文提供了产生肾脏外泌体的方法,其中所述外泌体包含不由天然肾脏中肾细胞产生的化合物。在某些实施方案中,所述方法包括从肾细胞培养上清液分离囊泡,其中所述肾细胞培养上清液来自肾细胞培养物,所述肾细胞培养物包含已与所述化合物接触过的生物活性的肾细胞群体。在某些实施方案中,所述化合物是人工化合物。在某些实施方案中,所述化合物是小分子。在某些实施方案中,所述化合物是细胞活性剂。在某些实施方案中,所述化合物是药物。
[0121]
在一方面,本文包括了囊泡(诸如微囊泡,例如,外泌体),其包含不由天然肾脏中的肾细胞产生的化合物。
[0122]
在某些实施方案中,所述化合物是蛋白质、小分子或多核苷酸。在某些实施方案中,所述化合物不由在缺乏所述化合物的情况下培养的原代肾细胞表达或产生。在某些实施方案中,所述化合物是人工化合物。
[0123]
在某些实施方案中,将化合物(诸如蛋白质或小分子药物)“被动负载”进入囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体),例如,通过将细胞与含有化合物的培养基温育或通过将纯化的囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)与含有化合物的培养基温育。在某些实施方案中,通过透化(诸如通过超声处理、脂质体转染、电穿孔等)囊泡膜便于化合物的进入来“主动负载”化合物(诸如蛋白质或小分子药物)进入纯化的或分离的囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。
[0124]
在某些实施方案中,囊泡是包含产生囊泡的细胞的组合物。在某些实施方案中,囊泡已从产生它的细胞中分离。在某些实施方案中,囊泡是肾囊泡。在某些实施方案中,囊泡已通过生物活性的肾细胞产生。
[0125]
在某些实施方案中,本文提供的组合物包含肾细胞囊泡和非肾细胞囊泡。在某些实施方案中,肾细胞囊泡已由生物活性的肾细胞分泌。在某些实施方案中,非肾细胞囊泡已由非肾内皮祖细胞、非肾间充质干细胞或非肾脂肪来源的祖细胞分泌
[0126]
在某些实施方案中,本文提供的组合物包含由原代肾细胞产生的囊泡和由所选择的肾细胞产生的囊泡。
[0127]
在某些实施方案中,囊泡进一步包含药学上可接受的载体。
[0128]
在某些实施方案中,可以通过细胞和/或通过由生物活性的肾细胞(诸如囊泡)分泌的产物提供再生效果。在某些实施方案中,再生效果可以通过以下一种或多种表征:上皮

间充质转化降低(可以通过tgf

β信号转导的衰减);肾纤维化降低;肾脏炎症降低;天然
肾脏干细胞标志物的差异表达;植入细胞和/或天然细胞到肾损伤的部位(例如肾小管损伤)的迁移;在肾损伤部位(例如肾小管损伤)植入细胞的移植;肾功能的一种或多种指示物的稳定(如本文所述);与肾发生相关的s形体/逗号形体的重新形成,肾小管或肾单元的重新形成,红系稳态的恢复(如本文所述);及其任何组合(还参见basu et al.,2011.functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo

kidney augment prototypes for renal tissue engineering.cell transplantation 20:1771

90;bruce et al.,2015.selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via nf

κb and tgf

β1pathways.regenerative medicine 10:815

839,通过引用将其全部内容并入本文)。
[0129]
在某些实施方案中,作为组织活组织检查的替代方案,从检查体液(例如尿液)可以评估受试者接受治疗的再生结果。已经发现,从受试者源的尿液来源获得的微囊泡(例如,外泌体)含有某些成分,包括但不限于特定蛋白质和mirna,所述蛋白质和mirna最终源自受治疗影响的肾细胞群体。这些组分可以包括但不限于涉及干细胞复制和分化、细胞凋亡、炎症和免疫调控、纤维化、上皮

间充质转化,tgf

β信号转导和/或pai

1信号转导的因子。在某些实施方案中,微囊泡(例如,外泌体)相关的mirna/蛋白表达模式的时间分析允许连续监测接受本公开的细胞群体、细胞产物或构建体的受试者的肾脏内的再生结果。
[0130]
在某些实施方案中,本公开提供了评估肾脏疾病(kd)患者是否响应于治疗制剂的治疗的方法。在某些实施方案中,该方法可以包括以下步骤:与对照样品(例如,在利用治疗剂处理之前,源自同一患者的样品)中的微囊泡(诸如外泌体)的量相比,或相对于对照样品中的微囊泡的量,确定或检测获自用治疗剂处理的kd患者的测试样品中的微囊泡(或其腔内容物)(例如,外泌体)的量,其中,与对照样品中的微囊泡(例如,外泌体)或其腔内容物含量相比,测试样品中更高或更低的微囊泡(例如,外泌体)或其腔内容物的量指示了所处理的患者对治疗剂处理的相应性。
[0131]
在某些实施方案中,肾脏衍生的微囊泡(例如,外泌体)和/或肾脏衍生的微囊泡(例如,外泌体)的腔内容物可以散布在(shed into)受试者的尿液中,并且可以分析生物标志物指示再生结果或治疗功效。在某些实施方案中,本文提供的非侵入性预后方法可包括以下步骤:在施用或植入本文所述的生物活性的肾细胞群体、细胞产物或构建体之前和/或之后,从受试者获得尿液样品。可以使用标准技术从尿液样品中分离微囊泡和其他分泌产物,所述标准技术包括但不限于离心以去除不需要的碎片(zhou et al.2008.kidney int.74(5):613

621;skog等,美国公开专利申请no.20110053157,每一个都通过引用将其全部内容并入本文)沉淀以从尿液中分离微囊泡(例如,外泌体),聚合酶链反应和核酸测序以鉴定特定的核酸和质谱和/或2d凝胶电泳以鉴定与再生结果相关的特定蛋白质。
[0132]
细胞群体
[0133]
本文包括的组合物和制剂包含由肾细胞群体(例如,brc诸如原代细胞和/或src)产生的囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,所述囊泡可以例如从细胞分离或与不产生它们的细胞组合。本文提供了用于产生囊泡的brc的非限制性实例和特征。
[0134]
在某些实施方案中,本文提供的治疗组合物或制剂含有由分离的异质肾细胞群体分泌的微囊泡(例如,外泌体),其富含特定的生物活性组分或细胞类型和/或消减特定的非活性或不需要的组分或细胞类型。在某些实施方案中,本文提供的治疗组合物或制剂含有
或进一步含有分离的异质肾细胞群体,其富含特定的生物活性组分或细胞类型和/或消减特定的非活性或不需要的组分或细胞类型。在某些实施方案中,此类组合物和制剂用于治疗肾脏疾病,例如,提供稳定和/或改善和/或再生肾功能和/或结构。在某些实施方案中,所述组合物含有由分离的肾细胞级分分泌的微囊泡(例如,外泌体),其与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗特性,例如,提供稳定和/或改善和/或再生肾功能。在某些实施方案中,所述组合物含有与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗特性(例如,提供稳定和/或改善和/或再生肾功能)的分离的肾细胞级分。在某些实施方案中,本文所述的细胞群体可源自健康个体、患有肾脏疾病的个体或本文所述的受试者。
[0135]
本文包括微囊泡(例如,外泌体)和/或所选择的肾细胞群体的治疗组合物,其将被施用于受试者的靶器官或组织。在某些实施方案中,本文提供了包含由brc(例如,src)分泌的微囊泡(例如,外泌体)的组合物。在某些实施方案中,所述组合物进一步包含不分泌微囊泡(例如,外泌体)的brc(例如,src)。在某些实施方案中,所述组合物包含用微囊泡“掺入(spiked)”的nka(例如,将微囊泡(诸如外泌体)添加到nka中以产生囊泡增强的nka)。在某些实施方案中,可从其获得囊泡(例如,外泌体)的brc(例如,src)包括例如本文公开的任何brc(例如,src)。在某些实施方案中,囊泡获自根据实施例1中所述方法产生的src。在某些实施方案中,本文提供的制剂是nka,向其中添加了分离的囊泡(诸如微囊泡,例如外泌体)(所述nka已被“掺入”或补充了囊泡)。
[0136]
在某些实施方案中,生物活性的所选择的肾细胞群体通常是指在施用于受试者后潜在地具有治疗特性的细胞群体。在某些实施方案中,在施用于需要的受试者后,生物活性的肾细胞群体可以在受试者中提供稳定和/或改善和/或修复和/或再生肾功能。在某些实施方案中,治疗特性可以包括修复或再生作用。
[0137]
在某些实施方案中,肾细胞群体是源自肾脏的未分级的异质细胞群体(heterogeneous cell population)或富集的同源细胞群体。在某些实施方案中,所述异质细胞群体是从组织活组织检查或整个器官组织中分离的。在某些实施方案中,所述肾细胞群体源自哺乳动物细胞的体外培养物,其是从组织活组织检查或整个器官组织建立的。在某些实施方案中,肾细胞群体包含异质肾细胞群体的亚级分或亚群,其富含生物活性组分(例如,生物活性的肾细胞)并且消减了无活性或不需要的组分或细胞。
[0138]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体表达ggt和细胞角蛋白(cytokeratin)。在某些实施方案中,所述ggt具有表达水平大于约10%、约15%、约18%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%或约60%。在某些实施方案中,所述ggt是ggt

1。在某些实施方案中,所述肾细胞群体的细胞表达ggt

1、细胞角蛋白、vegf和kim

1。在某些实施方案中,所述肾细胞群体中大于18%的细胞表达ggt

1。在某些实施方案中,所述肾细胞群体中大于80%的细胞表达细胞角蛋白。在某些实施方案中,所述细胞角蛋白选自ck8、ck18、ck19及其组合。在某些实施方案中,所述细胞角蛋白是ck8、ck18、ck19、ck8/ck18、ck8/ck19、ck18/ck19或ck8/ck18/ck19,其中“/”是指与其相邻的细胞角蛋白的组合。在某些实施方案中,所述细胞角蛋白具有表达水平大于约80%、约85%、约90%或约95%。在某些实施方案中,肾细胞群体中大于80%的细胞表达细胞角蛋白。在某些实施方案中,肾细胞群体表达aqp2。在某些实施方案中,少于40%的细胞表达aqp2。在某些实施方案中,肾细胞群体中至少3%的细胞表达aqp2。
[0139]
在某些实施方案中,细胞群体内大于18%的细胞表达ggt

1,并且细胞群体内大于80%的细胞表达细胞角蛋白。在某些实施方案中,所述细胞角蛋白是ck18。在某些实施方案中,细胞群体内4.5%至81.2%的细胞表达ggt

1,细胞群体内3.0%至53.7%的细胞表达aqp2,并且细胞群体内81.1%至99.7%的细胞表达ck18。
[0140]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达选自以下一种或多种生物标志物的任意组合的细胞:aqp1、aqp2、aqp4、钙结合蛋白(calbindin)、钙调蛋白(calponin)、cd117、cd133、cd146、cd24、cd31(pecam

1)、cd54(icam

1)、cd73、ck18、ck19、ck7、ck8、ck8、ck18、ck19,ck8、ck18和ck19的组合、连接蛋白(connexin)43、cubilin、cxcr4(融合素)、dba、e

钙粘蛋白(e

cadherin)(cd324)、epo(促红细胞生成素)ggt1、glepp1(肾小球上皮蛋白1)、结合球蛋白(haptoglobulin)、itgbl(整合素01(integrin 01))、kim

1(肾损伤分子

1)、t1m

1(t细胞免疫球蛋白和含粘蛋白的分子)、map

2(微管相关蛋白2)、巨蛋白(megalin)、n

钙粘蛋白、肾病蛋白(nephrin)、nkcc(na

k

cl

共转运蛋白)、oat

1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白(osteopontin)、pan

钙粘蛋白(pan

cadherin)、pclp1(类足细胞标志蛋白1(podocalyxin

like 1)分子)、膜蛋白(podocin)、sma(平滑肌α

肌动蛋白)、突触足蛋白(synaptopodin)、thp(tamm

horsfall蛋白)、vinientin和αgst

1(α谷胱甘肽s

转移酶)。
[0141]
在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体富含上皮细胞,诸如肾脏组织活组织检查或其原代培养中的细胞群体(例如,所述肾细胞群体比起始细胞群体包含至少约5%、10%、15%、20%或25%更多的上皮细胞)。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体富含肾小管细胞,诸如肾脏组织活组织检查或其原代培养中的细胞群体(例如,所述肾细胞群体比起始细胞群体包含至少约5%、10%、15%、20%或25%更多的肾小管细胞)。在某些实施方案中,所述肾小管细胞包含近端肾小管细胞。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体具有较少比例的远端肾小管细胞、集合管细胞、内分泌细胞、血管细胞,或祖样细胞(progenitor

like cell)。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体具有较少比例的远端肾小管细胞。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体具有较少比例的集合管细胞。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体具有较少比例的内分泌细胞。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体具有较少比例的血管细胞。在某些实施方案中,与起始群体相比,肾细胞群体具有较少比例的祖样细胞。在某些实施方案中,与未富集的群体(例如,起始肾细胞群体)相比,肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的epo产生细胞、肾小球细胞和血管细胞。在某些实施方案中,与未富集的群体相比,肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的epo产生细胞和血管细胞。在某些实施方案中,与未富集的群体相比,肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的肾小球细胞和血管细胞。
[0142]
在某些实施方案中,肾细胞群体的细胞表达透明质酸(ha)。在某些实施方案中,ha的大小范围为从约5kda至约20000kda。在某些实施方案中,ha具有5kda、60kda、800kda和/或3000kda的分子量。在某些实施方案中,尤其是在肾内植入后,肾细胞群体通过透明质酸合酶(hyaluronic acid synthase)

2(has

2)的表达来合成和/或刺激高分子量ha的合成。在某些实施方案中,通过has

2的作用,肾细胞群体的细胞在体外和/或体内表达较高分子量种类的ha。在某些实施方案中,通过has

2的作用,肾细胞群体的细胞在体外和体内均表达较高分子量种类的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少100kda的分
子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有从约800kda至约3500kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有从约800kda至约3000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少800kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少3,000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有约800kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有约3000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,has

2合成具有分子量2
×
105至2
×
106da的ha。在某些实施方案中,较小种类的ha是通过降解的透明质酸酶的作用形成的。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有从约200kda至约2000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有约200kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有约2000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少200kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少2000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少5000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少10000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有至少15000kda的分子量的ha。在某些实施方案中,较高分子量种类的ha是具有约20000kda的分子量的ha。
[0143]
在某些实施方案中,所述群体包含能够受体介导的白蛋白转运的细胞。
[0144]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体的细胞是低氧抗性的。
[0145]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含一种或多种细胞类型,其表达一种或多种以下任意组合:巨蛋白、n

钙粘蛋白、e

钙粘蛋白、水通道蛋白

1(aquaporin

1)和水通道蛋白

2。
[0146]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:巨蛋白、cubicin、透明质酸合酶2(has2)、维生素d325

羟化酶(cyp2d25)、n

钙粘蛋白(ncad)、e

钙粘蛋白(ecad)、水通道蛋白

1(aqp1)、水通道蛋白

2(aqp2)、rab17、ras癌基因家族成员(rab17)、gata结合蛋白3(gata3)、含fxyd结构域的离子转运调节剂4(fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)、成员4(slc9a4)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)3家族、成员b1(aldh3b1)、醛脱氢酶1家族、成员a3(aldh1a3)和钙蛋白酶

8(calpain

8)(capn8)。
[0147]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:巨蛋白、cubicin、透明质酸合酶2(has2)、维生素d325

羟化酶(cyp2d25)、n

钙粘蛋白(ncad)、e

钙粘蛋白(ecad)、水通道蛋白

1(aqp1)、水通道蛋白

2(aqp2)、rab17、ras癌基因家族成员(rab17)、gata结合蛋白3(gata3)、含fxyd结构域的离子转运调节剂4(fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)、成员4(slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员81(aldh3b1)、醛脱氢酶1家族、成员a3(aldh1a3)和钙蛋白酶

8(capn8)和水通道蛋白

4(aqp4)。
[0148]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:水通道蛋白7(aqp7)、含fxyd结构域的离子转运调节剂2(fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)、成员3(slc17a3)、溶质载体家族3、成员1(slc3a1),紧密连接蛋白2(claudin 2)(cldn2)、napsin a天冬氨酸肽酶(napsa)、溶质载体家族2(促进葡萄糖转运蛋白(transporter))、成员2(slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(anpep)、跨膜蛋白27(tmem27)、酰基
辅酶a合成酶中链家族成员2(acyl

coa synthetase medium

chain family member 2)(acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(gpx3)、果糖

1,6

二磷酸酶1(fructose

1,6

biphosphatase 1)(fbp1)、丙氨酸

乙醛酸氨基转移酶2(alanine

glyoxylate aminotransferase 2)(agxt2)、血小板内皮细胞粘附分子(pecam)和膜蛋白(podn)。
[0149]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:pecam、vegf、kdr、hif1a、cd31、cd146、膜蛋白(podn)和肾病蛋白(neph)、趋化因子(c

x

c基序)受体4(cxcr4)、内皮素b型受体(ednrb)、胶原(collagen)、v型、α2(col5a2)、钙粘蛋白5(cdh5),纤溶酶原激活剂(plasminogen activator),组织(plat)、血管生成素2(angpt2)、激酶插入结构域蛋白受体(kdr)、分泌蛋白、酸性的、富含半胱氨酸的(ostectectin)(sparc)、丝甘蛋白聚糖(serglycin)(srgn)、timp金属肽酶抑制剂3(timp metallopeptidase inhibitor 3)(timp3)、肾母细胞瘤1(wilms tumor 1)(wt1)、无翼型mmtv整合位点家族、成员4(wnt4)、g蛋白信号转导4的调节剂(rgs4)、促红细胞生成素(epo)。
[0150]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:pecam、vegf、kdr、hif1a、膜蛋白、肾病蛋白、epo、ck7、ck8/18/19。
[0151]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:pecam、vegf、kdr、hif1a、cd31和cd146。
[0152]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:膜蛋白(podn)和肾病蛋白(neph)。
[0153]
在某些实施方案中,所述肾细胞群体包含表达一种或多种以下组合中的一种或多种细胞类型:pecam、vegf、kdr、hif1a和epo。
[0154]
在某些实施方案中,可以通过多种方法来分析样品或细胞群体中各种生物标志物的存在(例如表达)和/或水平/量,其中许多方法是本领域已知的,并且是技术人员所理解的,包括但不限于免疫组织化学(“ihc”)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、elisa、elifa、荧光激活细胞分选(“facs”)、massarray、蛋白质组学、生化酶活性测定、原位杂交、southern分析、northern分析、全基因组测序、聚合酶链反应(“pcr”),包括定量实时pcr(“qrt

pcr”)和其他扩增类型检测方法,诸如,例如,分支dna、sisba、tma等,rna

seq、fish、微阵列分析、基因表达谱分析,和/或基因表达的系列分析(“sage”),以及可以通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的多种分析中的任何一种。用于评估基因和基因产物状态的实验方案的非限制性示例包括northern印迹、southern印迹、蛋白质印迹、免疫印迹和pcr分析。在某些实施方案中,也可以使用多重免疫测定,诸如可从rules based medicine或meso scale discovery获得的免疫测定。
[0155]
在某些实施方案中,可以通过多种方法来分析样品或细胞群体中各种生物标志物的存在(例如表达)和/或水平/量,其中许多方法是本领域已知的,并且是技术人员所理解的,包括但不限于
“‑
组学(

omics)”平台,诸如全基因组转录组学、蛋白质组学、分泌组学、脂质组学、磷酸化组学(phospatomics)、外泌体组学(exosomics)等,其中高通量方法与计算生物学和生物信息学技术结合以阐明在被考虑的细胞群体表达和/或不表达的基因、mirna、蛋白质、分泌的蛋白质、脂质、微囊泡等完整的生物学特征(signature)。
[0156]
在某些实施方案中,检测肾细胞群体中两种或多种生物标志物的存在的方法包括
在允许该抗体与其同源配体(即,生物标志物)结合的条件下,使包含该群体的样品与针对生物标志物的抗体接触,并检测结合抗体的存在,例如,通过检测抗体和生物标志物之间是否形成复合物。在某些实施方案中,一种或多种生物标志物的存在的检测是通过免疫组织化学进行的。在某些实施方案中,检测微囊泡(诸如外泌体)中或微囊泡上生物标志物的存在的方法包括在允许该抗体与其同源配体(即,生物标志物)结合的条件下,使样品(例如,怀疑包含或被认为包含的样品)微囊泡与针对生物标志物的抗体接触,并检测结合抗体的存在,例如,通过检测抗体和生物标志物之间是否形成复合物。
[0157]
如本文所用,术语“检测”涵盖定量和/或定性检测。
[0158]
在某些实施方案中,生物标志物通过单克隆或多克隆抗体检测。
[0159]
在某些实施方案中,用允许检测本文公开的以下生物标志物的一种或多种试剂鉴定肾细胞群体,诸如aqp1、aqp2、aqp4、钙结合蛋白、钙调蛋白、cd117、cd133、cd146、cd24、cd31(pecam

1)、cd54(icam

1)、cd73、ck18、ck19、ck7、ck8、ck8/18、ck8/18/19、连接蛋白43、cubilin、cxcr4(融合素)、dba、e

钙粘蛋白(cd324)、epo(促红细胞生成素)、ggt1、glepp1(肾小球上皮蛋白1)、结合球蛋白、itgbl(整合素p)、kim

1(肾损伤分子

1)、t1m

1(t细胞免疫球蛋白和含mucirs的分子)、map

2(微管相关蛋白2)、巨蛋白、n

钙粘蛋白、肾病蛋白、nkcc(na

k

cl

共转运蛋白)、oat

1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、pan

钙粘蛋白、pclp1(类足细胞标志蛋白1分子)、膜蛋白、sma(平滑肌α

肌动蛋白)、突触足蛋白、thp(tamm

horsfall蛋白)、vinientin和/或αgst

1(α谷胱甘肽s

转移酶)。
[0160]
在某些实施方案中,细胞的来源与预定的靶器官或组织相同。在某些实施方案中,brc或src可源自肾脏,以用于将要施用于肾脏的制剂中。在某些实施方案中,细胞群体源自肾脏活组织检查。在某些实施方案中,细胞群体源自整个肾脏组织。在某些实施方案中,细胞群体源自哺乳动物肾细胞的体外培养物,其建立自肾脏活组织检查或整个肾脏组织。
[0161]
在某些实施方案中,brc或src包含异质混合物或生物活性的肾细胞的级分。在某些实施方案中,brc或src可以源自健康个体,或其本身是来自健康个体的肾细胞级分。在某些实施方案中,本文包括从不健康个体获得的肾细胞群体或级分,当与健康个体的肾细胞群体相比时(例如,在肾脏或其活组织检查中),其可能缺乏某些细胞类型。在某些实施方案中,本文提供了与健康个体相比缺乏细胞类型的治疗性活性细胞群体,以及由所述群体分泌的微囊泡(例如,外泌体)。还提供了检测此类细胞和微囊泡(例如,外泌体)的方法。在某些实施方案中,细胞群体从自体细胞群体中分离并扩增。
[0162]
在某些实施方案中,src通过肾脏活组织检查从来自患者的肾皮质组织的肾细胞的分离和扩增而获得。在某些实施方案中,通过酶消化,使用标准细胞培养技术扩增,并从扩增的肾细胞的密度边界、屏障或界面通过离心进行选择从肾组织中分离肾细胞。在某些实施方案中,通过酶消化,使用标准细胞培养技术扩增,并通过连续或不连续的单一或多步密度梯度离心从扩增的肾细胞中选择从肾组织中分离肾细胞。在某些实施方案中,src主要由肾上皮细胞组成,这些细胞已知其再生潜力。在某些实施方案中,其他实质(血管)和基质细胞可以存在于自体src群体中。
[0163]
在某些实施方案中,brc是天然参与肾修复和再生的再生肾细胞分离群体。在某些实施方案中,brc通过酶消化和使用标准细胞培养技术扩增从肾组织中分离的肾细胞获得。在某些实施方案中,细胞培养基可以设计成扩增具有再生能力的生物活性的肾细胞。在某
些实施方案中,细胞培养基不含任何分化因子。在某些实施方案中,在低氧条件下培养扩增的异质肾细胞群体,以进一步富集具有再生能力细胞的组成。不希望受理论束缚,这可能是由于以下现象中的一种或多种:1)在低氧培养期间选择性存活、死亡、或特定细胞组分的扩增;2)响应于低氧培养的细胞粒度和/或尺寸的改变,从而影响在密度梯度分离期间浮力密度和随后的定位的改变;和3)响应于低氧培养期间的细胞基因/蛋白质表达的改变,从而导致分离和扩增群体内细胞的差异特征。
[0164]
在某些实施方案中,通过在富集能够进行肾再生的细胞的培养条件下从肾脏组织(诸如从活组织检查获得的组织)分离和扩增肾细胞获得生物活性的肾细胞群体。
[0165]
在某些实施方案中,来自肾脏组织(诸如从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代1、2、3、4、5或更多次以产生扩增的生物活性的肾细胞(诸如富含能够肾脏再生的细胞的细胞群体)。在某些实施方案中,来自肾脏组织的肾细胞(诸如从活组织检查获得的组织)传代1次以产生扩增的生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,来自肾脏组织的肾细胞(诸如从活组织检查获得的组织)传代2次以产生扩增的生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,来自肾脏组织的肾细胞(诸如从活组织检查获得的组织)传代3次以产生扩增的生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,来自肾脏组织的肾细胞(诸如从活组织检查获得的组织)传代4次以产生扩增的生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,来自肾脏组织的肾细胞(诸如从活组织检查获得的组织)传代5次以产生扩增的生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了非生物活性的肾细胞的细胞群体。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了至少一种细胞类型的细胞群体。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了密度大于1.095g/ml的细胞的细胞群体。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了低粒度的小细胞的细胞群体。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了小于红细胞的细胞的细胞群体。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了具有直径小于6μm的细胞的细胞群体。在某些实施方案中,传代细胞消减了具有直径小于2μm的细胞的细胞群体。在某些实施方案中,传代所述细胞消减了比红细胞具有更低粒度的细胞的细胞群体。在某些实施方案中,在1次或多次传代后,所述细胞群体的活力增加。在某些实施方案中,当通过荧光激活的细胞分选(facs)分析细胞时使用小细胞和低粒度的描述,例如,使用散点图的x

y轴显示细胞所在的位置。
[0166]
在某些实施方案中,扩增的生物活性的肾细胞在缺氧条件下生长至少约6、9、10、12或24小时但少于48小时,或从6至9小时、或从6至48小时、或从约12至约15小时、或约8小时、或约12小时、或约24小时、或约36小时、或约48小时。在某些实施方案中,基于密度选择在低氧条件下生长的细胞。在某些实施方案中,生物活性的肾细胞群体是在扩增的肾细胞的连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离之后(例如,在低氧条件下传代和/或培养后)获得的src群体。在某些实施方案中,生物活性的肾细胞群体是通过在密度边界、屏障或界面离心分离扩增的肾细胞之后获得的src群体(例如,在低氧条件下传代和/或培养后)。在某些实施方案中,低氧培养条件是其中相对于标准培养条件(其中细胞在大气中的氧气水平(约21%)下培养),使细胞在培养系统中的可用氧气水平降低的培养条件。在某些实施方案中,在低氧培养条件下培养的细胞在约5%至约15%、或约5%至约10%、或约2%至约5%、或约2%至约7%、或约2%或约3%、或约4%、或约5%的氧水平下培养。在某些实施方案中,src显示出大于约1.0419g/ml的浮力密度。在某些实施方案中,src显示出大于约1.04g/ml的浮力密度。在某些实施方案中,src显示出大于约1.045g/ml的浮力密度。在某些
实施方案中,与起始肾细胞群体相比,brc或src含有更大百分比的一个或多个细胞群体,并且缺乏或欠缺一个或多个其他细胞群体。
[0167]
在某些实施方案中,可以对扩增的生物活性的肾细胞进行密度梯度分离以获得src。在某些实施方案中,对brc进行低氧培养条件和密度梯度分离以获得src。在某些实施方案中,连续或不连续的单步或多步密度梯度离心用于基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中,可以通过在密度边界、屏障或界面离心来分离扩增的生物活性的肾细胞以获得src。在某些实施方案中,使用跨密度边界或界面的离心来分离基于细胞浮力密度收获的肾细胞群体。在某些实施方案中,通过部分使用optiprep(axis

shield)培养基产生src,所述optiprep(axis

shield)培养基包含60%(w/v)的非离子碘化化合物碘克沙醇在水中的溶液。然而,本领域技术人员将认识到其他培养基、密度梯度(连续或不连续)、密度边界、屏障、界面或其他方式,例如,使用本领域已知的细胞表面标志物进行免疫分离,包括用于分离本文所述的细胞群的必要特征,可用于获得生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.04g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.04g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.0419g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.0419g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.045g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.045g/ml的浮力密度的细胞。
[0168]
在某些实施方案中,细胞浮力密度用于获得src群体和/或确定肾细胞群体是否为生物活性的肾细胞群体。在某些实施方案中,细胞浮力密度用于分离生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,通过单步optiprep(7%碘克沙醇;optimem中60%(w/v))密度界面(单步不连续密度梯度)离心来确定细胞浮力密度。optiprep是在水中碘克沙醇的60%w/v溶液。当用于示例性密度界面或单步不连续密度梯度中时,将optiprep用optimem(细胞培养基础培养基)稀释,以形成7%碘克沙醇的最终溶液(在水和optimem中)。optimem的配方是eagle最小必需培养基的改良,用hepes和碳酸氢钠缓冲,并补充有次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、l

谷氨酰胺(l

glutamine)或glutamax、微量元素和生长因子。蛋白质水平极低(15μg/ml),胰岛素和转铁蛋白是仅有的蛋白质补充剂。所含酚红的浓度降低,作为ph指示剂。在某些实施方案中,在使用之前,optimem可以补充有2

巯基乙醇。
[0169]
在某些实施方案中,在使用前制备optiprep溶液并测量指示所需密度的折射率(r.i.1.3456 /

0.0004)。在某些实施方案中,肾细胞在溶液的顶部分层。在某些实施方案中,将密度界面或单步不连续密度梯度在室温下在离心管(例如,50ml锥形管)或细胞处理器(例如,cobe 2991)中以800g离心20分钟(无制动)。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.04g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.04g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.0419g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.0419g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.045g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.045g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,在评估细胞密度或基于密度的选择之
前,将细胞培养直至它们至少融合50%,并在设置为37℃、5%co2环境中2%氧气的低氧培养箱中温育过夜(例如,至少约8或12小时)。
[0170]
在某些实施方案中,将从肾脏样品获得的细胞扩增,然后进行处理(例如,通过低氧和离心分离)以提供src群体。在某些实施方案中,使用本文所述的试剂和程序产生src群体。在某些实施方案中,在将群体中的细胞施用于受试者之前,测试来自src群体的细胞样品的存活力。在某些实施方案中,在将所述群体的细胞施用于受试者之前,测试来自src群体的细胞样品中本文公开的一种或多种标志物的表达。
[0171]
在某些实施方案中,通过包括以下的过程产生src:扩增原代肾细胞(例如,通过1、2、3、4、5或更多次传代),在低氧条件下培养扩增的肾细胞,然后将细胞与肾毒素(nephrotoxin)(诸如碘克沙醇,例如,7%的碘克沙醇)接触。在某些实施方案中,通过包括以下的过程产生src:扩增原代肾细胞(例如,通过1、2、3、4、5或更多次传代),在低氧条件下培养扩增的肾细胞,然后选择具有如本文所公开的密度梯度的细胞。在某些实施方案中,通过包括以下的过程产生src:扩增原代肾细胞(例如,通过1、2、3、4、5或更多次传代),在低氧条件下培养扩增的肾细胞,然后从细胞中富集肾小管细胞和/或从低氧条件下培养的扩增细胞中消减血管或集合管细胞。
[0172]
在美国专利申请公开no.2017/0281684a1中公开了用于制备src的组合物和制备方法的非限制性实例,其全部内容通过引用并入本文。
[0173]
在某些实施方案中,brc或src源自天然的自体或同种异体肾脏样品。在某些实施方案中,brc或src源自非自体肾脏样品。在某些实施方案中,样品可以通过肾脏活组织检查获得。
[0174]
在某些实施方案中,肾细胞分离和扩增提供肾细胞类型的混合物,包括肾上皮细胞和基质细胞。在某些实施方案中,通过连续或不连续的密度梯度分离的扩增的肾细胞来获得src。在某些实施方案中,密度梯度分离的src群体中的主要细胞类型为肾小管上皮表型。在某些实施方案中,通过在密度边界、屏障或界面离心分离扩增的肾细胞而获得src。在某些实施方案中,在密度边界/屏障/界面分离的src群体中的主要细胞类型是肾小管上皮表型。在某些实施方案中,使用多管齐下的(multi

pronged)方法评估获自扩增的肾细胞的src的特征。在某些实施方案中,在肾细胞扩增过程中监测细胞形态学、生长动力学和细胞活力。在某些实施方案中,src浮力密度和活力通过在密度梯度培养基上或通过密度梯度培养基进行离心和台盼蓝排除法表征。在某些实施方案中,src表型通过流式细胞术表征,src功能通过vegf和kim

1的表达表明。在某些实施方案中,还可以通过测量两种特定的酶的活性来评估src、预制剂的细胞功能;在肾脏近端小管中发现ggt(γ

谷氨酰转肽酶)和lap(亮氨酸氨基肽酶)。
[0175]
在某些实施方案中,可利用通过密度培养基(大小和粒度)有助于分离细胞亚群的细胞特征通过流式细胞术(前向散射=通过流式细胞术反映大小,侧面散射=反映粒度)来分离细胞亚群。在某些实施方案中,密度梯度或分离培养基应对感兴趣的特定细胞具有低毒性。在某些实施方案中,虽然密度培养基应对感兴趣的特定细胞具有低毒性,但本公开涵盖了在感兴趣的细胞的选择过程中起作用的培养基的使用。在某些实施方案中,并且不希望被理论所束缚,似乎由包含碘克沙醇的培养基恢复的本文公开的细胞群体是碘克沙醇抗性的,因为在上样和恢复步骤之间存在明显的细胞损失,表明在密度梯度或密度边界、密
度、屏障或密度界面的条件下暴露于碘克沙醇中会导致某些细胞的消除。在某些实施方案中,在碘克沙醇密度梯度或密度界面分离后出现的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度或界面暴露的任何不利影响具有抵抗力。在某些实施方案中,包含轻度至中度肾毒素的造影剂用于分离和/或选择细胞群体,例如src群体。在某些实施方案中,“轻度”肾毒素是当细胞在补充有7%w/v的肾毒素的标准培养基制剂中培养12小时时杀死不超过10%的原代肾细胞的肾毒素,通过标准的活/死染料排除细胞活力测定评估。在某些实施方案中,src是碘克沙醇抗性的。在某些实施方案中,密度培养基不应与人血浆中的蛋白质结合或不利地影响感兴趣的细胞的关键功能。
[0176]
在某些实施方案中,已经使用荧光激活细胞分选(facs)使细胞群体富集和/或消减一种或多种肾细胞类型。在某些实施方案中,可以使用bd facsaria
tm
或等同物富集和/或消减肾细胞类型。在某些实施方案中,可以使用facsaria iii
tm
或等同物富集和/或消减肾细胞类型。
[0177]
在某些实施方案中,已经使用磁性细胞分选富集和/或消除了一种或多种肾细胞类型的细胞群。在某些实施方案中,可以使用miltenyi auto系统或等同物富集和/或消减一种或多种肾细胞类型。
[0178]
在某些实施方案中,肾细胞群体已经进行了三维培养。在某些实施方案中,培养细胞群体的方法是通过连续灌注。在某些实施方案中,与静态培养的细胞群体相比,通过三维培养和连续灌注培养的细胞群体表现出更大的细胞性(cellularity)和互连性(interconnectivity)。在某些实施方案中,与此类细胞群体的静态培养物相比,通过三维培养和连续灌注培养的细胞群体表现出更高的epo表达,以及肾小管相关基因(诸如e

钙粘蛋白)的增强表达。在某些实施方案中,与静态培养的细胞群体相比,通过连续灌注培养的细胞群体表现出更高水平的葡萄糖和谷氨酰胺消耗。
[0179]
在某些实施方案中,低氧或缺氧条件可用于制备本文提供的细胞群体的方法中。在某些实施方案中,可以使用制备细胞群体的方法而无需低氧调节的步骤。在某些实施方案中,可以使用常氧条件。
[0180]
在某些实施方案中,已经从肾脏组织分离和/或培养了肾细胞群体。本文公开了用于分离和分离肾细胞组分的方法的非限制性实例,例如,富集将用于治疗用途的制剂中的细胞群体,所述治疗用途包括治疗肾脏疾病、贫血、epo缺陷、肾小管转运缺陷和肾小球过滤缺陷。在某些实施方案中,细胞群体是从新鲜消化的,即机械地或酶促消化的肾脏组织,或从哺乳动物肾细胞的异质体外培养物中分离的。
[0181]
在某些实施方案中,肾细胞群体包含产生epo的肾细胞。在某些实施方案中,受试者患有贫血和/或epo缺陷。在某些实施方案中,特征在于epo表达和对氧气的生物响应性的产生epo的肾细胞群体,使得培养系统的氧张力降低导致诱导epo表达。在某些实施方案中,产生epo的细胞群体富含产生epo的细胞。在某些实施方案中,当与在可用氧的正常大气(约21%)水平下培养的细胞群体相比,在细胞经受培养系统中可用氧水平降低的条件下培养细胞群体时,诱导epo表达。在某些实施方案中,相对于在正常氧气条件下培养的产生epo的细胞,在较低氧气条件下培养的产生epo的细胞表达更高水平的epo。通常,在降低水平的可用氧培养细胞(也称为低氧培养条件)是指相对于在正常大气水平可用氧培养细胞(也称为正常或常氧培养条件),降低的氧气水平降低。在某些实施方案中,低氧细胞培养条件包括
在约少于1%的氧气、约少于2%的氧气、约少于3%的氧气、约少于4%的氧气或约少于5%的氧气下培养细胞。在某些实施方案中,培养条件包括在约10%氧气、约12%氧气、约13%氧气、约14%氧气、约15%氧气、约16%氧气、约17%氧气、约18%氧气、约19%氧气、约20%的氧气或约21%氧气下培养细胞。
[0182]
在某些实施方案中,获得了epo的诱导或增加的表达,并且可以通过在约少于5%的可用氧下培养细胞并将epo表达水平与在大气(约21%)的氧气下培养的细胞进行比较来观察。在某些实施方案中,通过包括第一培养阶段和第二培养阶段的方法在能够表达epo的细胞培养物中获得epo的诱导,在所述第一培养阶段中,将细胞培养物在大气氧(约21%)下培养一段时间,在所述第二培养阶段中,可用氧水平降低,并且将相同细胞以少于约5%的有效氧进行培养。在某些实施方案中,响应于低氧条件的epo表达由hif1α调节。在某些实施方案中,本领域已知的其他氧气操纵培养条件可以用于本文所述的细胞。
[0183]
在某些实施方案中,所述制剂含有产生epo的哺乳动物细胞的富集群体,其特征在于对灌注条件的生物响应性(例如,epo表达)。在某些实施方案中,灌注条件包括瞬时的、间歇的或连续的流体流动(灌注)。在某些实施方案中,当将培养细胞的培养基间歇地或连续地循环或搅动时,epo的表达是机械诱导的,以这样的方式,动力通过流动转移到细胞。在某些实施方案中,经历瞬时的、间歇的或连续的流体流动的细胞以这样的方式培养:它们以三维结构的形式存在于为此类三维结构的形成提供框架和/或空间的材料内或材料上。在某些实施方案中,将细胞培养在多孔珠上,并通过摇动平台、绕动平台或旋转瓶的方式进行间歇的或连续的流体流动。在某些实施方案中,将细胞在三维支架上培养并置于支架是固定的装置中,且流体定向流过或穿过支架。本领域普通技术人员将理解,本领域已知的其他灌注培养条件可以用于本文所述的细胞。
[0184]
在某些实施方案中,细胞群体源自肾脏活组织检查。在某些实施方案中,细胞群体源自整个肾脏组织。在某些实施方案中,细胞群体源自哺乳动物肾细胞的体外培养物,其建立自肾脏活组织检查或整个肾脏组织。在某些实施方案中,肾细胞群体是src群体。在某些实施方案中,细胞群体是未分级的细胞群体,在本文中也称为非富集的细胞群体。
[0185]
本文包括含有多种活性剂(例如,除了肾细胞或微囊泡之外)的组合物。在某些实施方案中,本文提供的微囊泡(例如,外泌体)包含存在于分泌微囊泡(例如,外泌体)的肾细胞群体的培养基中的化合物。在某些实施方案中,本文提供的微囊泡(例如,外泌体)包含存在于分泌微囊泡(例如,外泌体)的肾细胞群体中的化合物。
[0186]
合适的活性剂的非限制性实例包括但不限于细胞聚集体、非细胞生物材料、来自生物活性的细胞的分泌产物、大分子和小分子治疗剂及其组合。例如,一种类型的生物活性的细胞可以与具有或不具有治疗分子的基于生物材料的微载体或另一种类型的生物活性的细胞结合。在某些实施方案中,未附着的细胞可以与非细胞颗粒结合。
[0187]
在某些实施方案中,肾细胞群体的细胞在球状体内。在某些实施方案中,肾细胞群体以球状体形式。在某些实施方案中,将包含生物活性的肾细胞的球状体施用于受试者。在某些实施方案中,球状体包含至少一种非肾细胞类型或细胞群体。在某些实施方案中,产生球状体的方法包括:(i)合并生物活性的肾细胞群体和非肾细胞群体,和(ii)在包含旋转瓶的三维培养系统中培养生物活性的肾细胞体和非肾细胞群体,直到形成球状体。
[0188]
在某些实施方案中,非肾细胞群体包含内皮细胞群体或内皮祖细胞群体。在某些
实施方案中,生物活性的细胞群体是内皮细胞群体。在某些实施方案中,内皮细胞群体是细胞系。在某些实施方案中,内皮细胞群体包含人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell)(huvec)。在某些实施方案中,非肾细胞群体是间充质干细胞群体。在某些实施方案中,非肾细胞群体是造血、乳腺、肠、胎盘、肺、骨髓、血液、脐带、内皮、牙髓、脂肪、神经、嗅觉、神经嵴或睾丸起源的干细胞群体。在某些实施方案中,非肾细胞群体是脂肪来源的祖细胞群体。在某些实施方案中,细胞群体是异种的、同基因的(syngeneic)、同种异体的、自体的或其组合。在某些实施方案中,以0.1:9.9至9.9:0.1的比例培养生物活性的肾细胞群体和非肾细胞群体。在某些实施方案中,以约1:1的比例培养生物活性的肾细胞群体和非肾细胞群体。在某些实施方案中,将肾细胞群体和生物活性的细胞群体悬浮在生长培养基中。
[0189]
扩增的生物活性的肾细胞可以进一步经历连续或不连续的密度培养基分离以获得src。具体而言,连续或不连续的单步或多步密度梯度离心用于基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中,可以通过在密度边界、屏障或界面离心而使扩增的生物活性的肾细胞进一步经历分离以获得src。具体而言,通过密度边界、屏障或界面的离心可基于细胞浮力密度用于分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中,通过部分使用optiprep(axis

shield)培养基产生src,所述optiprep(axis

shield)培养基包含60%(w/v)的非离子碘化化合物碘克沙醇在水中的溶液。然而,本领域技术人员将认识到,任何密度梯度培养基都不受特定培养基或其他方式的限制,例如,使用本领域已知的细胞表面标志物进行免疫分离,根据本公开内容,可以使用包含用于分离本公开的细胞群体的必要特征。例如,可以使用[已经用聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)(pvp)涂覆的直径15

30nm的硅胶(colloidal silica)颗粒(在水中23%w/w)]或蔗糖形成密度梯度或密度边界。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.04g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.04g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.0419g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.0419g/ml的浮力密度的细胞。在某些实施方案中,离心后收集表现出大于约1.045g/ml的浮力密度的细胞级分作为独特的沉淀。在某些实施方案中,排除并去除维持小于1.045g/ml的浮力密度的细胞。
[0190]
在某些实施方案中,本公开的治疗组合物及其制剂可含有(i)肾细胞的分离的、异质群体,其富含特定的生物活性成分或细胞类型和/或消减了特定的非活性或不需要的成分或细胞类型,和/或(ii)由此类细胞分泌的微囊泡(例如,外泌体)用于治疗肾脏疾病,即提供肾脏功能和/或结构的稳定和/或改善和/或再生。在presnell et al.u.s.8,318,484和ilagan et al.pct/us2011/036347和jain et al.pct/us2016/044866中先前描述了用于提供此类稳定和/或改善细胞的非限制性实例,每一个的全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中,本文提供的组合物可含有与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗特性的分离的肾细胞级分,即提供肾功能的稳定和/或改善和/或再生。在某些实施方案中,本文所述的细胞群体、细胞级分和/或细胞的分泌产物可源自本文所述的健康个体、患有肾脏疾病的个体或受试者。
[0191]
在某些实施方案中,细胞的来源与预定的靶器官或组织相同。例如,brc和/或src可源自肾脏,以用于将要施用于肾脏的制剂中。在某些实施方案中,细胞群体源自肾脏活组
织检查。在某些实施方案中,细胞群体源自整个肾脏组织。在某些实施方案中,细胞群体源自哺乳动物肾细胞的体外培养物,其建立自肾脏活组织检查或整个肾脏组织。在某些实施方案中,brc和/或src包含异质混合物或生物活性的肾细胞的级分。brc和/或src可以源自健康个体,或其本身是来自健康个体的肾细胞级分。另外,本公开提供了从不健康个体获得的肾细胞级分,当与健康个体的相应肾细胞级分相比时,所述不健康个体可能缺乏某些细胞成分,但仍保留治疗特性。本公开还提供了与健康个体相比缺乏细胞成分的治疗活性细胞群体,在某些实施方案中,细胞群体可以从各种疾病状态的自体来源分离并扩增。
[0192]
在某些实施方案中,src通过肾脏活组织检查从来自患者的肾皮质组织的肾细胞的分离和扩增而获得。通过酶消化,使用标准细胞培养技术扩增,通过在扩增的肾细胞的密度边界、屏障或界面通过离心进行选择从肾组织中分离肾细胞。在该实施方案中,src主要由肾小管上皮细胞组成,所述肾小管上皮细胞已知其再生潜力(bonventre jv.dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.j am soc nephrol.2003;14(suppl.1):s55

61;humphreys bd,czerniak s,dirocco dp,et al.repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.pnas.2011;108:9226

31;humphreys bd,valerius mt,kobayashi a,et al.intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.cell stem cell.2008;2:284

91)。其他实质(血管)和基质细胞可以存在于自体src群体中。在某些实施方案中,通过连续或不连续的单步或多步梯度离心来选择肾细胞。
[0193]
本文包括治疗组合物,其包含囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)和所选择的肾细胞。在某些实施方案中,囊泡和细胞的组合提供了受试者中肾功能的稳定和/或改善和/或修复和/或再生。治疗性能可包括修复或再生作用。
[0194]
在某些实施方案中,细胞是遗传修饰的(例如,基因组修饰的和/或通过rnai修饰的)免疫特权的(immunoprovileged)brc(诸如src)。
[0195]
在某些实施方案中,从遗传修饰的(例如,基因组修饰的和/或通过rnai修饰的)免疫特权的brc(诸如src)获得囊泡。
[0196]
在某些实施方案中,遗传修饰的brc是基因组修饰的brc(即,在其基因组中具有遗传修饰的brc)。在某些实施方案中,遗传修饰的brc包含外源多核苷酸(诸如质粒或病毒载体),其表达降低brc中基因组免疫原性基因的表达的rna干扰(rnai)分子。在某些实施方案中,rnai分子是短干扰或短发夹rna分子。在某些实施方案中,所述方法包括在brc中遗传修饰基因组免疫原性基因。
[0197]
在某些实施方案中,基因编码主要组织相容性复合物(mhc)i类分子或mhc ii类分子中的蛋白质。在某些实施方案中,所述基因是β

2微球蛋白(b2m也称为β2m)、人白细胞抗原(hla)

a、hla

b、hla

c、hla

dra、hla

drb1、hla

drb3、hla

drb4、hla

drb5、hla

dpa1、hla

dpa2、hla

dqa1或hla

dqb1基因。
[0198]
在某些实施方案中,所述基因编码次要组织相容性抗原(miha或mha)。在某些实施方案中,所述基因是ha

1、ha

2、ha

8、hb

1、hy

a1、hy

a2、hy

b7、hy

b8、hy

b60或hy

dq5基因。
[0199]
在某些实施方案中,本文提到的hla基因、b2m或mha基因的任何等位基因变体可以被修饰(例如,缺失)或用rna干扰靶向。
[0200]
在某些实施方案中,遗传修饰基因包括突变基因。在某些实施方案中,突变所述基因包括缺失所述基因或其一部分。
[0201]
在某些实施方案中,遗传修饰细胞包括突变以下两种或更多种的任意组合:b2m、hla

a、hla

b、hla

c、hla

dra、hla

drb1、hla

drb3、hla

drb4、hla

drb5、hla

dpa1、hla

dpa2、hla

dqa1和/或hla

dqb1基因。
[0202]
在某些实施方案中,遗传修饰的brc是遗传修饰的原代肾细胞。在某些实施方案中,遗传修饰的原代肾细胞在遗传修饰之前或之后传代至少约1、2、3、4、5或更多次。在某些实施方案中,所述方法进一步包括从遗传修饰的brc获得src。在某些实施方案中,获得src,然后进行遗传修饰。
[0203]
在某些实施方案中,brc是src。本文公开了src的各种非限制性实例。在某些实施方案中,在brc群体中对brc进行了遗传修饰,其中少于brc群体中的所有细胞成为经遗传修饰的。在某些实施方案中,该方法进一步包括从brc群体中分离或富集经遗传修饰的brc。在某些实施方案中,该方法进一步包括从src群体中分离或富集经遗传修饰的src。在某些实施方案中,对brc群体(例如,src)进行遗传修饰以产生其中一些细胞被遗传修饰而其他细胞未被遗传修饰的brc群体。在某些实施方案中,一些经遗传修饰的细胞对于修饰是纯合的。在某些实施方案中,一些经遗传修饰的细胞对于修饰是杂合的。在某些实施方案中,富集或选择对于修饰是纯合的细胞。在某些实施方案中,富集或选择对于修饰是杂合的细胞。在某些实施方案中,富集或选择对于修饰是纯合或杂合的细胞。在某些实施方案中,修饰是减少该基因编码的蛋白质表达的突变。在某些实施方案中,突变降低了经修饰细胞表面上蛋白质的水平。在某些实施方案中,表达蛋白质的细胞被消减或排除。在某些实施方案中,该突变降低了细胞表面上的mhc i类分子和/或mhc ii类分子的水平。在某些实施方案中,具有突变的细胞在其表面上不具有mhc i类分子和/或mhc ii类分子。在某些实施方案中,在其表面上表达mhc i类分子的细胞被消减或排除。在某些实施方案中,在其表面上表达mhc ii类分子的细胞被消减或排除。在某些实施方案中,细胞分选方法用于从群体中去除表达蛋白质、mhc i类分子和/或mhc ii类分子的细胞。在某些实施方案中,细胞分选方法包含与蛋白质、mhc i类分子和/或mhc ii类分子结合的试剂(诸如抗体)。在某些实施方案中,细胞的消减或选择包括珠子/抗体偶联,以拉出细胞表面具有某些蛋白质的细胞。在某些实施方案中,细胞分选方法是磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。在某些实施方案中,选择用于遗传修饰的基因是一种其蛋白质在细胞表面表达的基因,因此facs和/或macs技术可以区分(例如,基于与表面结合的抗体)活细胞。在某些实施方案中,mac用于从不表达mhc分子的细胞中除去表达mhc分子(诸如mhc i类分子或mhc ii类分子)的细胞。在某些实施方案中,整合或非整合载体可用于表达另一种hla组分多肽,以进一步修饰或调节适应性或先天性免疫系统,例如,以防止天然杀伤(nk)细胞的靶向和裂解。
[0204]
在某些实施方案中,遗传修饰(例如,突变)基因包括:(i)在brc中表达基因编辑蛋白;或(ii)穿过brc的细胞膜递送基因编辑蛋白。在某些实施方案中,基因编辑蛋白是锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应物核酸酶(transcription activator

like effector nuclease)(talen)、megatal或rna引导的内切核酸酶。在某些实施方案中,rna引导的内切核酸酶是cas蛋白。在某些实施方案中,cas蛋白是cas9蛋白。在某些实施方案中,遗传修饰基因进一步包括:(i)在brc中表达引导单引导rna(grna);或(ii)穿过brc的细胞膜递送引
导单引导rna(grna)。在某些实施方案中,cas9蛋白和grna是核糖核蛋白(ribonucleoprotein)复合物的一部分。
[0205]
在某些实施方案中,遗传修饰基因减少了细胞表面上mhc i类的量。在某些实施方案中,遗传修饰基因减少了细胞表面上mhc ii类的量。在某些实施方案中,该方法包括遗传修饰两个或更多个基因,其中至少一个基因编码mhc i类分子内的蛋白质,并且至少一个基因编码mhc ii类分子内的蛋白质。在某些实施方案中,至少一个基因是hla基因。
[0206]
关于遗传修饰brc,包括产生方法的非限制性描述,在2018年6月21日提交的pct申请pct/us18/38801中描述。
[0207]
在某些实施方案中,细胞的来源与来自相同或不同来源的预定的靶器官或组织相同。例如,brc和/或src可源自肾脏,以用于将要施用于肾脏(与囊泡一起或与囊泡分开)的制剂中。在某些实施方案中,brc和/或src可源自肾脏,以用于产生将要施用于肾脏的囊泡。在某些实施方案中,细胞群体源自肾脏活组织检查。在某些实施方案中,细胞群体源自整个肾脏组织。在某些实施方案中,细胞群体源自哺乳动物肾细胞的体外培养物,其建立自肾脏活组织检查或整个肾脏组织。在某些实施方案中,brc和/或src包含遗传修饰的(例如,基因组修饰的和/或通过rnai修饰的)免疫特权的生物活性的肾细胞的异质混合物或级分。brc和/或src可以源自健康个体,或其本身是来自健康个体的肾细胞级分。另外,本发明提供了从不健康个体获得的肾细胞级分,当与健康个体的相应肾细胞级分相比时,所述不健康个体可能缺乏某些细胞成分,但仍保留治疗特性。本发明还提供了与健康个体相比缺乏细胞成分的治疗活性细胞群体,在一个实施方案中,细胞群体可以从各种哺乳动物来源的肾脏中分离并扩增。
[0208]
在某些实施方案中,src通过肾脏活组织检查从来自不同患者的肾皮质组织的肾细胞的分离和扩增而获得。在某些实施方案中,通过酶消化,使用标准细胞培养技术扩增,并通过密度梯度离心从扩增的肾细胞中选择从肾组织中分离肾细胞。在某些实施方案中,src主要由肾上皮细胞组成,这些细胞已知其免疫特权和再生潜力。其他实质(血管)和基质细胞可以稀少地存在于src群体中。
[0209]
如本文所述,本发明部分地基于令人惊讶的发现,异质肾细胞群体的某些亚级分,其富含生物活性组分并且消减了无活性或不需要的组分,相比于起始群体提供优异的治疗和再生结果。
[0210]
在某些实施方案中,肾细胞分离和扩增提供肾细胞类型的混合物,包括肾上皮细胞和基质细胞。在某些实施方案中,通过密度梯度分离的扩增的肾细胞来获得src。在某些实施方案中,密度梯度分离的src群体中的主要细胞类型为肾小管上皮表型。在某些实施方案中,src表型通过流式细胞术表征,src功能通过vegf和kim

1的表达表明。
[0211]
本领域普通技术人员将理解,本领域已知的其他分离和培养方法可用于本文所述的细胞。本领域普通技术人员还将理解,生物活性的细胞群体可以源自除上文具体列出的那些之外的来源,包括但不限于肾脏、体液和脂肪以外的组织和器官。
[0212]
src表型
[0213]
在某些实施方案中,将由src和/或src分泌的微囊泡(例如,外泌体)施用于具有肾脏疾病或有患肾脏疾病风险的受试者。
[0214]
在某些实施方案中,通过使用流式细胞术表达分析肾细胞标志物来监测细胞表
型。细胞的表型分析是基于使用针对待分析细胞类型特异的抗原标志物的使用。流式细胞术分析提供了表达待分析抗原标志物的样品群体中的细胞的定量测量。
[0215]
文献中已经报道了多种标志物,其用于肾小管上皮细胞的表型表征:(i)细胞角蛋白;(ii)转运膜蛋白(水通道蛋白和cubilin);(iii)细胞结合分子(粘蛋白(adherin)以及分化簇和凝集素);和(iv)代谢酶(谷胱甘肽和γ

谷氨酰转肽酶(ggt))。(表1)由于源自全肾消化物的培养物中发现的大多数细胞是上皮细胞和内皮细胞,因此所检测的标志物集中于特异性针对这两种群体的蛋白的表达。
[0216]
表1用于src表征的表型标志物
[0217][0218]
表2提供了src群体中表型的所选择的标志物、范围和平均百分比值以及其选择的原理(rationale)。
[0219]
表2选择的用于src的表型分析的标志物
[0220][0221]
细胞功能
[0222]
src活跃地分泌蛋白质,其可以通过分析条件培养基来检测。通过细胞代谢prestoblue和分泌vegf(血管内皮生长因子)和kim

1(肾损伤分子

1)的能力来评估细胞功能。
[0223]
表3呈现了来自肾细胞和src培养物的条件培养基中存在的vegf和kim

1的量。肾细胞培养至接近汇合。测试过夜暴露于肾细胞培养物的条件培养基的vegf和kim

1。
[0224]
表3由人肾细胞和src产生的vegf和kim
‑1[0225][0226]
src酶活性
[0227]
还可以通过测量两种特定的酶的活性来评估src、预制剂的细胞功能;在肾脏近端小管中发现ggt(γ

谷氨酰转肽酶)和lap(亮氨酸氨基肽酶)。
[0228]
尽管本文描述了微囊泡(例如,外泌体)和所选择的肾细胞组合物,但是本发明涵盖了含有多种其他活性剂的组合物。其他合适的活性剂包括但不限于细胞聚集体、非细胞生物材料、大分子和小分子治疗剂及其组合。例如,一种类型的生物活性细胞可以与具有或不具有治疗分子的基于生物材料的微载体结合,或者另一种类型的生物活性细胞,未附着的细胞可以与非细胞微粒结合。
[0229]
细胞聚集体
[0230]
在一个方面,本公开的制剂含有细胞聚集体或球状体和/或由此类聚集体或球状体分泌的微囊泡(例如,外泌体)和/或由不在聚集体或球状体中的生物活性的细胞分泌的微囊泡(例如,外泌体)。
[0231]
在某些实施方案中,细胞聚集体包含本文所述的生物活性的细胞群体。在某些实施方案中,细胞聚集体包含生物活性的肾细胞,诸如,例如肾细胞混合物、富集的肾细胞群体,以及肾细胞级分和肾细胞混合物与间充质干细胞的组合、内皮祖细胞、源自脂肪的基质
血管级分的细胞,或无限制的任何其他非肾细胞群体。
[0232]
在某些实施方案中,本公开的生物活性的肾细胞可以以如本文进一步所述的3d形式培养。在某些实施方案中,术语“类器官”指具有表型和/或功能的细胞积累,其概括了天然肾脏的各个方面。在某些实施方案中,类器官包含通常在体内在给定组织中发现的多种谱系的细胞的混合群体。在某些实施方案中,本公开的类器官通过任何方式在体外形成,由此本公开的细胞形成聚集体,其继而可以形成球状体、类器官或其组合。在某些实施方案中,此类聚集体、球状体或类器官具有与特定器官一致的结构。在某些实施方案中,此类聚集体、球状体或类器官表达表面标志物,其通常由特定器官的细胞表达。在某些实施方案中,此类聚集体、球状体或类器官产生通常由特定器官的细胞表达的化合物或材料。在某些实施方案中,可以在天然底物(例如,明胶)上培养本公开的细胞。在某些实施方案中,可以在合成底物(例如,plga)上培养本公开的细胞。
[0233]
生物材料
[0234]
多种生物材料可以与活性剂组合以提供本公开的治疗制剂。在某些实施方案中,生物材料可以是任何合适的形状(例如,珠子)或形式(例如,液体、凝胶等)。聚合物基质形式的合适的生物材料描述于bertram等人,美国公开申请20070276507(通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中,可将聚合物基质或支架成形为任意数量的所需构型,以满足任意数量的整体系统、几何形状或空间限制。在某些实施方案中,生物材料为液体悬浮液的形式。在某些实施方案中,本公开的基质或支架可以是三维的并且成形为符合器官或组织结构的维度和形状。例如,在聚合物支架用于治疗肾脏疾病、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的用途中,可以使用三维(3

d)基质来概括天然肾脏组织结构和组织的各个方面或全部以及肾实质。
[0235]
可以使用各种不同形状的3

d支架。自然地,可以将聚合物基质成形为不同的尺寸和形状,以适应不同尺寸的患者。聚合物基质还可以以其他方式成形以适应患者的特殊需要。在某些实施方案中,聚合物基质或支架可以是生物相容的材料(诸如多孔聚合物支架)。所述支架可由多种合成或天然存在的材料形成,包括但不限于开孔聚乳酸纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯(fluorinated polyethylene)、酚醛树脂(phenolic)、聚
‑4‑
甲基戊烯(poly
‑4‑
methylpentene)、聚丙烯腈(polyacrylonitrile)、聚酰胺(polyamide)、聚酰胺酰亚胺(polyamideimide)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、聚苯并恶唑(polybenzoxazole)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚氰基芳基醚(polycyanoarylether)、聚酯(polyester)、聚酯碳酸酯(polyestercarbonate),聚醚、聚醚醚酮(polyetheretherketone)、聚醚酰亚胺(polyetherimide)、聚醚酮(polyetherketone)、聚醚砜(polyethersulfone)、聚乙烯、聚氟烯烃(polyfluoroolefin)、聚酰亚胺(polyimide)、聚烯烃(polyolefin)、聚恶二唑(polyoxadiazole)、聚苯醚(polyphenylene oxide)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide)、聚丙烯、聚苯乙烯(polystyrene)、聚硫化物(polysulfide)、聚砜(polysulfone)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene)、聚硫醚(polythioether)、聚三唑(polytriazole)、聚氨酯(polyurethane)、聚乙烯基(polyvinyl)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)、再生纤维素、硅树脂(silicone)、脲醛(urea

formaldehyde)、胶原、明胶、藻酸盐、层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白、蚕丝(silk)、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或其共聚物或物理混合物。支架构
型范围可以从软的多孔支架到刚性的,形状保持的多孔支架。在某些实施方案中,支架配置为能够变成水凝胶的液体溶液,例如高于熔化温度的水凝胶。
[0236]
在某些实施方案中,支架源自人或动物来源的现存肾脏或其他器官,其中通过应用本领域普通技术人员已知的洗涤剂和/或其他化学试剂和/或其他酶和/或物理方法已消除了天然细胞群体。在该实施方案中,源器官的天然三维结构与所有相关的细胞外基质组分一起保留在其天然的生物活性环境中。在某些实施方案中,支架是源自人或动物肾脏或其他器官的细胞外基质。在某些实施方案中,通过应用三维生物打印方法将构型组装成组织状结构。在某些实施方案中,该构型是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
[0237]
在某些实施方案中,生物材料是水凝胶。水凝胶可以由多种聚合物材料形成,并且可用于多种生物医学应用中。水凝胶在物理上可以描述为亲水性聚合物的三维网络。根据水凝胶的类型,它们含有不同百分比的水,但完全不溶于水。尽管其高的水含量,但由于亲水性残基的存在,水凝胶仍能够额外结合大量液体。水凝胶在不改变其凝胶状结构的情况下广泛膨胀。水凝胶的基本物理特征可以根据所使用的聚合物的性质和用于施用水凝胶的装置进行具体改性。
[0238]
水凝胶材料优选不引起炎症反应。可用于形成水凝胶的其他材料的示例包括:(a)改性藻酸盐,(b)通过暴露于单价阳离子而胶化的多糖(例如,结冷胶和卡拉胶(carrageenan)),(c)是非常粘稠的液体或是触变性的,并通过结构的缓慢演变随着时间的推移而形成凝胶的多糖(例如透明质酸),(d)明胶或胶原,以及(e)聚合水凝胶前体(例如,聚环氧乙烷

聚丙二醇嵌段共聚物(polyethylene oxide

polypropylene glycol block copolymer)和蛋白质)。美国专利no.6,224,893 b1提供了适用于制备根据本公开的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的化学性质的详细描述。
[0239]
在某些实施方案中,用于配制本公开的生物材料的水凝胶是明胶基的。明胶是一种无毒、可生物降解的水溶性蛋白质,其源自胶原,是间充质组织细胞外基质(ecm)的主要成分。胶原是动物体内各种结缔组织中细胞外间隙的主要结构蛋白。作为结缔组织的主要成分,它是哺乳动物中最丰富的蛋白质,占全身蛋白质含量的25%至35%。取决于矿化的程度,胶原组织可以是刚性的(骨头)、顺应性的(肌腱),或具有从刚性到顺应性的梯度(软骨)。细长纤维形式的胶原主要存在于纤维组织中,诸如肌腱、韧带和皮肤等。它还在角膜、软骨、骨骼、血管、肠、椎间盘和牙齿中的牙中也很丰富。在肌肉组织中,它充当肌内膜(endomysium)的主要成分。胶原构成肌肉组织的百分之一到百分之二,占强壮的肌腱肌肉重量的6%。胶原遍布人体的许多地方。但是,人体中超过90%的胶原是i型。
[0240]
迄今为止,已经鉴定和描述了28种类型的胶原。根据它们形成的结构,它们可以分为几类:纤维状的(i、ii、iii、v、xi型);非纤维状facit(具有中断的三螺旋的原纤维相关胶原(fibril associated collagens with interrupted triple helice))(ix、xii、xiv、xvi、xix型);短链(viii、x型);基底膜(iv型);multiplexin(具有中断的多个三螺旋结构域)(xv、xviii型);macit(具有中断的三螺旋的膜相关胶原)(xiii、xvii型);其他(vi、vii型)。五种最常见的类型是:i型:皮肤、肌腱、血管结扎(vascular ligature)、器官、骨骼(骨骼有机部分的主要成分);ii型:软骨(软骨的主要胶原成分);iii型:网状(网状纤维的主要成分),通常与i型并存;iv型:形成基底膜,基底膜的上皮分泌层;v型:细胞表面、头发和胎盘。
[0241]
明胶保留包括精氨酸

甘氨酸

天冬氨酸(rgd)序列在内的信息信号,其可促进细胞粘附、增殖和干细胞分化。明胶特有的性质是它表现出较高临界溶解温度性能(upper critical solution temperature behavior)(ucst)。在某些实施方案中,高于40℃的特定温度阈值,明胶可以通过形成柔性、随机的单个卷曲(coil)而溶解在水中。冷却后,发生氢键和范德华(van der waals)相互作用,从而形成三螺旋。这些类胶原的三螺旋充当结合区,从而触发了溶胶

凝胶转变。明胶广泛用于制药和医药应用。
[0242]
在某些实施方案中,用于配制本文中的可注射细胞的组合物的水凝胶基于猪明胶,其可源自猪皮肤并且可商购,例如购自nitta gelatin na inc(nc,usa)或gelita usa inc.(ia,usa)。明胶可以溶解在例如dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)中,以形成热响应性水凝胶,该水凝胶可以在不同的温度下凝胶化和液化。在某些实施方案中,用于配制本文的可注射细胞的组合物的水凝胶基于使用本领域普通技术人员已知的方法表达和纯化的重组人或动物明胶。在某些实施方案中,在酵母毕赤酵母(pichia pastoris)中表达含有i型、αi人胶原的全部或部分cdna的表达载体。其他表达载体系统和生物体是本领域普通技术人员已知的。在一个具体的实施方案中,本公开的基于明胶的水凝胶在室温(22

28℃)及以上为液体,并且当冷却至冷藏温度(2

8℃)时为凝胶。
[0243]
本领域普通技术人员将理解,本领域已知的其他类型的合成或天然存在的材料可以用于形成本文所述的支架。
[0244]
在某些实施方案中,根据本公开使用的生物材料由水凝胶形式的透明质酸(ha)组成,其含有大小范围从5.1kda至>2x105kda的ha分子。ha可以促进相关生物活性的细胞群体的分支形态发生和三维自组织。在某些实施方案中,根据本公开使用的生物材料由多孔泡沫形式的透明质酸组成,还含有大小范围从5.1kda至>2x105kda的ha分子。在某些实施方案中,水凝胶源自肾脏或不受限制地任何其他组织或器官,或含有源自肾脏或不受限制地任何其他组织或器官的细胞外基质。在又一个实施方案中,根据本公开使用的生物材料由基于聚乳酸(pla)的泡沫组成,其具有开孔结构且孔径为约50微米至约300微米。
[0245]
温度敏感的生物材料
[0246]
本文所述的生物材料还可设计或适应于对某些外部条件(例如体外或体内)响应。在某些实施方案中,生物材料是温度敏感的(例如,体外或体内)。在某些实施方案中,生物材料适应于对暴露于酶促降解(例如,体外或体内)响应。如本文所述,可以对生物材料对外部条件的响应进行精密调整。可以通过调节制剂中生物材料的百分比来改变所述制剂的温度敏感性。例如,可以调节溶液中明胶的百分比以调整最终制剂(例如,液体、凝胶、珠子等)中明胶的温度敏感性。或者,可以将生物材料化学交联以提供对酶促降解的更大抗性。例如,碳化二亚胺(carbodiimide)交联剂可用于化学交联明胶珠,从而提供对内源酶降低的敏感性。
[0247]
在一方面,本文所述的制剂掺入了生物材料,所述生物材料具有为将施用于受试者的活性剂(诸如微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性肾细胞)创造有利的环境的特性。在某些实施方案中,制剂含有第一生物材料,所述第一生物材料为从活性剂与生物材料一起配制的时间直至施用于受试者的时间提供了有利的环境。在某些实施方案中,有利的环境涉及在施用于受试者之前使生物活性的细胞以基本上固态悬浮,相对于液体中的细胞(如本文所述)的优势。在某些实施方案中,第一生物材料是温度敏感的生物材料。温度敏感的
生物材料可具有(i)在约8℃或以下基本上为固态,和(ii)在环境温度或以上基本上为液态。在某些实施方案中,环境温度约为室温。
[0248]
在某些实施方案中,生物材料是温度敏感的生物材料,其可以根据温度维持至少两个不同的相或状态。所述生物材料能够在第一温度下维持第一状态,在第二温度下维持第二状态,和/或在第三温度下维持第三状态。第一、第二或第三状态可以是基本上固态、基本上液态或基本上半固态或半液态。在某些实施方案中,生物材料在第一温度下具有第一状态,在第二温度下具有第二状态,其中第一温度低于第二温度。
[0249]
在某些实施方案中,温度敏感的生物材料的状态在约8℃或以下的温度下为基本上固态。在某些实施方案中,基本固态维持在约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃或约8℃。在某些实施方案中,基本固态具有凝胶形式。在某些实施方案中,温度敏感的生物材料的状态在环境温度或以上为基本上液态。在某些实施方案中,基本液态维持在约25℃、约25.5℃、约26℃、约26.5℃、约27℃、约27.5℃、约28℃、约28.5℃、约29℃、约29.5℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃。在某些实施方案中,环境温度约为室温。
[0250]
在某些实施方案中,温度敏感的生物材料的状态在约环境温度或以下的温度下为基本上固态。在某些实施方案中,环境温度约为室温。在某些实施方案中,基本固态维持在约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃或约1℃。在某些实施方案中,基本固态具有珠子的形式。在某些实施方案中,温度敏感的生物材料的状态在约37℃或以上温度下为基本上液态。在某些实施方案中,基本上是固态维持在约37℃、约38℃、约39℃或约40℃。
[0251]
温度敏感的生物材料可以以溶液的形式、以固体的形式、以珠子的形式、或以本文所述和/或本领域普通技术人员已知的其他合适形式提供。本文所述的微囊泡(例如,外泌体)和/或细胞群体和制剂可以用温度敏感的生物材料包被、沉积、嵌入、附着、接种、悬浮或捕获在其中。在某些实施方案中,本文所述的细胞群体可以在与温度敏感的生物材料复合之前组装为三维细胞聚集物或类器官或三维管状结构,或者可以在与温度敏感的生物材料复合时被如此组装。在某些实施方案中,可以在没有任何细胞的情况下提供温度敏感的生物材料,诸如,例如以间隔珠子(spacer beads)的形式。在该实施方案中,温度敏感的生物材料以纯粹的被动作用起作用,以在靶器官内产生用于再生生物活性的空间,例如,血管生成或宿主细胞群体的浸润和迁移。
[0252]
在某些实施方案中,温度敏感的生物材料具有在第一状态和第二状态之间的过渡状态。在某些实施方案中,过渡态是在约8℃的温度和约环境温度之间的固

液过渡态。在某些实施方案中,环境温度约为室温。在某些实施方案中,固

液过渡态发生在以下一个或多个温度:约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、14℃、约15℃、约16℃、约17℃和约18℃。
[0253]
温度敏感的生物材料在给定温度下具有一定的粘度,以厘泊(cp)测量。在某些实施方案中,生物材料在25℃下具有粘度约1cp至约5cp、约1.1cp至约4.5cp、约1.2cp至约4cp、约1.3cp至约3.5cp、约1.4cp至约3.5cp、约1.5cp至约3cp、约1.55cp至约2.5cp、或约1.6cp至约2cp。在某些实施方案中,生物材料在37℃下具有粘度约1.0cp至约1.15cp。在37℃下粘度可以为约1.0cp、约1.01cp、约1.02cp、约1.03cp、约1.04cp、约1.05cp、约1.06cp、
约1.07cp、约1.08cp、约1.09cp、约1.10cp、约1.11cp、约1.12cp、约1.13cp、约1.14cp,或约1.15cp。在某些实施方案中,生物材料是明胶溶液。在溶液中明胶含量为约0.5%、约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%、约0.75%、约0.8%、约0.85%、约0.9%、约0.95%或约1%(w/v)。在一实例中,生物材料是pbs中的0.75%(w/v)明胶溶液。在某些实施方案中,0.75%(w/v)溶液在25℃下具有粘度为约1.6cp至约2cp。在某些实施方案中0.75%(w/v)溶液在37℃下具有粘度为约1.07cp至约1.08cp。明胶溶液可以在pbs、dmem或其他合适的溶剂中提供。
[0254]
在一方面,制剂含有与第二生物材料组合的微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性的细胞,其为从配制时直至施用于受试者的时间,为组合的微囊泡(例如,外泌体)和/或细胞提供了有利的环境。在某些实施方案中,第二生物材料所提供的有利环境涉及在生物材料中施用微囊泡(例如,外泌体)和/或细胞的优势,其直至施用于受试者以及施用之后的一段时间内保持结构完整性。在某些实施方案中,植入后第二生物材料的结构完整性为数分钟、数小时、数天或数周。在某些实施方案中,结构完整性少于一个月、少于一个星期、少于一天或少于一个小时。相对短期的结构完整性提供了一种制剂,所述制剂可以利用可控的处理、放置或分散将活性剂和生物材料递送到组织或器官中的目标位置,而不会妨碍或阻碍所结合元素与其放置的组织或器官的相互作用。
[0255]
在某些实施方案中,第二生物材料是对温度敏感的生物材料,其具有与第一生物材料不同的敏感性。第二生物材料可以具有:(i)在约环境温度或以下基本上为固态,以及(ii)在约37℃或以上基本为液态。在某些实施方案中,环境温度约为室温。
[0256]
在某些实施方案中,第二生物材料是交联的珠子。如本文所述,交联的珠子可以具有可精密调整的体内停留时间,这取决于交联程度。在某些实施方案中,交联的珠子包含微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性的细胞,并且对本文所述的酶促降解具有抗性。在某些实施方案中,本公开的制剂可包括与生物活性剂(例如微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性细胞)组合的第一生物材料,具有或不具有与生物活性剂(例如微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性细胞)组合的第二生物材料。在某些实施方案中,当制剂包括第二生物材料时,其可以是温度敏感的珠子和/或交联的珠子。
[0257]
在一方面,本公开提供了含有生物材料的制剂,所述生物材料在一段时间内大约数分钟、数小时或数天降解。与之相反,大量工作专注于植入固体材料,然后在数天、数周或数月内缓慢降解。在某些实施方案中,生物材料具有一个或多个以下特征:生物相容性、生物降解性(biodegradeability)/生物可再吸收性(bioresorbablity),在植入受试者体内之前和期间的基本固态,在植入之后结构完整性(基本固态)的丧失,以支持细胞活力和增殖的细胞相容性环境。生物材料能够在植入过程中使植入的颗粒间隔开,从而增强了天然组织的向内生长。在某些实施方案中,生物材料还促进固体制剂的植入。在某些实施方案中,生物材料提供了本文所述的制剂的定位,因为固体单元的插入有助于防止被递送的材料在植入过程中分散在组织内。对于基于细胞的制剂,与悬浮在液体中的细胞相比,固体生物材料还改善了锚定依赖性细胞的稳定性和生存力。然而,结构完整性的短的持续时间意味着植入后不久,生物材料不会对组织向内生长或所递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供显著的障碍。
[0258]
在一方面,本公开提供了含有生物材料的制剂,所述生物材料以基本上固体的形
式植入,然后在植入体内后液化/融化或以其他方式丧失结构完整性。这与侧重于使用可以以液体注入然后在体内固体化的材料的大量工作形成对比。
[0259]
生物相容性珠子
[0260]
在一方面,制剂包括本文所述的温度敏感的生物材料和含有生物材料的生物相容性珠子群体。在某些实施方案中,珠子是交联的。可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的交联剂来实现交联,诸如,例如,碳化二酰亚胺;醛类(例如,糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛),琥珀酰亚胺基交联剂{二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯)(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)(bs3)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate)(dsg)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(dss)、二硫代(琥珀酰亚胺丙酸酯)(dithiobis(succinimidyl propionate))、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(ethylene glycolbis(sulfosuccinimidylsuccinate))、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate))(egs)、双(磺基琥珀酰亚胺)戊二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)glutarate)(bs2g)、双磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(disuccinimidyl tartrate)(dst);环氧化合物(乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether)、1,4丁二醇二缩水甘油醚(1,4butanediol diglycidyl ether));糖类(葡萄糖和醛糖);磺酸和对甲苯磺酸(p

toluene sulfonic acid);羰基二咪唑(carbonyldiimidazole);京尼平(genipin);亚胺;酮类;叠氮磷酸二苯酯(diphenylphosphorylazide)(ddpa);对苯二甲酰氯(terephthaloyl chloride);六水合硝酸铈(iii)(cerium(iii)nitrate hexahydrate);微生物谷氨酰胺转移酶;和过氧化氢。本领域普通技术人员将理解根据本公开使用的其他合适的交联剂和交联方法。
[0261]
在某些实施方案中,珠子是碳化二亚胺交联的珠子。在某些实施方案中,碳化二亚胺交联的珠子可以与选自以下组的碳化二亚胺交联:1

乙基
‑3‑
[3

二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(1

ethyl
‑3‑
[3

dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)(edc),dcc

n,n'

二环己基碳二亚胺(dcc

n,n'

dicyclohexylcarbodiimide)(dcc)和n,n'

二异丙基碳二亚胺(n,n'

diisopropylcarbodiimide)(dipc)。预期较低浓度edc处理的珠子具有较高量的游离伯胺,而用高浓度的交联剂处理的样品将具有大多数参与酰胺键的伯胺。在335nm处通过分光光度法检测到的伯胺和三硝基苯磺酸之间的共价键形成的橙色强度与样品中存在的伯胺数量成正比。当对样品中存在的每毫克蛋白质进行标准化时,可以观察到存在的游离胺数量与用于交联的edc的初始浓度之间呈负相关。该结果表明差异的珠子交联,由反应中使用的碳化二亚胺的量决定。通常,与非交联珠子相比,交联的珠子表现出减少的游离伯胺数量。
[0262]
在某些实施方案中,与非交联的生物相容性珠子相比,交联的珠子对酶促降解具有降低的敏感性,从而为珠子提供可精密调整的体内停留时间。在某些实施方案中,交联的珠子对内源酶,诸如胶原酶具有抗性。在某些实施方案中,提供交联的珠子是促进以下一种或多种的递送系统的一部分:(a)将附着的细胞递送至期望的部位,并产生用于天然组织的再生和向内生长以及血管供应的空间;(b)在该部位持续足够长的时间以允许细胞建立、运行、重塑其微环境并分泌其自身的细胞外基质(ecm)的能力;(c)促进移植细胞与周围组织的整合;(d)以基本固态形式植入细胞的能力;(e)不会对组织的向内生长,从头血管生成或所递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的障碍的短期结构完整性;(f)以基本上固
体的形式定位体内递送,从而防止细胞在植入过程中在组织内分散;(g)与悬浮在液体中的细胞相比,锚定依赖性细胞的稳定性和活力得到改善;和(h)当细胞被递送时的双相释放曲线:1)以基本上固体的形式(例如,附着于珠子),和2)以基本上液体的形式(例如,悬浮在液体中);i)概括和模仿生物活性细胞群体所衍生的三维生物生态位或肾实质。
[0263]
在某些实施方案中,本公开提供了含有明胶的交联珠子。在某些实施方案中,非交联的明胶珠子不适合用于生物活性的细胞制剂,因为它们迅速丧失完整性并且细胞从注射部位消散。在某些实施方案中,高度交联的明胶珠子可能在注射部位持续太长时间,并且可能阻碍新型ecm的分泌、细胞整合、血管生成和组织再生。本公开允许精密调整交联珠子的体内停留时间。为了调整生物材料的生物可降解性,使用了碳化二亚胺的不同交联剂浓度,同时所有样品的总反应条件保持恒定。例如,可以通过将交联剂的浓度从约零改变到约1m来精细调整碳化二亚胺交联的珠子的酶敏感性。在某些实施方案中,浓度为约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、约40mm、约41mm、约42mm、约43mm、约44mm、约45mm、约46mm、约47mm、约48mm、约49mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm,或约100mm。交联剂浓度也可以是约0.15m、约0.2m、约0.25m、约0.3m、约0.35m、约0.4m、约0.45m、约0.5m、约0.55m、约0.6m、约0.65m、约0.7m、约0.75m、约0.8m、约0.85m、约0.9m、约0.95m或约1m。在某些实施方案中,交联剂为1

乙基
‑3‑
[3

二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(edc)。在某些实施方案中,edc交联的珠子是明胶珠子。可以根据交联剂的浓度对珠子的降解百分率进行精细调整。在某些实施方案中,明胶珠子可以与除明胶以外的珠子或微粒(例如,但不限于藻酸盐或ha)混合,以额外促进所递送的生物活性的细胞群体的效价。
[0264]
交联的珠子可以具有有利于生物活性的细胞群体和/或微囊泡(例如,外泌体)的接种、附着或包装(encapsulation)的某些特征。例如,珠子可以具有多孔表面和/或可以是基本上中空的。在某些实施方案中,孔的存在提供了增加的细胞附着表面,与无孔或光滑的表面相比,允许更多数量的细胞附着。另外,孔结构可以支持宿主组织与多孔珠子的整合,以支持新生组织的形成。在某些实施方案中,珠子具有可以拟合成对应于一般颗粒分布模式的威布尔图(weibull plot)的尺寸分布。在某些实施方案中,交联的珠子具有以下的平均直径:小于约120μm、约115μm、约110μm、约109μm、约108μm、约107μm、约106μm、约105μm、约104μm、约103μm、约102μm、约101μm、约100μm、约99μm、约98μm、约97μm、约96μm、约95μm、约94μm、约93μm、约92μm、约91μm或约90μm。在某些实施方案中,交联珠子的特性根据浇铸过程(casting process)而变化。在某些实施方案中,使用空气流雾化液体明胶溶液并将其用薄层色谱试剂喷雾器(ace glassware)喷雾到液氮中的方法来提供具有上述特征的珠子。本领域技术人员将认识到,调节浇铸过程的参数提供了调整珠子的不同特性(例如,不同尺寸分布)的机会。在某些实施方案中,可以进一步修饰珠子的微观形貌、表面和内部特征以促进细胞附着。
[0265]
在某些实施方案中,在配制之前使用细胞培养技术在体外评估交联的珠子的细胞相容性,其中将珠子与对应于最终生物活性的细胞制剂的细胞一起培养。在某些实施方案中,在制备生物活性的肾细胞制剂之前,将珠子与原代肾细胞一起培养,并使用活/死细胞
测定法来确认细胞相容性。除了细胞活力以外,用于测量细胞代谢活性、某些关键细胞因子和生长因子和外泌体的分泌以及某些关键蛋白质和核酸标志物(包括与功能性的生物活性的肾细胞群体相关的mirna)的表达的特定功能测试也是领域普通技术人员熟知的,并且额外用于与交联的珠子配制后确认细胞效价。
[0266]
在某些制剂中,将生物相容性交联的珠子与温度敏感的生物材料在溶液中以溶液体积的约5%(w/w)至约15%(w/w)结合。交联的珠子可以以溶液体积的约5%(w/w)、约5.5%(w/w)、约6%(w/w)、约6.5%(w/w)、约7%(w/w)、约7.5%(w/w)、约8%(w/w)、约8.5%(w/w)、约9%(w/w)、约9.5%(w/w)、约10%(w/w)、约10.5%(w/w)、约11%(w/w)、约11.5%(w/w)、约12%(w/w)、约12.5%(w/w)、约13%(w/w)、约13.5%(w/w)、约14%(w/w)、约14.5%(w/w)或约15%(w/w)呈现。
[0267]
在一方面,本公开提供了含有生物材料的制剂,所述生物材料在一段时间内大约数分钟、数小时或数天降解。与之相反,大量工作专注于植入固体材料,然后在数天、数周或数月内缓慢降解。
[0268]
在一方面,本公开提供具有生物相容性交联珠子的制剂,所述生物相容性交联的珠子与生物活性的细胞一起接种在递送基质中。在某些实施方案中,递送基质具有一个或多个以下特征:生物相容性、生物降解性/生物可再吸收性,在植入受试者体内之前和期间的基本固态,在植入之后结构完整性(基本固态)的丧失,以及支持细胞活力的细胞相容性环境。在某些实施方案中,递送基质能够在植入过程中使植入的颗粒(例如,交联的珠子)间隔开,从而增强天然组织向内生长。在某些实施方案中,如果不存在递送基质,则在植入过程中细胞化珠子的压实(compaction)会导致没有足够的空间用于充分的组织向内生长。在某些实施方案中,递送基质促进固体制剂的植入。在某些实施方案中,结构完整性的短的持续时间意味着植入后不久,基质不会对组织向内生长、重新血管生成或所递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供显著的障碍。在某些实施方案中,递送基质提供了本文所述的制剂的定位,因为固体单元的插入有助于防止被递送的材料在植入期间分散在组织内。在某些实施方案中,本文所述的递送基质的应用有助于防止在递送至肾实质中时通过排尿而迅速损失植入的细胞。在某些实施方案中,对于基于细胞的制剂,与悬浮在液体中的细胞相比,固体递送基质改善了锚定依赖性细胞的稳定性和活力。
[0269]
在某些实施方案中,递送基质是未接种细胞的生物相容性珠子的群体。在某些实施方案中,未接种的珠子分散在各个细胞接种的珠子之中和之间。在某些实施方案中,在移植之前和移植之后立即,未接种的珠子充当细胞接种的珠子之间的“间隔珠子”。在某些实施方案中,间隔珠子含有在第一温度下具有基本上固态并且在第二温度下具有基本上液态的温度敏感的生物材料,其中第一温度低于第二温度。例如,如本文所述,间隔珠子含有生物材料,所述生物材料在大约环境温度或以下具有基本上固态并且在约37℃下具有基本上液态。在某些实施方案中,环境温度约为室温。在某些实施方案中,生物材料是明胶溶液。在某些实施方案中,明胶溶液以约4%、约4.5%、约5%、约5.5%、约6%、约6.5%、约7%、约7.5%、约8%、约8.5%、约9%、约9.5%、约10%、约10.5%或约11%,,(w/v)呈现。在某些实施方案中,可以在pbs、细胞培养基(例如,dmem)或另一种合适的溶剂中提供明胶溶液。在某些实施方案中,生物材料是透明质酸。在某些实施方案中,生物材料是源自人或动物肾脏的脱细胞的细胞外基质,其可以进一步重构为水凝胶。
[0270]
在一方面,本公开提供了含有生物材料的制剂,所述生物材料以基本上固体的形式(例如,间隔珠子)植入,然后在植入体内后液化/融化或以其他方式丧失结构完整性。这与侧重于使用可以以液体注入然后在体内固体化的材料的大量工作形成对比。
[0271]
间隔珠子的温度敏感性可以在配制之前在体外进行评估。例如,在某些实施方案中,间隔珠子可以被标记并且与未标记的非温度敏感的珠子混合。然后将该混合物在37℃下温育以观察物理转变的变化。随着时间的流逝,观察到标记的温度敏感的珠子在较高温度下的形状损失。例如,温度敏感的明胶珠子可以用阿尔辛蓝染料(alcian blue dye)制成,以用作物理转变的标志物。将蓝色明胶珠子与交联的珠子(白色)混合,上样导管中,然后挤出并在37℃的1x pbs(ph 7.4)中温育。在不同的时间点显微镜观察蓝色明胶珠子的形状损失。30分钟后可见蓝色明胶珠子的物理状态变化,随着延长的温育时间变得更加明显。由于材料的粘性,珠子不会完全消散。
[0272]
调节释放制剂
[0273]
在一方面,本公开的制剂以调节释放制剂的形式提供。通常,调节释放特征在于施用后第一活性剂的初始释放,然后是第二活性剂的至少一个额外的随后的释放。第一和第二活性剂可以相同或它们是不同的。在某些实施方案中,所述制剂通过同一制剂中的多种组分提供调节释放。在某些实施方案中,调节释放制剂含有作为第一组分的一部分的活性剂,其允许活性剂在整个制剂体积内自由移动,从而允许在施用后在靶位点立即释放。所述第一组分可以是具有基本上液相和基本上固相的温度敏感的生物材料,其中在施用时所述第一组分处于基本上液相。在某些实施方案中,活性剂为基本上液相,使得其在整个制剂体积内基本自由移动,因此在施用后立即释放至靶位点。
[0274]
在某些实施方案中,调节释放制剂具有作为第二组分的一部分的活性剂,其中该活性剂附着、沉积、包被、嵌入、接种或捕获在第二组分中,其在施用于靶位点之前和之后持续存在。第二组分含有活性剂能够与之缔合的结构元素,从而在施用时防止活性剂从第二组分立即释放。例如,第二组分以基本上固体的形式提供,例如生物相容的珠子,其可以被交联以防止或延迟体内酶促降解。在某些实施方案中,基本上固相的活性剂在施用之前和之后在制剂内保持其结构完整性,因此在施用后它不会立即将活性剂释放到靶位点。本文已经描述了用于调节释放制剂的合适载体,但是本领域普通技术人员将理解适合用于本公开的其他载体。
[0275]
在某些实施方案中,所述制剂提供了包括细胞、微囊泡(例如,外泌体)、纳米颗粒、治疗性分子等在内的被递送元素的初始快速递送/释放,接着是元素的随后延迟释放。在某些实施方案中,所述制剂提供源自肾脏或其他细胞群体的可溶的并且是被分泌的微囊泡(例如,外泌体)、mirna和其他生物活性的核酸或蛋白质分子、生物活性的产物的初始快速递送/释放。与再生生物活性相关的其他分子或治疗剂将被本领域普通技术人员理解。本公开的制剂可以设计用于此类双相释放曲线,其中要递送的药剂以未附着形式(例如,溶液中的微囊泡和/或细胞)和附着形式(例如,微囊泡和/或细胞与珠子或其他合适的载体一起)提供。初次施用时,将未包埋的(unencumbered)药剂立即提供给递送部位,同时推迟包埋的药剂的释放,直到载体(例如,珠子)的结构完整性丧失,此时释放先前附着的药剂。如下所述,本领域普通技术人员将理解其他合适的释放机制。
[0276]
在某些实施方案中,可以基于活性剂的性质来调整释放的时间延迟。例如,在微囊
泡(例如,外泌体)和/或生物活性的细胞制剂中释放的时间延迟可以是大约数秒、数分钟、数小时或数天。在某些实施方案中,大约数周的延迟可以是适当的。在某些实施方案中,对于其他活性剂,诸如小分子或大分子,制剂中释放的时间延迟可以是大约数秒、数分钟、数小时、数天、数周或数月。所述制剂还可能含有提供不同时间延迟释放曲线的不同生物材料。例如,具有第一活性剂的第一生物材料可以具有第一释放时间,和具有第二活性剂的第二生物材料可以具有第二释放时间。第一和第二活性剂可以相同或不同。
[0277]
在某些实施方案中,延迟释放的时间段通常可以对应于生物材料的结构完整性丧失的时间段。然而,本领域普通技术人员将理解延迟释放的其他机制。例如,活性剂可以随时间连续释放,而与任何特定生物材料的降解时间无关,例如药物从聚合物基质中的扩散。另外,微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性细胞可以从含有生物材料和生物活性细胞的制剂迁移到天然组织中。在某些实施方案中,生物活性细胞从生物材料(例如,珠子)迁移到天然组织。在某些实施方案中,生物活性细胞从生物材料迁移至天然组织并诱导与再生生物活性有关的生长因子、细胞因子、外泌体、mirna以及其他核酸和蛋白质的分泌。在某些实施方案中,外泌体和其他细胞外微囊泡以及mirna、其他生物活性核酸和蛋白质迁移出生物材料。在某些实施方案中,生物活性细胞从生物材料迁移至天然组织并介导宿主干细胞和祖细胞的动员,然后宿主细胞和祖细胞向损伤或疾病位置迁移或归巢(home)。
[0278]
在某些实施方案中,可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物,诸如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。通过在制剂中包括延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸盐和明胶,可以延长可注射制剂的吸收。制备此类制剂的许多方法已获得专利或本领域技术人员通常已知。参见,例如,sustained and controlled release drug delivery systems,j.r.robinson,ed.,marcel dekker,inc.,new york,1978.适用于多肽试剂的控释或缓释的其他方法描述于例如美国专利号6,306,406和6,346,274,以及例如美国专利申请号us20020182254和us20020051808中,所有内容均通过引用并入本文。
[0279]
示例性的生物活性细胞制剂
[0280]
在某些实施方案中,本文提供的囊泡(诸如微囊泡,例如,外泌体)包括在生物活性细胞制剂中。或者或另外,可以在生物活性细胞制剂之前,同时或之后施用囊泡。
[0281]
在某些实施方案中,本文所述的制剂含有由上述生物材料制成的可植入构建体,所述生物材料具有用于治疗有需要的受试者的肾脏疾病的本文所述的生物活性的肾细胞。在某些实施方案中,本文提供的生物活性细胞制剂进一步包含囊泡(例如,通过生物活性的肾细胞分泌的微囊泡,例如外泌体)。
[0282]
在某些实施方案中,构建体由本文所述的一种或多种合成的或天然存在的生物相容性材料组成的生物相容性材料或生物材料、支架或基质和一种或多种细胞群体或微囊泡(例如,外泌体)组成,所述细胞群体或微囊泡通过附着和/或捕获沉积在支架的表面嵌入支架的表面。在某些实施方案中,构建体由本文所述的生物材料和一种或多种细胞群体或其产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)组成,所述细胞群体或其产物用生物材料组分包被、沉积、沉积、附着、捕获、嵌入、接种或组合。本文所述的任意微囊泡(例如,外泌体)和/或细胞群体可以与基质组合使用以形成构建体。
[0283]
在某些实施方案中,生物活性的细胞制剂是由src组成的可注射产品,所述src被
遗传修饰以降低免疫原性并配制在生物材料中(例如,明胶基水凝胶)。在一方面,同种异体src是通过肾脏活组织检查从供体患者的肾皮质组织中分离和扩增肾细胞,使用基因编辑技术对src进行遗传修饰以及通过密度梯度离心从扩增的肾细胞中进行选择而获得的。在某些实施方案中,src主要由肾上皮细胞组成,所述肾上皮细胞已知其再生潜力(humphreys et al.(2008)intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.cell stem cell.2(3):284

91)。在某些实施方案中,其他实质(血管)和基质(集合管)细胞可以较少(sparsely)存在于src群体中。在非临床研究中,将src注射入受体肾脏导致动物存活、尿液浓度和过滤功能显著改善。然而,src具有有限的保存期和稳定性。在明胶基水凝胶生物材料中src的制剂提供了增强的细胞的稳定性,从而延长了产品保存期,改善了转运和递送至肾皮质期间的稳定性,以用于临床用途。
[0284]
在一方面,通过使用标准临床护理肾脏活组织检查程序从供体首先获得肾皮质组织来制备生物活性的细胞制剂。通过酶消化从肾脏组织中分离出肾细胞,并使用标准细胞培养技术进行扩增。细胞培养基设计为用于扩增原代肾细胞,并且不含任何分化因子。将获得的肾细胞进行密度梯度分离以获得src。在密度梯度分离之前或之后,可以进行使用基因编辑技术来改善src的免疫原性。
[0285]
在某些实施方案中,配制的细胞群体和/或微囊泡(例如,外泌体)在约环境温度或以上基本上在整个生物材料的体积中自由移动。与液体中的细胞相比,使细胞群体在较低的温度下悬浮在基本上固相中为细胞提供了稳定性优势,诸如锚定依赖性细胞。此外,将微囊泡(例如,外泌体)和/或细胞悬浮在基本上固态中可提供一个或多个以下益处:i)防止微囊泡和/或细胞沉降,ii)允许细胞以悬浮状态保持锚定在生物材料中;iii)允许微囊泡和/或细胞在整个生物材料体积中保持更均匀的分散;iv)防止微囊泡和/或细胞聚集体的形成;和v)在制剂的储存和运输过程中为微囊泡和/或细胞提供更好的保护。可以保留导致向受试者施用的此类特征的制剂是有利的,至少因为制剂中细胞的整体健康状况将更好,并且将施用更均匀一致的细胞剂量。
[0286]
在某些实施方案中,用于配制src的明胶基水凝胶生物材料是溶于缓冲液中以形成热响应性水凝胶的猪明胶。在某些实施方案中,该水凝胶在室温下为液体,但当冷却至冷藏温度(2

8℃)时为凝胶。在某些实施方案中,将src与水凝胶一起配制,通过冷却凝胶化,并在冷藏温度(2

8℃)下运输到门诊。在某些实施方案中,在临床部位,将产品加热到室温后再注射入患者的肾脏。在某些实施方案中,使用适合于经由经皮或腹腔镜手术(laparoscopic procedure)递送的针头和注射器,将生物活性细胞制剂(例如,补充有来自生物活性肾细胞的微囊泡,诸如外泌体)植入肾皮质中。
[0287]
示例性neo

肾脏增强组合物的描述和组成
[0288]
在某些实施方案中,生物活性细胞制剂是neo

肾脏增强剂(nka),其是由在生物材料(明胶基水凝胶)中配制的自体、所选择的肾细胞(src)组成的可注射产品。在某些实施方案中,nka增强或补充有囊泡(例如,微囊泡,诸如由生物活性肾细胞分泌的外泌体)。
[0289]
在一方面,自体src通过肾脏活组织检查从患者的肾皮质组织中分离和扩增的肾细胞,并通过在密度边界、屏障或界面离心扩增的肾细胞来进行选择而获得。在一方面,自体src通过肾脏活组织检查从患者的肾皮质组织中分离和扩增的肾细胞,并在连续或不连续的单步或多步密度梯度中选择扩增的肾细胞而获得。src主要由肾小管上皮细胞组成,所
述肾小管上皮细胞已知其再生潜力(humphreys et al.(2008)intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.cell stem cell.2(3):284

91)。其他实质细胞(血管)和基质(集合管)细胞可以较少存在于自体src群体中。
[0290]
在某些实施方案中,nka补充从src群体产生和分离的微囊泡(例如,外泌体)。
[0291]
在临床前研究中,将src注射到受体肾脏中已导致动物存活、尿液浓度和过滤功能显著改善。然而,src具有有限的保存期和稳定性。在明胶基水凝胶生物材料中src的制剂提供了增强的细胞的稳定性,从而延长了产品保存期,改善了将nka转运和递送至肾皮质期间nka的稳定性,以用于临床用途。
[0292]
在一方面,通过使用标准临床护理肾脏活组织检查程序从供体/接受者首先获得肾皮质组织来制备nka。在某些实施方案中,通过酶消化从肾脏组织中分离出肾细胞,并使用标准细胞培养技术进行扩增。在某些实施方案中,细胞培养基设计为用于扩增原代肾细胞,并且不含任何分化因子。在某些实施方案中,将获得的肾细胞在密度边界或界面或密度梯度进行分离以获得src。在某些实施方案中,根据本公开对src进行遗传修饰。
[0293]
本文包括由生物材料制成的制剂,所述生物材料经设计或适于响应本文所述的外部条件。因此,在构建体中,生物活性细胞群体和其他活性剂(诸如微囊泡(例如,外泌体))与生物材料的缔合的性质将根据外部条件而改变。例如,细胞群体与温度敏感的生物材料的缔合会随温度而变化。在某些实施方案中,所述构建体含有生物活性的肾细胞群体和生物材料,所述生物材料在约8℃或以下具有基本固态,在约环境温度或以上具有基本液态,其中所述细胞群体在约8℃或以下悬浮于所述生物材料中。然而,细胞群体在大约环境温度或以上基本上在整个生物材料的体积中自由移动。与液体中的细胞相比,使细胞群体在较低的温度下悬浮在基本上固相中为细胞提供了稳定性优势,诸如锚定依赖性细胞。此外,将微囊泡(例如,外泌体)和细胞悬浮在基本上固态中可提供一个或多个以下益处:i)防止微囊泡和细胞沉降,ii)允许细胞以悬浮状态保持锚定在生物材料中;iii)允许微囊泡和细胞在整个生物材料体积中保持更均匀的分散;iv)防止微囊泡或细胞聚集体的形成;和v)在制剂的储存和运输过程中为微囊泡和细胞提供更好的保护。在某些实施方案中,可以保留导致向受试者施用的此类特征的制剂是有利的,至少因为制剂中细胞的整体健康状况将更好,并且将施用更均匀一致的细胞剂量。
[0294]
在某些实施方案中,用于将src配制成nka的明胶基水凝胶生物材料是溶于缓冲液中以形成热响应性水凝胶的猪明胶。该水凝胶在室温下为液体,但当冷却至冷藏温度(2

8℃)时为凝胶。在某些实施方案中,将src用水凝胶配制,以获得nka。nka通过冷却凝胶化,并在冷藏温度(2

8℃)下运输到门诊。nka具有3天的保存期。在临床部位,将产品加热到室温后再注射入患者的肾脏。使用适合于经由经皮或腹腔镜手术递送nka的针头和注射器,将nka植入肾皮质中。在某些实施方案中,水凝胶源自明胶或重组来源的另一种细胞外基质蛋白。在某些实施方案中,水凝胶源自源自肾脏或另一组织或器官的细胞外基质。在某些实施方案中,水凝胶源自重组细胞外基质蛋白。在某些实施方案中,水凝胶包含源自重组胶原的明胶(即,重组明胶)。
[0295]
细胞活性剂
[0296]
在一方面,生物活性细胞制剂还包括细胞活性剂。在某些实施方案中,本文提供的囊泡包含细胞活性剂。在某些实施方案中,细胞活性剂选自由以下组成的群体:抗氧化剂、
氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、基质金属蛋白酶、伤口愈合因子和生物活性细胞分泌的产物。
[0297]
在一方面,微囊泡(诸如外泌体)包含(例如,在其内腔内,在其脂质双层中,或其表面)细胞活性剂。在某些实施方案中,微囊泡通过在细胞活性剂存在下培养的细胞分泌。
[0298]
在某些实施方案中,细胞活性剂选自由以下组成的群体:抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、基质金属蛋白酶、伤口愈合因子和生物活性细胞分泌的产物。
[0299]
抗氧化剂通过抑制其他分子氧化的能力来表征。抗氧化剂包括但不限于以下一种或多种:6

羟基

2,5,7,8

四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
羧酸(6

hydroxy

2,5,7,8

tetramethylchroman
‑2‑
carboxylic acid)类胡萝卜素、类黄酮(flavonoid)、异黄酮(isoflavone)、泛醌(ubiquinone)、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、维生素e、维生素a、混合类胡萝卜素(例如,β胡萝卜素、α胡萝卜素、γ胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、八氢番茄红素(phytopene)、六氢番茄红素(phytofluene)和虾青素(astaxanthin))、硒、辅酶q10、吲哚
‑3‑
甲醇、原花青素(proanthocyanidin)、白藜芦醇(resveratrol)、槲皮素(quercetin)、儿茶素(catechin)、水杨酸、姜黄素(curcumin)、胆红素(bilirubin)、草酸、植酸(phytic acid)、硫辛酸、香草酸(vanilic acid)、多酚(polyphenol)、阿魏酸(ferulic acid)、茶黄素(theaflavin)及其衍生物。本领域普通技术人员将理解其他合适的抗氧化剂可用于本公开的某些实施方案中。
[0300]
氧载体是通过携带和释放氧气的能力表征的药剂。它们包括但不限于全氟化碳(perfluorocarbon)和含全氟化碳的药物。合适的基于全氟化碳的氧载体包括但不限于全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide)(c8f17br);perfluorodichorotane(c8f16c12);全氟溴癸烷(perfluorodecyl bromide);全氟溴烷(perfluobron)、全氟萘烷(perfluorodecalin);全氟三丙胺(perfluorotripopylamine);全氟甲基环哌啶(perfluoromethylcyclopiperidine);(全氟萘烷&全氟三丙胺);(全氟萘烷&全氟甲基环哌啶);(全氟溴癸烷&全氟溴烷);ocycyte
tm
((全氟(叔丁基环己烷))(perfluoro(tert

butylcyclohexane))。本领域普通技术人员将理解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的基于全氟化碳的氧载体。
[0301]
免疫调节因子包括但不限于骨桥蛋白(osteopontin)、fas配体因子、白细胞介素、β转化生长因子、血小板来源的生长因子、丛生蛋白(clusterin)、转铁蛋白(transferrin)、活化后可调节的正常t细胞表达分泌的蛋白质(rantes)、纤溶酶原激活物抑制剂

1(pai

1)、肿瘤坏死因子α(tnf

α)、白细胞介素6(il

6)、α

1微球蛋白以及β
‑2‑
微球蛋白。本领域普通技术人员将了解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的免疫调节因子。
[0302]
抗炎剂或免疫抑制剂(以下描述的)也可为制剂的一部分。本领域普通技术人员将了解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的抗氧化剂。
[0303]
细胞募集因子包括但不限于单核细胞趋化蛋白1(mcp

1)和cxcl

1。本领域普通技术人员将了解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的细胞募集因子。
[0304]
细胞附着因子包括但不限于纤连蛋白、前胶原、胶原、icam

1、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor)、层粘连蛋白、蛋白聚糖、特异性细胞粘附肽,诸如rgd和ysigr。本领域普通技术人员将了解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的细胞
附着因子。
[0305]
血管生成因子包括但不限于血管内皮生长因子f(vegf)和血管生成素

2(ang

2)。本领域普通技术人员将了解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的血管生成因子。
[0306]
基质金属蛋白酶包括但不限于基质金属蛋白酶1(mmp1)、基质金属蛋白酶2(mmp2)、基质金属蛋白酶9(mmp

9)和组织抑制剂和金属蛋白酶

1(matalloproteases

1)(timp

1)。
[0307]
伤口愈合因子包括但不限于角化细胞生长因子1(kgf

1)、组织纤溶酶原激活物(tpa)、钙结合蛋白、丛生蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、三叶因子3(trefoil factor 3)。本领域普通技术人员将了解用于本公开的某些实施方案中的其它适合的伤口愈合因子。
[0308]
来自本文所述的生物活性细胞的分泌产物也可以作为细胞活性剂加入生物活性细胞制剂中。
[0309]
源自人或动物来源的体液、组织或器官(包括但不限于人体血浆、人血小板裂解物、胎牛血浆或牛垂体提取物)的组合物,也可以作为细胞活性剂加入生物活性细胞制剂中。
[0310]
本领域普通技术人员将理解,有几种适合的方法用于将细胞群体与生物材料沉积或以其他方式组合以形成构建体。
[0311]
在某些实施方案中,在包含细胞活性剂的培养基中培养的brc(诸如src)产生包含细胞活性剂(cell biability agent)的囊泡。
[0312]
使用方法
[0313]
在一方面,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述方法包括向受试者施用有效量的分离的分泌的肾细胞囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,囊泡包含不由产生囊泡的细胞产生的化合物。在某些实施方案中,囊泡在本文公开的组合物或制剂内。
[0314]
在一方面,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述方法包括施用于受试者有效量的来自囊泡制剂的囊泡,其中来自囊泡制剂的囊泡已根据本文公开的方法鉴定为再生性的。
[0315]
在一方面,本文提供了治疗受试者中肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含生物活性的肾细胞群体的组合物,所述生物活性的肾细胞群体补充有尚未由所述生物活性的肾细胞群体分泌的肾细胞囊泡。
[0316]
在某些实施方案中,通过静脉内注射施用所述组合物。在某些实施方案中,所述组合物通过经导管递送施用。在某些实施方案中,将囊泡静脉内注射至外周血管中。在某些实施方案中,经导管递送进入受试者的左肾动脉或右肾动脉。
[0317]
在某些实施方案中,受试者患有慢性肾脏疾病。在某些实施方案中,慢性肾脏疾病是i、ii、iii、iv或v期肾脏疾病。
[0318]
在某些实施方案中,治疗肾脏疾病包括降低或预防受试者中肾脏纤维化。
[0319]
在某些实施方案中,受试者以每周至少1、2或3次接受透析,持续至少1或2周。
[0320]
在某些实施方案中,受试者患有ii型糖尿病。
[0321]
在某些实施方案中,受试者患有肾脏和泌尿道先天性异常(congenital anomalies)(cakut)。
[0322]
在某些实施方案中,受试者具有小于90ml/min/1.73m2的肾小球滤过率(gfr)、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。
[0323]
在某些实施方案中,不向受试者施用细胞。在某些实施方案中,细胞(例如,brc诸如src)施用于受试者。在某些实施方案中,囊泡与细胞分开施用。在某些实施方案中,在细胞之前、与细胞同时或在细胞之后施用囊泡。在某些实施方案中,将分离的囊泡施用于进一步包含细胞(例如,除了来自分离囊泡的细胞以外的细胞)的组合物中。在某些实施方案中,所述肾细胞囊泡已经由与所述组合物中的所述生物活性的肾细胞群体具有相同来源和/或含有相同细胞类型的生物活性的肾细胞群体分泌。
[0324]
在某些实施方案中,囊泡已经通过brc群体产生。在某些实施方案中,所述brc群体是src群体。
[0325]
在某些实施方案中,将由原代肾细胞分泌的囊泡施用于所述受试者。在某些实施方案中,将由原代肾细胞分泌的囊泡和由src分泌的囊泡施用于所述受试者。
[0326]
在某些实施方案中,将由内皮细胞或间充质干细胞分泌的囊泡施用于所受试者。
[0327]
在某些实施方案中,还向所述受试者施用非肾细胞囊泡。在某些实施方案中,所述非肾细胞囊泡是由非肾内皮祖细胞、非肾间充质干细胞或非肾脂肪来源的祖细胞分泌的。
[0328]
在某些实施方案中,囊泡的有效量是在缺少生物活性的肾细胞施用的情况下有效的量(例如,在不施用生物活性的肾细胞的情况下足以进行治疗的量)。在某些实施方案中,生物活性肾细胞的有效量是在缺少囊泡施用的情况下有效的量(例如,在不施用囊泡的情况下足以进行治疗的量)。在某些实施方案中,囊泡的有效量是小于没有共同施用生物活性肾细胞时将有效的量。在某些实施方案中,生物活性肾细胞的有效量是小于没有共同施用囊泡时将有效的量。
[0329]
本发明的微囊泡(例如,外泌体)、细胞和制剂适合用于本文所述的使用方法。在某些实施方案中,本发明的制剂可以施用于用于治疗肾脏疾病。在某些实施方案中,微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性细胞可以作为本文所述制剂的一部分施用于天然器官。在某些实施方案中,微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性细胞可源自为施用对象的天然器官或源自非靶标天然器官来源。
[0330]
在某些实施方案中,本公开提供了在需要的受试者中利用本文所述的含有微囊泡(例如,外泌体)和/或生物活性肾细胞群体的制剂来治疗肾脏疾病的方法。在某些实施方案中,所述制剂适合施用于需要改善肾脏功能的受试者。
[0331]
在一方面,通过本公开的方法对受试者中肾脏疾病的有效治疗可以通过肾功能的各种指标来观察。在某些实施方案中,肾脏功能的指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白与球蛋白比率(a/g比率)、血清磷、血清钠、肾脏大小(通过超声可测量的)、血清钙、磷:钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酐、血液尿素氮(bun)、胆固醇水平、甘油三酯水平以及肾小球滤过率(gfr)。此外,一般健康和康乐(well

being)的若干指标包括但不限于体重增加或减轻、存活、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)以及身体耐力表现。
[0332]
在一方面,通过稳定肾脏功能的一个或多个指标来证明利用制剂的有效治疗。在某些实施方案中,通过与尚未经过本公开的方法治疗的受试者中的相同指标比较,观察到的由本公开的方法治疗的受试者中的指标变化来表现肾脏功能的稳定。在某些实施方案中,可以通过与治疗之前的相同受试者中的相同指标比较,观察到的由本公开的方法治疗
196:374

384,通过引用以其整体并入。在某些实施方案中,与对照相比,干细胞标志物的表达上调。
[0336]
在一方面,本文提供了在受试者中治疗肾脏疾病的方法,所述方法包括将本文公开的制剂、组合物、细胞群体或微囊泡(例如,外泌体)注射入受试者。在某些实施方案中,通过18至30号(gauge)针头(needle)注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于20号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于21号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于22号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于23号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于24号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于25号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于26号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于27号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于28号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过小于29号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约20号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约21号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。
[0337]
在某些实施方案中,通过约22号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约23号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约24号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约25号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约26号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约27号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约28号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。在某些实施方案中,通过约29号针头注射制剂、组合物、细胞群体或细胞产物(诸如微囊泡,例如,外泌体)。
[0338]
在某些实施方案中,针头的内径小于0.84mm。在某些实施方案中,针头的内径小于0.61mm。在某些实施方案中,针44头的内径小于0.51mm。在某些实施方案中,针头的内径小于0.41mm。在某些实施方案中,针头的内径小于0.33mm。在某些实施方案中,针头的内径小于0.25mm。在某些实施方案中,针头的内径小于0.20mm。在某些实施方案中,针头的内径小于0.15mm。在某些实施方案中,针头的外径小于1.27mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.91mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.81mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.71mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.64mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.51mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.41mm。在某些实施方案中,针头的外径小于0.30mm。在某些实施方案中,针头具有下表中的尺寸之一:
[0339][0340]
施用方法和途径
[0341]
在某些实施方案中,在缺乏细胞(例如,brc,诸如src)的情况下施用囊泡(例如,微囊泡,例如肾外泌体)。在某些实施方案中,囊泡与细胞一起施用。在某些实施方案中,囊泡与细胞在相同的组合物中施用,以及与细胞分开施用。在某些实施方案中,通过不同的施用途径施用囊泡和细胞。在某些实施方案中,囊泡和细胞通过一种施用途径施用,并且囊泡也通过另一种施用途径分开施用。在某些实施方案中,囊泡比细胞更频繁地施用。
[0342]
在某些实施方案中,囊泡是静脉内施用。在某些实施方案中,囊泡静脉内注射至外周血管中。在某些实施方案中,囊泡通过经导管递送来施用。在某些实施方案中,经导管递送进入所述受试者的左肾动脉或右肾动脉。
[0343]
本发明的制剂可以单独施用或与其他生物活性组分组合施用。在某些实施方案中,所述制剂适合于将掺入的组织工程元件注射或植入到实体器官内部以再生组织。在某些实施方案中,所述制剂用于将组织工程元件注射或植入中空器官壁以再生组织。在某些实施方案中,将此类制剂与适合于全身或经导管递送的其他制剂组合施用。
[0344]
在一方面,本发明提供了向有需要的受试者提供本文所述的生物活性细胞制剂的方法。在某些实施方案中,所述生物活性细胞制剂补充有囊泡。在某些实施方案中,所述生物活性细胞制剂不补充囊泡,但是所述受试者进一步接受包含囊泡的单独制剂。在某些实施方案中,生物活性细胞和/或囊泡的来源可以是同种异体的或同基因的,及其任意组合。在某些实施方案中,所述方法可以包括免疫抑制剂的施用。(例如,参见美国专利号7,563,822)。
[0345]
在某些实施方案中,本发明的治疗方法涉及本文所述的生物活性细胞制剂的递送。在某些实施方案中,将细胞和/或囊泡直接施用至预期有益的部位。还可以通过使天然肾脏与本文所述的生物活性细胞制剂以及来自一种或多种富集的肾细胞群体分泌的产物和/或含有其的混合物或构建体一起在体内接触来治疗有需要的受试者。体内接触的步骤
为天然肾脏提供了再生作用。在某些实施方案中,在生物活性细胞制剂之前,同时或之后施用(例如,通过相同或不同的施用途径)分离的囊泡(例如,缺乏细胞的囊泡)。
[0346]
鉴于该说明书,用于将所选择的肾细胞的组合物施用于受试者的多种方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。此类方法包括将细胞注射到受试者的靶部位。
[0347]
递送媒介物
[0348]
在某些实施方案中,可以将细胞和/或分泌的产物插入递送装置或媒介物中,所述递送装置或媒介物促进通过注射或植入到受试者中来引入。在某些实施方案中,递送媒介物可以包括天然材料。在某些实施方案中,递送媒介物可以包括合成材料。在某些实施方案中,递送媒介物提供了模拟或恰好符合器官构造(architecture)的结构。在某些实施方案中,递送媒介物本质上是流体样的。此类递送装置可以包括用于将细胞和流体注射到受体受试者体内的管,例如导管。在某些实施方案中,所述管额外地具有针头(例如,注射器),通过所述针头可以将本发明的细胞在期望的位置引入受试者中。在某些实施方案中,将哺乳动物肾脏来源的细胞群体配制用于通过导管施用到血管中(其中术语“导管”旨在包括用于递送物质至血管的各种管样系统中的任意一种)。在某些实施方案中,可将细胞插入生物材料或支架中或插入于生物材料或支架上,包括但不限于纺织品(textile),诸如机织物(weave)、针织物(knit)、编织物(braid)、网状织物(mesh)和非织造物(non

woven)、穿孔膜、海绵和泡沫,以及珠子,诸如实心或多孔珠子、微粒、纳米颗粒等(例如,cultispher

s明胶珠子

sigma)。可以制备细胞以多种不同形式用于递送。在某些实施方案中,细胞可以悬浮在溶液或凝胶中。在某些实施方案中,可以将细胞与药学上可接受的载体或稀释剂混合,在所述药学上可接受的载体或稀释剂中细胞保持活力。
[0349]
药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水性溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域熟知的。溶液优选地为无菌的和流体,并且将通常是等渗的。优选地,溶液在制备和储存条件下为稳定的并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等保存,以抵抗微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。本领域技术人员将理解,在递送本发明的细胞群体及其混合物中使用的递送媒介物可以包括上述特征的组合。
[0350]
在某些实施方案中,向受试者施用(i)包含囊泡的制剂,(ii)包含生物活性肾细胞的制剂,和/或(iii)包含生物活性肾细胞和囊泡二者的制剂。
[0351]
在某些实施方案中,向受试者施用1

3次生物活性肾细胞(诸如所选择的肾细胞)。在某些实施方案中,向受试者施用1次生物活性肾细胞(诸如所选择的肾细胞)。在某些实施方案中,向受试者施用2次生物活性肾细胞(诸如所选择的肾细胞)。在某些实施方案中,向受试者施用3次生物活性肾细胞(诸如所选择的肾细胞)。
[0352]
在某些实施方案中,向受试者施用1

10次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用1次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用2次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用3次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用4次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用5次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用6次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用7次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向
受试者施用8次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用9次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。在某些实施方案中,向受试者施用10次肾囊泡(例如,微囊泡,诸如外泌体)。
[0353]
施用模式
[0354]
施用制剂的模式包括但不限于全身、肾内(例如,实质的)、静脉内或动脉内注射、经导管递送以及在预期的活动部位上直接注射到组织中。在某些实施方案中,根据本发明待使用的施用模式包括经过直接剖腹手术、经过直接腹腔镜检查、经腹或经皮的单次或多次注射。在某些实施方案中,根据本发明待使用的施用模式包括例如逆行性输注和输尿管肾盂输注(ureteropelvic infusion)。施用的手术方法包括一步工序,诸如但不限于部分肾切除和构建体植入、部分肾切除、部分肾盂(pyelectomy)切除、用网膜
±
腹膜血管化、多病灶活组织检查针道(needle track)、圆锥或角锥(pyramidal)至圆柱体和肾极样置换(renal pole

like replacement);以及两步工序,包括例如用于重新移植的类器官内部生物反应器。在某些实施方案中,含有细胞和囊泡混合物的制剂经过相同途径同时递送。在某些实施方案中,通过本文所述的一种或多种方法,将细胞组合物和囊泡组合物单独地递送至特定位置或经过特定方法同时或以时间控制的方式递送。在某些实施方案中,将所选择的肾细胞经皮注射到肾脏的肾皮质中。在某些实施方案中,在将组合物注射到肾脏中之前,将引导套管经皮插入并用于穿刺肾包膜(kidney capsule)。在某些实施方案中,通过静脉内注射或经导管递送来施用囊泡。
[0355]
腹腔镜检查或经皮技术可用于进入肾脏以注射配制的brc或src群体(例如,与囊泡一起或与囊泡分开)。腹腔镜手术技术的使用可直接观察肾脏,以便在注射过程中发现任何出血或其他不良事件并立即解决。肾脏的经皮治疗方法已经使用了十多年,主要用于去除肾内肿块。这些工序将电极或低温针头插入肾脏中确定的肿块,并在去除病变的同时保持接触(通常)10至20分钟。对于注射治疗制剂而言,经皮器械既不更大也不更复杂,并且该方法提供了无需手术(避免腹部穿刺伤口和气体充气)和最小化固定时间的安全优势。此外,进入通道可以留有止血的可生物降解材料,以进一步降低重大出血的机会。
[0356]
在通过注射递送的某些实施方案中,将治疗性生物活性细胞制剂(可以或可以不补充囊泡)注射到肾皮质中。在某些实施方案中,重要的是将治疗性制剂尽可能广泛地分布在肾皮质中,这可以例如通过以允许治疗性制剂沉积在肾皮质中的角度进入肾皮质来实现,其分布广泛可行。这可能需要使用超声引导或利用轴向计算机断层扫描(ct)成像以纵向或横向方式对肾脏成像,具体取决于个人患者特征。理想地,随着注射针头/套管的逐渐拔出,注射将涉及多种沉积物。治疗制剂的全部体积可以沉积在单个或多个入口点。在某些实施方案中,最多两个入口点可用于将全部体积的治疗性制剂沉积进肾脏中。在某些实施方案中,将注射剂施用于单个肾脏,可以使用一个或多个入口点(例如一个或两个入口点)。在某些实施方案中,将注射剂施用于两个肾脏,在每个肾脏中使用一个或多个入口点(例如一个或两个入口点)。
[0357]
前述书面描述认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。应当理解,尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明,但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变型,并且认为此类修改和变型在如所附权利要求书所限定的本发明的范围内。仅出于说明目的提供以下实施例,并且不意图以任何方式限制本发明的范围。事实
上,除了本文所表示和描述的那些之外,本发明的各种修改将通过前面的描述对于本领域技术人员而言变得清楚并且处于所附权利要求的范围内。
[0358]
本说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用以其整体并入。
实施例
[0359]
实施例1:用于产生src的方法和组合物的非限制性实例
[0360]
实施例1.1

溶液的制备
[0361]
该实施例部分提供了在该实施例中使用的用于分离和表征异质肾细胞群体的各种培养基制剂和溶液的组成,以及再生疗法产品的制备。
[0362]
表6:培养基和溶液
[0363][0364]
杜氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco's phosphate buffered saline(dpbs))用于所有细胞洗涤。
[0365]
实施例1.2

异质未分级的肾细胞群体的分离
[0366]
该实施例部分说明了从人中分离出未分级的(unfx)异质肾细胞群体。进行初始组织解离以产生来自人肾脏组织的异质细胞悬浮液。
[0367]
经过肾脏活组织检查得到的肾组织为异质肾细胞群体提供源材料。可以使用包含皮质、皮髓质交界处或髓质组织中的一种或多种的肾组织。优选使用皮髓质交界处组织。需要来自ckd肾脏的多个活组织检查核心(最小2个),避免疤痕组织。在计划植入最终nka之前大约4周由临床研究者在临床部位从患者中获得肾组织。将组织转运于实施例1.1的组织转运培养基中。
[0368]
然后用实施例1.1的组织洗涤溶液洗涤组织以便在加工组织用于细胞提取之前减少带进的生物负荷(bioburden)。
[0369]
切碎肾组织,称重并且用实施例1.1的消化溶液解离。用杜氏改良型伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium)(d

mem) 10%胎牛血清(fbs)(invitrogen,carlsbad calif.)中和所得到的细胞悬浮液,洗涤并且重新悬浮于无血清、无补充剂的角化细胞培养基(ksfm)(invitrogen)中。然后使细胞悬浮液以15%(w/v)碘克沙醇(optiprep
tm
,sigma)密度边界离心,以在以实施例1.1的肾细胞生长培养基中的25,000个细胞/cm2的密度下组织培养物处理的聚苯乙烯烧瓶或培养皿上开始培养之前去除红细胞和碎片。例如,可以将细胞以150ml的50∶50培养基中的25
×
106个细胞/烧瓶铺放于t500 nunc烧瓶上。
[0370]
实施例1.3

分离的肾细胞群体的细胞扩增
[0371]
肾细胞扩增取决于所接受的组织的量并且取决于从带进的组织中成功分离出肾细胞。如果需要(参见下文),可以冷冻保藏分离的细胞。肾细胞生长动力学可由于从个体患者中分离的细胞的固有变异性而在样品与样品之间变化。
[0372]
开发适应细胞回收范围的明确细胞扩增过程,所述细胞回收范围由带进组织的变异性产生(表7)。肾细胞的扩增涉及使用明确细胞培养工序在肾细胞生长培养基(表6)在封闭培养器皿(例如,t

烧瓶,cell factories,hyper)中的连续传代。
[0373]
开发用于人临床试验的无bpe培养基以消除与使用bpe相关的固有风险。在无bpe培养基中评估细胞生长、表型(ck18)和细胞功能(ggt和lap酶促活性)并且与在动物研究中使用的含bpe的培养基比较。在两种培养基中肾细胞生长、表型和功能是相同的。(数据未示出)
[0374]
表7来自人肾脏活检物的细胞回收
[0375][0376]
一旦在初始t

烧瓶(第0代)中观察到细胞生长并且不存在污染的可视迹象,替换培养基并且此后每2

4天更换(图2b)。通过在显微镜下视觉观察培养物来评价细胞以证实肾细胞形态学。由于细胞聚集在一起,培养物从特征上显示紧凑的铺面(pavement)或卵石(cobblestone)外观。这些形态学特征在扩增期间改变并且可以不存在于每代中。在整个细胞扩增中所采用的培养器皿中在不同的汇合水平下评估细胞培养物汇合。
[0377]
当培养器皿为至少50%汇合时,通过胰蛋白酶消化使肾细胞传代(图2b)。将脱离的(detached)细胞收集到含有肾细胞生长培养基的器皿中,计数并且计算细胞活力。在每个细胞代中,在足够数目的培养器皿中以500

4000个细胞/cm2接种细胞以便使细胞数扩增至nka制剂所需要的细胞数目(图2b)。在5%co2环境下在37℃培养箱中放入培养器皿。如上所述,监测细胞形态和汇合并且每2

4天替换组织培养基。表8列出了在从人类供体的六次肾脏活组织检查的细胞分离和扩增过程中观察到的人类肾细胞的活力。
[0378]
表8培养中的人肾细胞的细胞活力
[0379]
传代(n=6)细胞活力(平均值%)范围(%)p08884

93p19180

98p29492

99p39897

99
[0380]
来自不同患者的组织的固有变异性引起培养中的不同细胞产率。因此,严格限定细胞传代时间或每代中所需要的培养器皿的数目和类型以达到靶细胞数是不实际的。通常肾细胞经历2或3次传代;然而,培养的持续时间和细胞产率可以取决于细胞生长速率而改变。
[0381]
用具有edta(invitrogen)的0.25%胰蛋白酶使细胞脱离用于收获或传代。经过台盼蓝排除(trypan blue exclusion)评价活力并且使用血细胞计数器手动地或使用自动化cellometer.rtm.计数系统(nexcelom bioscience,lawrence mass.)进行计数。
[0382]
实施例1.4培养的细胞的冷冻保藏
[0383]
通常扩增的肾细胞被冷冻保藏以便适应来自个体患者的细胞生长的固有变异性,并且以便按照预先确定的临床方案递送产品。冷冻保藏的细胞还在需要另一种nka的事件中提供细胞的备用来源(例如,由于患者疾病、未预料的过程事件等引起的延迟)。建立已经用来冷冻保藏细胞并且当解冻时恢复有活力、功能性细胞的条件。
[0384]
对于冷冻保藏,将细胞悬浮在冷冻保藏溶液中,终浓度为约50
×
106个细胞/ml(参见实施例1.1),并且分配到小瓶中。将含有约50
×
106个细胞/ml的1ml小瓶置于受控速率冷冻器的冷冻室中并以预先编程的速率冷冻。冷冻之后,将细胞转移至液氮冷冻器用于半成品(in

process)储存。
[0385]
实施例1.5 src细胞群体的制备
[0386]
所选择的肾细胞(src)可以从由冷冻保藏的细胞生长的最终培养器皿中或直接从扩增培养物中制备,取决于时间安排(图2b)。
[0387]
如果使用冷冻保藏的细胞,将细胞解冻并且放于组织培养器皿上用于最后一个扩增步骤。当最终培养器皿为大约50%

100%汇合时,细胞准备好加工用于src分离。nka的培养基交换和最终洗涤使最终产品中的任何残余冷冻保藏溶液稀释。
[0388]
一旦最终细胞培养器皿已达到至少50%汇合,将培养器皿转移至设定为37℃下的5%co2环境中的2%氧的低氧培养箱(图2c)并且培养过夜。细胞可以容纳于设定至2%氧的氧控制的培养箱中持续长达48小时。暴露于更多生理上相关的低氧(2%)环境改善了细胞分离效率并且使得检测更多低氧诱导的标志物,诸如vegf。
[0389]
在细胞已经暴露于低氧条件持续足够时间(例如,过夜至48小时)之后,用具有edta的0.25%胰蛋白酶(invitrogen)脱离细胞。经过台盼蓝排除评价活力并且使用血细胞计数器手动地或使用自动化计数系统(nexcelom bioscience,lawrence mass.)进行计数。用dpbs洗涤细胞一次并且在dpbs中重新悬浮至约850
×
106个细胞/ml。
[0390]
基于细胞浮力密度使用通过密度边界/界面离心来分离收获的肾细胞群体。通过在7%碘克沙醇溶液(optiprep;optimem中60%(w/v);参见实施例1.1)中离心分离肾细胞悬液。
[0391]
制备7%optiprep密度界面(density interface)溶液并且在使用之前测量指示
期望的密度的折射率(r.i.1.3456 /

0.0004)。收获的肾细胞层积于溶液的顶部。在离心管或细胞处理器(例如,cobe 2991)中,在室温在800g下离心密度界面持续20min(不间断)。在离心之后以明显的沉淀物收集细胞级分,所述细胞级分表现出浮力密度大于大约1.045g/ml。排除并丢弃维持浮力密度小于1.045g/ml的细胞。
[0392]
将src沉淀物重新悬浮于dpbs中(图2c)。通过4次dpbs洗涤和1次明胶溶液步骤使最终产品中的残余optiprep、fbs、培养基以及辅助材料的残留物最小化。
[0393]
实施例2:外泌体组合物及其用于治疗肾脏疾病的用途和功能
[0394]
实施例2.1

技术领域
[0395]
该实施例涉及肾细胞外泌体组合物及其制备,其用途包括用于肾脏修复和功能的组织工程和再生医学应用。
[0396]
实施例2.1

常规评论
[0397]
大量研究继续集中在利用生物体液中的外泌体作为疾病的生物标志物上。近期提到了外泌体的治疗潜力,其中大多数集中在癌症免疫疗法、疫苗开发、自身免疫性疾病治疗和治疗剂(化合物,sirna)的递送上。在过去的7年(7、8)中,外泌体作为一种在调控新血管形成(neovascularization)(组织再生中的重要成分)的潜在疗法,已经受到关注。
[0398]
分泌的细胞外囊泡(ev),诸如外泌体,充满了有效的前修复蛋白和rna运载物(cargo),它们既是细胞类型特异性的,又会根据细胞环境而差异产生和分泌。zhang等人(am j physiol renal physiol.2016nov 1;311(5):f844

f851.doi:10.1152/ajprenal.00429.2016.epub 2016aug 31.extracellular vesicles in diagnosis and therapy of kidney diseases.zhang w,zhou x,zhang h,yao q,liu y,dong z.)张等人发表了关于与肾脏疾病直接相关的该主题的一篇优秀综述。
[0399]
慢性肾脏脏病(ckd)是一个全球性的健康问题;等待移植的患者与实际移植的器官之间的数目差距越来越大,这凸显了新的治疗来恢复肾功能的需求。再生医学是一种有前途的方法,从中出现了器官水平病症的治疗,并将所述方法转化为临床。由可生物降解的材料和自体细胞组成的再生模板,离体分离和扩增,可刺激植入后的天然类(native

like)器官组织再生。
[0400]
最近的研究表明,ev在介导细胞

细胞或细胞间通讯中的新兴作用(9、10)。ev的独特生物活性已显示出对纠正细胞功能障碍潜在的益处,进而治疗疾病(11)。ev也被认为是生物递送的理想纳米载体,特别是临床应用中的药物传递(12)。在肾脏中,肾脏ev由肾脏细胞产生和分泌,并与肾脏功能和疾病有关(10)。
[0401]
从机理上讲,几项研究将ev对肾脏疾病的保护作用主要归因于其rna含量,尤其是microrna(13、14)。
[0402]
关于ev作为ckd的生物标志物的潜力已有深入研究。相反,关于ev在ckd中的治疗效果了解非常有限。不受任何科学理论的束缚,我们合理地推测利用我们的src成功治疗ckd至少部分是由于对src的低氧治疗导致植入细胞分泌出“调整的(tuned)”ev,进而“挽救(rescue)”患病的细胞,从而改善了它们的功能。
[0403]
在某些实施方案中,在外泌体分离之前,梯度条带后对所选择的肾细胞的低氧调整为ev提供了增强的再生特性。
[0404]
实施例2.3

外泌体分离

定量和大小确定
[0405]
基于使用的纯化方法(15),外泌体被描述为在30

150nm的范围内(16、17),其近似密度为1.10

1.20g/ml(18、19),取决于用于分析的密度梯度的材料(蔗糖或optiprep)。已经描述了微囊泡大于外泌体,并且通常描述为直径大小为100

300nm。这些种类的ev在尺寸上的重叠程度取决于出版物和进行测量的技术。如本文所用,术语“微囊泡”是指直径在30至1,000纳米(nm)之间的细胞来源的膜状细胞外囊泡。如本文所用,术语“外泌体”是指直径约30

150nm的细胞来源的膜状微囊泡。因此,如本文所用,术语“微囊泡”涵盖外泌体以及较大的囊泡。
[0406]
尽管国际细胞外囊泡协会(isev)的主要意见领袖已于2014年末和2015年发表了立场声明(20),但关于如何最佳分离、确定大小和表征外泌体,尚无统一的共识。可以预料,随着该领域的发展,特别是在生物学功能领域,最佳分离、确定大小和表征颗粒的技术将由产生所需的生物学效果的那种方法驱动。在某些实施方案中,通过将含ev的培养基以3000xg离心20min以沉淀细胞碎片,然后以100,000xg将澄清的上清液超速离心以使ev沉淀的过程来获得包含外泌体的ev。这些制剂目前表现出生物学活性(参见下面的增殖和小管生成测定(tubulogenesis assay))。
[0407]
细胞在无血清培养基中生长24小时。收集培养基。为了分离外泌体,将收集的无血清条件培养基分两个步骤进行离心:1)3000x g,20分钟以去除细胞碎片;2)100,000x g,2小时以沉淀外泌体。将外泌体重悬于dpbs中,并保存在

80℃直至使用。
[0408]
为了确定外泌体的大小分布和浓度,我们使用np150纳米孔膜在47mm拉伸(stretch)下通过可调电阻式脉冲传感(trps;(qnano,izon science ltd)分析了样品。使用具有浓度为1.0x10
13
颗粒/ml的114nm羧化聚苯乙烯(carboxylated polystyrene)珠子的多压力校准,对颗粒浓度进行标准化。在分析之前立即将样品在dpbs中按1:100稀释。对于4个不同批次,结果和产率如下表(表9)所示。尽管批次之间存在大小和浓度差异,但所有批次的粒径都在外泌体的操作定义范围内(30

150nm)。
[0409]
表9:外泌体分离、定量和大小测定的结果和产率
[0410]
批次样品颗粒/ml众数直径(nm)tchk004brc

31.3
×
10e11115.3tchk004brc

3a3.7
×
10e11117.9tchk004src2.2
×
10e11116.3
ꢀꢀꢀꢀ
tchk006brc

33.0
×
10e11115.4tchk006brc

3a8.4
×
10e11126.3tchk006src9.8
×
10e11124.9
ꢀꢀꢀꢀ
tchk012brc

32.5
×
10e12117.7tchk012brc

3a4.8
×
10e11131.7tchk012src1.4
×
10e11117.1
ꢀꢀꢀꢀ
tchk013brc

01.3
×
10e12118.2tchk013brc

31.9
×
10e11121.7
tchk013brc

3a3.5
×
10e11130.7tchk013src4.4
×
10e11123.3
[0411]
在该实施例和其他实施例中,“brc

0”是未传代的原代细胞的生物活性肾细胞。“brc

1”是已传代一次的生物活性肾细胞。“brc

2”是已传代两次的生物活性肾细胞。“brc

3”是已传代三次的生物活性肾细胞。“brc

3a”是已传代三次的生物活性肾细胞,然后在低氧条件下培养(表示在低氧培养完成后的细胞)。“src”表示所选择的肾细胞。
[0412]
实施例2.4

src外泌体micro rna(mirna)表征
[0413]
由于外泌体运载物内容物可包括若干分析物,所述分析物包括蛋白质、代谢物和rna,所以我们表征了发现与src衍生的外泌体相关的microrna。microrna(mirna)是小的非编码rna,包含大约18

23个核苷酸,其结合3
’‑
信使rna的非翻译区域,以抑制翻译或促进降解。mirna图谱(profile)反映了各种生理和病理条件。它们以组织或细胞特异性方式表达。根据各种生理过程,mirna的表达水平改变,并且大多数人类蛋白编码基因被认为是由mirna靶向的。
[0414]
mirna具有调节细胞生长和增殖的总体功能,但它们的功能基本上是消极的;即,抑制rna翻译,这也许通过竞争性结合或促进降解实现。例如,细胞增殖的促进可以涉及mirna功能以抑制生长抑制性蛋白质的翻译,并由此抑制其表达。或者,抑制生长促进蛋白质翻译/表达可以抑制细胞增殖。
[0415]
必须认识到,这些mirna的功能很大程度上是通过研究异常细胞生长来确定的,正如在癌细胞和其他疾病状态中所发现的那样。因此,外推其在正常细胞中的功能需要仔细评估。例如,在癌细胞中仅仅因为已发现mirna升高或抑制,并不一定意味着它们仅促进细胞转化;在癌细胞中细胞增殖和生长抑制之间的平衡已转向细胞增殖。考虑到这一点,在这些肾细胞中已鉴定出大多数上述mirna并不令人惊讶。
[0416]
实验概述:
[0417]
·
使用mirneasy mini kit从每个样品中分离mirna,所述试剂盒可以纯化总rna,包括大约18个核苷酸(nt)以上的rna。使用nanodrop分光光度计对mirna进行定量。
[0418]
·
提供的测序服务:小rna

seq。测序平台:illumina nextseq500。测序平台试剂:nextseq mid output kit v2。用于文库制备的产品:norgen biotek small rna文库制备试剂盒。使用小rna

seq数据分析工作流程:摘录小rna

seq管道(pipeline)(v4.6.2)。(网页链接:genboree.org/thecommons/projects/exrnatools

may2014/wiki/small_rna

seq_pipeline)。小rna参考序列的来源:mirnas mirbase版本21;trnas gtrnadb、pirnas、rnadb、genome gencode版本21(hg38)。
[0419]
结果:
[0420]
对所得序列进行的计算分析,显示由src分泌的外泌体中差异表达以下mirna:
[0421]
·
mir

145

被推测是肿瘤抑制剂。
[0422]
·
mir

22

可以起到肿瘤抑制作用。
[0423]
·
mir
‑7‑
高度保守的mirna,在发育和成熟过程中均显示出受限制的时空表达。也可以用作细胞生长/肿瘤抑制剂。
[0424]
·
mir

10a

调节促炎表型,肾损伤的标志物。实验已证实mir

10a下调人类hoxa1和hoxa3基因。mir

10对hox基因的控制表明该microrna可能在发育中起重要作用。
[0425]
·
mir

143

肿瘤抑制剂,生长抑制剂。
[0426]
·
let7b

鉴于let

7成员在人类癌症和癌症干细胞中的表达水平显著较低,let

7基因的主要功能可能是促进发育和肿瘤抑制中的终末分化。
[0427]
实施例2.5

外泌体macsplex表面标记
[0428]
外泌体表面标志物表征使用由facs分析组成的多重测定进行,所述facs分析用于存在于ev上的已报道的39种表面标志物。
[0429]
实验概述:
[0430]
·
通过超速离心从培养细胞(brc

0、brc

3、brc

3a、src)条件培养基中分离外泌体。
[0431]
·
粒径和浓度通过可调电阻式脉冲传感(trps;(qnano,izon science ltd))使用np150纳米孔膜在47mm拉伸下进行评估,并使用110nm羧化聚苯乙烯珠子,以浓度为1.1x 10e13颗粒/ml的多压力校准对颗粒浓度进行标准化。
[0432]
·
1x 10e10颗粒用于每个样品。
[0433]
·
使用cd63、cd9和cd81的混合物(cocktail)对外泌体进行免疫分离。
[0434]
·
然后筛选该群体中37种不同标志物的表达。
[0435]
结果:见图4
[0436]
从tchk0012和tchk0013分离的外泌体中,与brc相比,对于src,以下标志物上调表达。
[0437]
·
cd133

尽管精确功能尚不清楚,但已提出它可以充当细胞膜拓扑结构的组织者。
[0438]
·
cd326

上皮细胞粘附分子(epcam),是一种跨膜糖蛋白,其介导上皮细胞中不依赖ca2 的同型细胞

细胞粘附。epcam还参与细胞信号转导、迁移、增殖和分化。
[0439]
·
cd49e

除粘附外,已知整合素还参与细胞表面介导的信号转导。
[0440]
实施例2.6

外泌体介导的亲脂性染料转移至肾细胞
[0441]
为了使外泌体递送其蛋白质或核酸运载物,假定外泌体必须附着并与受体细胞膜融合才能实现此目的。外泌体介导的亲脂性染料向细胞膜的递送是证明外泌体与受体细胞融合的一种方法(21)。
[0442]
实验概述:
[0443]
·
染料转移。为了评估外泌体递送其运载物的能力,我们通过流式细胞术监测外泌体将亲脂性染料转移至培养中肾细胞的能力。
[0444]
·
等分试样(aliquot)的外泌体(brc

0、brc

3、src)在37℃下用vybrant dii细胞标记溶液标记20分钟。
[0445]
·
通过超离心去除多余的染料后,将5x e09标记的外泌体添加到6孔培养皿的每个孔中,每个孔含有约250,000个细胞/孔。
[0446]
·
在4摄氏度或37摄氏度下温育4小时后,洗涤培养物以去除未掺入的经标记的外泌体。
[0447]
·
然后回收所回收的细胞,并通过fac进行分析。
[0448]
指示亲脂性染料从外泌体转移到细胞膜的荧光标记细胞导致直方图线的从左向右移动。
[0449]
结果:见图5
[0450]
·
如预期的那样,在4度下未观察到外泌体结合,这由亲脂性染料缺乏转移指示。这支持了这样的观念,细胞需要具有生物活性才能吸收外泌体。
[0451]
·
同样如预期的那样,在无外泌体对照直方图中,与4度直方图相比,没有向右移动。
[0452]
·
直方图之间的区域(如箭头所示)表示吸收染料的细胞群体。
[0453]
·
根据该实验,在brc

0(最大),与brc

3和src(大约相同程度的结合)之间外泌体结合中似乎存在差异。
[0454]
实施例2.7

细胞增殖测定
[0455]
对于外泌体在肾组织修复和再生中发挥作用,可以认为具有刺激肾细胞增殖的能力将是一种理想的功能。
[0456]
实验概述:
[0457]
·
将人肾细胞以50,000个细胞/孔铺放在12孔板上。
[0458]
·
从指定的细胞上清中分离外泌体。
[0459]
·
将25、50、100ul(1x、2x、4x)的外泌体体积添加到各个孔中。
[0460]
·
样品一式两份进行测试。
[0461]
·
处理后3天使用arrayscan计数平板。
[0462]
·
sf=无血清培养基(阴性对照)。
[0463]
·
生长培养基=含血清的培养基(阳性对照)。
[0464]
结果:见图6
[0465]
·
tchk006 brc

3和src的所有经处理的稀释液均能增加细胞增殖,几乎达到相同水平,高于阴性对照。
[0466]
·
tchk004 brc

3和src的处理稀释液显示出对增殖的剂量样效应;只有4x体积的src的增加的增殖高于阴性对照。
[0467]
实施例2.7

小管形成/血管生成测定法
[0468]
刺激血管生成的能力也被认为是组织工程/再生医学产品的一种理想的功能。用于模拟血管生成重组阶段的最广泛使用的体外测定法之一是管形成测定法。该测定法测量以适当的细胞外基质支持铺满汇合密度的内皮细胞形成毛细血管状结构(也称为导管(tube))的能力。科学家通常采用该测定法来确定各种化合物促进或抑制导管形成的能力。铺板后,内皮细胞在周围的细胞外支持基质上附着并产生机械力,以形成促进细胞迁移的轨道(track)或引导途径。所得的细胞索(cord)最终将形成空心管腔。
[0469]
能够抑制管形成的化合物可用于多种疾病,诸如癌症,其中肿瘤刺激新血管形成以吸收氧气和营养,从而生长超出相对较小的尺寸。相反,可刺激管形成的化合物或生物制剂(即外泌体)可用于组织工程/再生医学应用。
[0470]
实验概述:
[0471]
·
将50,000个血管内皮细胞铺放到48孔板中的细胞外基质(geltrex)上。
[0472]
·
将细胞在补充有生长因子的无血清生长培养基中培养,作为阳性对照。
[0473]
·
将细胞在无血清无生长因子培养基中培养,作为阴性对照。
[0474]
·
在补充有外泌体(tchk004、src,10e10颗粒)的无血清和无生长因子的培养基中
society for extracellular vesicles.j extracell vesicles.2014dec22;3:26913.doi:10.3402/jev.v3.26913.ecollection 2014
[0500]
21.deregibus,m.c.,et al.,endothelial progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mrna.blood,2007.110(7):p.2440

8.
[0501]
22.dursun i,poyrazoglu hm,gunduz z,ulger h,yykylmaz a,dusunsel r,patyroglu t,gurgoze m.the relationship between circulating endothelial microparticles and arterial stiffness and atherosclerosis in children with chronic kidney disease.nephrol dial transplant 24:2511

2518,2009.
[0502]
实施例3:存在于人src、brc3/3a和brc0的分泌的外泌体和细胞内囊泡中的mirna的图谱分析
[0503]
src分泌蛋白和外泌体mirna的生物信息学分析鉴定了特定的信号转导途径,所述信号转导途径在通过src衍生的因子激活或失活后,可以调控ckd的进程。这些信号传导途径可以在体外利用,作为其直接与推定的src moa连接的定量效价测定法,和/或所鉴定的蛋白质/mirna可以用作效价的代理(proxies),并可以通过基于elisa/pcr的方法从条件培养基中进行评估。该方法可通过旁分泌机制鉴定参与肾脏疾病进展和src moa功能的信号转导途径,所述旁分泌机制利用分泌的生物活性配体和通过外泌体和其他分泌的微囊泡元件的活性从供体转移到宿主细胞的mirna的活性。
[0504]
mirna是从外泌体中分离出来的,所述外泌体从分泌的培养基或细胞内生态位纯化得到。使用n=6个独立的供体,可以对以下进行统计学上严格的比较:brc3/3a和brc0/src。鉴定出区分这些制备中间体的mirna。
[0505]
方法
[0506]
1.将计算/生物信息学方法应用于细胞分泌组
[0507]
我们已经表征了来自src和src制备中间体(n=6)的分泌组和mirna图谱(细胞内和外泌体)。通过生物信息学方法对数据集进行持续分析,以计算鉴定与疾病相关和与再生相关的信号转导网络,所述信号转导网络受到src产生的分泌蛋白或mirna的直接影响。
[0508]
迄今为止,这些数据表明brc3

brc3a转变(低氧步骤)引起brc细胞群体生物特征的重大变化,使得制备终产物(src)与起始材料(brc0)明显可区分。
[0509]
2.人src、brc3/3a和brc0分泌的外泌体和细胞内囊泡中存在的mirna的图谱分析
[0510]
mirna是从外泌体中分离出来的,所述外泌体从分泌的培养基或细胞内生态位纯化得到。使用n=6个独立的供体,对以下不断进行统计学上严格的比较:brc3/3a和brc0/src。
[0511]
鉴定区分这些制备中间体的mirna。与标准的表型描述和功能分析不同,表征src和brc

0细胞分泌基因组和mirna的方法提供增加的评估(understate)src与brc

0如何不同的深度,而且还为效价测定提供了独特而有用的方法。我们已经收集的数据清楚地区分了src和brc

0。不受任何科学理论的束缚,许多差异很可能是由于低氧步骤所致,因为brc

3、brc

3a和src之间也存在差异。
[0512]
实施例3.1:实验设计
[0513]
项目处理对比对照
1f1

>a12e1

>d1
[0514]
n=6,tchk007

tchk012
[0515]
a1由brc0细胞产生的外泌体。
[0516]
d1由brc3细胞产生的外泌体。
[0517]
e1由brc3a细胞产生的外泌体。
[0518]
f1由src产生的外泌体。
[0519]
实施例3.2

差异表达的mirna
[0520]
基于实验设计,以下表中显示了每个比较中差异表达的mirna的数量。鉴定差异表达的mirna的标准的选择条件如下:|loge倍数变化|≥1并且p值<0.05。
[0521]
表10:差异表达的mirna的数量
[0522]
比较上调的de mirna#下调的de mirna#e1

d173f1

a15526
[0523]
在以下表中,“hsa
‑”
表示人mirna。
[0524]
表11:e1相对d1中排名前10位的差异表达mirna(按p值递增的顺序)
[0525]
前体idmirnalog2倍数变化p值padjhsa

mir

29chsa

mir

29c

5p3.1812320.0038321hsa

mir

29chsa

mir

29c

3p3.2915160.0041171hsa

mir

365bhsa

mir

365b

5p

2.432650.0087751hsa

mir

671hsa

mir

671

3p

1.496420.0095941hsa

mir

582hsa

mir

582

5p3.1577310.0122131hsa

mir

5000hsa

mir

5000

3p

2.912830.0165131hsa

mir

500ahsa

mir

500a

5p2.4183660.0360391hsa

mir

664ahsa

mir

664a

3p1.3265120.0413231hsa

mir

15bhsa

mir

15b

5p

0.847460.0439421hsa

mir

34chsa

mir

34c

5p1.5648160.0445871
[0526]
brc3a/brc3 exo
[0527]
表12:e1相对d1中排名前10位的上调mirna(按倍数变化递减的顺序)
[0528]
前体idmirnalog2倍数变化p值padjhsa

mir

29chsa

mir

29c

3p3.2915160.0041171hsa

mir

29chsa

mir

29c

5p3.1812320.0038321hsa

mir

582hsa

mir

582

5p3.1577310.0122131hsa

mir

5680hsa

mir

56802.5431340.0900181hsa

mir

500ahsa

mir

500a

5p2.4183660.0360391hsa

mir

2277hsa

mir

2277

5p2.3933920.0679111hsa

mir
‑1‑
2hsa

mir
‑1‑
3p2.3716960.0776171hsa

mir

3653hsa

mir

3653

3p2.2485270.0496271
hsa

mir

3651hsa

mir

36512.1772020.0646311hsa

mir
‑7‑
1hsa

mir
‑7‑1‑
3p2.1720730.0796831
[0529]
brc3a/brc3 exo
[0530]
表13:e1相对d1中排名前10位的下调mirna(按倍数变化递增的顺序)
[0531]
前体idmirnalog2倍数变化p值padjhsa

mir

5000hsa

mir

5000

3p

2.912830.0165131hsa

mir

365bhsa

mir

365b

5p

2.432650.0087751hsa

mir

1268ahsa

mir

1268a

2.395380.0748621hsa

mir

1268bhsa

mir

1268b

2.336430.0933621hsa

mir

128

1hsa

mir

128
‑1‑
5p

2.291520.0500571hsa

mir

17hsa

mir

17

3p

2.276290.0651821hsa

mir

4449hsa

mir

4449

2.172790.0701841hsa

mir

7976hsa

mir

7976

2.04480.0874511hsa

mir

642ahsa

mir

642a

3p

1.983540.2401521hsa

mir

5582hsa

mir

5582

3p

1.821810.2196671
[0532]
brc3a/brc3 exo
[0533]
表14:f1相对a1中排名前10位的差异表达mirna(按p值递增的顺序)
[0534]
前体idmirnalog2倍数变化p值padjhsa

mir

204hsa

mir

204

5p

4.663552.90e

091.39e

06hsa

mir

362hsa

mir

362

5p4.8674642.31e

074.80e

05hsa

mir

192hsa

mir

192

5p

2.340053.00e

074.80e

05hsa

mir

203ahsa

mir

203a

3p3.945435.33e

060.000638hsa

mir

22hsa

mir

22

3p3.0501491.63e

050.001488hsa

mir

574hsa

mir

574

3p3.2329231.86e

050.001488hsa

mir

181b

2hsa

mir

181b

5p2.4333675.62e

050.003843hsa

mir

1260bhsa

mir

1260b3.3701567.11e

050.004258hsa

mir

181b

1hsa

mir

181b

5p2.4138529.42e

050.004735hsa

mir

363hsa

mir

363

3p

3.428980.0001010.004735
[0535]
src/brc0 exo
[0536]
表15:f1相对a1中排名前10位的上调mirna(按倍数变化递减的顺序)
[0537][0538]
src/brc0 exo
[0539]
表16:f1相对a1中排名前10位的下调mirna(按倍数变化递增的顺序)
[0540]
前体idmirnalog2倍数变化p值padjhsa

mir

204hsa

mir

204

5p

4.663552.90e

091.39e

06hsa

mir
‑1‑
2hsa

mir
‑1‑
3p

3.988490.0008430.018358hsa

mir
‑1‑
1hsa

mir
‑1‑
3p

3.510650.0044830.060499hsa

mir

363hsa

mir

363

3p

3.428980.0001010.004735hsa

mir

143hsa

mir

143

3p

3.312790.0003370.011515hsa

mir

150hsa

mir

150

5p

3.164670.0312170.228275hsa

mir

509

1hsa

mir

509

3p

3.12110.0431740.265132hsa

mir

509

2hsa

mir

509

3p

3.12110.0431740.265132hsa

mir

509

3hsa

mir

509

3p

3.12110.0431740.265132hsa

mir

653hsa

mir

653

5p

2.92470.048203na
[0541]
src/brc0 exo
[0542]
在图8的火山图中揭示了在实验条件e1相对d1的对之间存在显著性差异的mirna组。在图9的火山图中揭示了在实验条件f1相对a1的对之间存在显著性差异的mirna组。

技术特征:
1.治疗受试者中肾脏疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的分离的分泌的肾细胞囊泡,其中所述囊泡通过静脉内注射或通过经导管递送来施用。2.权利要求1的方法,其中所述囊泡静脉内注射至外周血管中。3.权利要求1的方法,其中所述经导管递送进入所述受试者的左肾动脉或右肾动脉。4.权利要求1

3中任一项的方法,其中所述受试者患有慢性肾脏疾病。5.权利要求4的方法,其中所述慢性肾脏疾病是i、ii、iii、iv或v期肾脏疾病。6.权利要求1

5中任一项的方法,其中治疗所述肾脏疾病包括降低或预防所述受试者中肾脏纤维化。7.权利要求1

6中任一项的方法,其中所述受试者以每周至少1、2或3次接受透析,持续至少1或2周。8.权利要求1

7中任一项的方法,其中所述受试者患有ii型糖尿病。9.权利要求1

8中任一项的方法,其中所述受试者患有肾脏和泌尿道先天性异常(congenital anomalies)(cakut)。10.权利要求1

9中任一项的方法,其中所述受试者具有小于90ml/min/1.73m2的肾小球滤过率(gfr)、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。11.权利要求1

10中任一项的方法,其中不将细胞施用于所述受试者。12.权利要求1

12中任一项的方法,其中所述囊泡包含微囊泡(microvesicle)。13.权利要求1

13中任一项的方法,其中所述囊泡包含直径为约30

150nm的外泌体。14.权利要求1

14中任一项的方法,其中所述囊泡在其外表面上、在其脂质双层中和/或在其内腔中包含化合物。15.权利要求14的方法,其中所述化合物减弱一种或多种细胞途径。16.权利要求14或15中任一项的方法,其中所述化合物是蛋白质、小分子或多核苷酸。17.权利要求16的方法,其中所述多核苷酸是mirna分子。18.权利要求14

17中任一项的方法,其中所述化合物不是由天然存在的肾细胞产生的。19.权利要求14

16中任一项的方法,其中所述化合物是细胞因子。20.权利要求14

16中任一项的方法,其中所述化合物是人工化合物。21.权利要求20的方法,其中所述化合物是用于治疗肾脏疾病的化合物。22.权利要求15

21中任一项的方法,其中所述囊泡包含减弱纤溶酶原激活抑制剂

1(plasminogen activation inhibitor

1)(pai

1)信号转导和/或转化生长因子β(tgfβ)信号转导的化合物。23.权利要求15

21中任一项的方法,其中所述囊泡包含减弱规范wnt信号转导的化合物。24.权利要求15

21中任一项的方法,其中所述囊泡包含减弱非规范wnt信号转导的化合物。25.权利要求15

21中任一项的方法,其中所述囊泡包含减弱cxcr4介导的信号转导的化合物。26.权利要求15

21中任一项的方法,其中所述囊泡包含下调炎性细胞因子的化合物。27.权利要求26的方法,其中所述炎性细胞因子是il8。
28.权利要求15

21中任一项的方法,其中所述囊泡包含减弱notch信号转导的化合物。29.权利要求14

16中任一项的方法,其中所述化合物是用于细胞的免疫表型分型的细胞表面分子。30.权利要求29的方法,其中所述化合物是cd9、cd63、cd81、cd133、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44或cd49e。31.权利要求14的方法,其中所述化合物是蛋白受体。32.权利要求31的方法,其中所述蛋白受体是类视黄醇相关受体(ror4)。33.权利要求14的方法,其中所述化合物是发育阶段标志物。34.权利要求33的方法,其中所述发育阶段标志物是阶段特异性胚胎抗原

4(ssea

4)。35.权利要求14的方法,其中所述化合物是应激保护蛋白(stress

protecting protein)。36.权利要求35的方法,其中所述应激保护蛋白是热休克蛋白(hsp)70或hsp90。37.权利要求14的方法,其中所述化合物是支架蛋白。38.权利要求37的方法,其中所述支架蛋白是tst101。39.权利要求14

17中任一项的方法,其中所述化合物是mirna且在所述囊泡的腔中。40.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是细胞周期调节mirna。41.权利要求40的方法,其中所述细胞周期调节mirna是let7a、mir

143或mir22。42.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是细胞衰老调控mirna。43.权利要求42的方法,其中所述细胞衰老调控mirna是mir

34。44.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是细胞迁移调控mirna。45.权利要求44的方法,其中所述细胞迁移调控mirna是mir30

c。46.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是细胞生长调节mirna。47.权利要求46的方法,其中所述细胞生长调节mirna是mir194

2。48.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是细胞信号途径调控mirna。49.权利要求48的方法,其中所述细胞信号途径调控mirna是mir

142。50.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是炎症调控mirna。51.权利要求50的方法,其中所述炎症调控mirna是mir

10a。52.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是血管生成调控mirna。53.权利要求52的方法,其中所述血管生成调控mirna是mir

296和/或mir

146a。54.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述mirna是激酶活性调控mirna。55.权利要求54的方法,其中所述激酶活性调控mirna是mir

83。56.权利要求14

17或39中任一项的方法,其中所述化合物是抑制pai

1、tgfβ、规范wnt信号转导、非规范wnt信号转导、cxcr4介导的信号转导和/或notch信号转导的mirna。57.权利要求6

56中任一项的方法,其中通过抑制上皮到间充质转化(mesenchymal transition)(emt)来降低或预防肾脏纤维化。58.权利要求1

57中任一项的方法,其中囊泡包含mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143和/或let7b。59.权利要求1

58中任一项的方法,其中囊泡包含mir

1248、mir

3168、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p。60.权利要求1

59中任一项的方法,其中所述囊泡包含cd9、cd63、cd81、cd133、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e和/或ssea

4。61.权利要求60的方法,其中所述囊泡包含cd63、cd9和/或cd81,且所述cd63、cd9和/或cd81在所述囊泡的外表面上。62.权利要求60的方法,其中所述囊泡包含cd133、cd326和/或cd49e,且所述cd133、cd326和/或cd49e在所述囊泡的外表面上。63.权利要求1

62中任一项的方法,其中与未与所述囊泡接触的肾细胞相比,与所述囊泡接触的肾细胞的增殖增加。64.权利要求1

63中任一项的方法,其中与未与所述囊泡接触的内皮细胞相比,与所述囊泡接触的内皮细胞的血管形成增加。65.权利要求1

64中任一项的方法,其中与未与所述囊泡接触的肾细胞相比,与所述囊泡接触的肾细胞的肾单位肾小管(nephron tubule)形成增加。66.权利要求1

65中任一项的方法,其中所述囊泡包含磷脂、鞘磷脂、胆固醇、神经酰胺(cerimide)和/或磷脂酰胆碱。67.权利要求1

67中任一项的方法,其中所述囊泡处于包含药学上可接受的载体的组合物中。68.权利要求67的方法,其中所述药学上可接受的载体包含水性溶液。69.权利要求1

68中任一项的方法,其中所述囊泡已由原代肾细胞群体分泌。70.权利要求69的方法,其中所述细胞已传代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。71.权利要求1

70中任一项的方法,其中所述囊泡已由富集的肾细胞群体分泌,其中所述富集的肾细胞群体包含生物活性的肾细胞。72.权利要求71的方法,其中所述群体包含:(a)肾小管细胞的富集群体;或(b)肾小球细胞以及血管细胞中一种或多种,和肾小管细胞的富集群体。73.权利要求71或72的方法,其中所述群体衍生自起始肾细胞群体,且与所述起始群体相比包含更大百分比的肾小管细胞。74.权利要求73的方法,其中所述群体包含肾小球细胞。75.权利要求74的方法,其中所述群体包含血管细胞。76.权利要求69

75中任一项的方法,其中所述群体对于所述受试者是非自体的。77.权利要求69

75中任一项的方法,其中所述群体对于所述受试者是自体的。78.权利要求69

75中任一项的方法,其中所述群体是同种异体的。79.权利要求70

78中任一项的方法,其中所述群体的细胞是低氧和/或碘克沙醇抗性的。80.权利要求70

79中任一项的方法,其中所述群体中的细胞表达ck18和/或ggt1。81.权利要求70

80中任一项的方法,其中所述群体具有lap和/或ggt酶活性。82.权利要求70

81中任一项的方法,其中所述群体中至少80%的细胞表达ggt

1。83.权利要求70

82中任一项的方法,其中所述群体表达vegf和/或kim

1。84.权利要求70

83中任一项的方法,其中所述群体中4.5%至81.2%的细胞表达ggt

1,所述群体中3.0%至53.7%的细胞表达aqp2,并且所述群体中81.1%至99.7%的细胞表达ck18。85.权利要求70

84中任一项的方法,其中与来自肾脏活组织检查的肾细胞的原代培养物相比,所述群体富含肾小管细胞,且通过透明质酸合酶2(hyaluronic acid synthase)(has

2)的作用,所述肾小管细胞在体外和体内均表达较高分子量种类的透明质酸(ha)。86.权利要求70

85中任一项的方法,其中与来自肾脏活组织检查的肾细胞的原代培养物相比,所述生物活性的肾细胞群体具有较少比例的远端肾小管细胞、集合管细胞、内分泌细胞、血管细胞和/或祖样细胞(progenitor

like cell)。87.权利要求1

68或70

86中任一项的方法,其进一步包括将由原代肾细胞分泌的囊泡施用于所述受试者。88.权利要求1

87中任一项的方法,其进一步包括将由内皮细胞或间充质干细胞(mesenchymal stem cell)分泌的囊泡施用于所述受试者。89.权利要求1

88中任一项的方法,其进一步包括向所述受试者施用非肾细胞囊泡。90.权利要求89的方法,其中所述非肾细胞囊泡是由非肾内皮祖细胞、非肾间充质干细胞或非肾脂肪来源的祖细胞分泌的。91.用于检测囊泡中至少一种化合物的方法,所述方法包括获得所述囊泡并检测所述至少一种化合物是否在所述囊泡中,其中(i)所述至少一种化合物是蛋白质,且所述蛋白质是cd9、cd81、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e和/或ssea

4;(ii)所述至少一种化合物包含mirna,其中所述mirna包括mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143和/或let7b中的至少两种;和/或(iii)所述至少一种化合物不由天然肾脏中的肾细胞表达或产生。92.权利要求91的方法,其中所述囊泡在来自受试者的生物样品中获得或从来自受试者的生物样品中获得。93.权利要求92的方法,其中所述生物样品是尿液。94.权利要求91的方法,其中所述囊泡是在肾细胞的培养物的上清液中或从肾细胞的培养物的上清液中获得。95.权利要求91

94中任一项的方法,其中所述囊泡已由肾细胞分泌。96.权利要求91

95中任一项的方法,其中检测所述蛋白质是否在所述囊泡中包括免疫测定。97.权利要求91

96中任一项的方法,其中检测所述mirna是否在所述囊泡中包括使所述囊泡、或怀疑包含来自所述囊泡的核酸的经处理的样品与和所述mirna互补的探针或引物接触。98.权利要求91

97中任一项的方法,其中检测所述mirna是否在所述囊泡中不包括微阵列分析。99.权利要求91

97中任一项的方法,其中检测所述mirna是否在所述囊泡中包括用微阵列进行微阵列分析,其中所述微阵列包含针对少于1000、500或100种不同mirna的探针。100.权利要求91

99中任一项的方法,其中检测所述mirna是否在所述囊泡中包括聚合酶链反应。
101.权利要求91

100中任一项的方法,其中所述化合物是小分子。102.权利要求91

101中任一项的方法,其中所述化合物是用于治疗肾脏疾病的化合物。103.用于在已施用生物活性的肾细胞群体的受试者中监测用所述生物活性的肾细胞群体治疗的方法,其包括根据权利要求91

102中任一项的方法,检测来自所述受试者的囊泡中是否存在至少一种化合物。104.权利要求103的方法,其包括根据权利要求91

102中任一项的方法,在第一时间点和第二时间点检测来自所述受试者的囊泡中是否存在至少一种化合物。105.权利要求104的方法,其中所述第一时间点是在所述受试者已经施用了所述生物活性的肾细胞群体之前,而所述第二时间点是在所述受试者已经施用了所述生物活性的肾细胞群体之后。106.权利要求104的方法,其中所述第一时间点和所述第二时间点是在所述受试者已经施用了所述生物活性的肾细胞群体之后。107.权利要求104

106中任一项的方法,进一步包括如果所述化合物的水平在所述第一时间点相比于所述第二时间点更高,则鉴定所述受试者中的再生作用。108.权利要求104

106中任一项的方法,其进一步包括如果所述化合物的水平高于对照,则鉴定所述受试者中的再生作用。109.权利要求108的方法,其中所述对照是在尚未施用所述生物活性的肾细胞群体的相应受试者中的水平。110.鉴定囊泡是否是再生性的方法,所述方法包括:(i)根据权利要求49

58中任一项的方法检测所述囊泡中是否存在蛋白质和/或mirna;和(ii)如果在所述囊泡中检测到所述蛋白质和/或mirna,则将所述囊泡鉴定为是再生性的。111.检测来自生物活性的肾细胞群体的囊泡中至少一种mirna的水平的方法,所述方法包括:(i)检测与对照相比,在所述囊泡中以下mirna分子中的一种或多种是否增加:mir

1248、mir

3168、mir

362

5p、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p;和(ii)检测与对照相比,在所述囊泡中以下mirna分子中的一种或多种是否减少:mir
‑1‑
3p、mir
‑1‑
3p、mir

143

3p、mir

150

5p、mir

509

3p、mir

653

5p、mir

204

5p、mir

192

5p和/或mir

363

3p。112.权利要求111的方法,其中所述生物活性的肾细胞是所选择的肾细胞。113.权利要求111或112的方法,其中所述对照是来自原代肾细胞群体的一个或多个mirna分子囊泡的水平。114.权利要求111或112的方法,其中所述对照是来自另一种生物活性的肾细胞群体的一个或多个mirna分子囊泡的水平。115.治疗受试者中肾脏疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的来自囊泡制剂的囊泡,其中来自所述囊泡制剂的囊泡根据权利要求110的方法已经鉴定是再生性
的。116.治疗受试者中肾脏疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含生物活性的肾细胞群体的组合物,所述生物活性的肾细胞群体补充有尚未由所述生物活性的肾细胞群体分泌的肾细胞囊泡。117.权利要求116的方法,其中所述生物活性的肾细胞群体是所选择的肾细胞群体。118.权利要求116或117的方法,其中所述肾细胞囊泡已经由与所述组合物中的所述生物活性的肾细胞群体具有相同来源和/或含有相同细胞类型的生物活性的肾细胞群体分泌。119.改变由生物活性的肾细胞群体产生的囊泡中至少一种mirna和/或蛋白质的水平的方法,所述方法包括在低氧条件下培养所述群体。120.权利要求119的方法,其中在低氧条件下培养所述群体包括在少于5%的氧气存在下培养所述群体至少约8、12、16、20、24或48小时。121.权利要求119或120的方法,其进一步包括传代所述生物活性的肾细胞至少约1、2或3次,之后在低氧条件下培养所述群体。122.权利要求119

120中任一项的方法,其中(a)所述至少一种mirna是mir

145、mir

22、mir

7、mir

10a、mir

143、let7b、mir

1248、mir

3168、mir

7113

5p、mir

758

3p、mir

937

3p、mir

4455、mir

4521、mir

203a

3p、mir

22

3p、mir

574

3p、mir

181b

5p、mir

1260b和/或mir

181b

5p;和/或(b)所述至少一种蛋白质是cd9、cd63、cd81、cd133、cd146、cd326、cd40、cd42a、cd44、cd49e、ssea

4、tst101、hsp70、hsp90和/或ror4。123.囊泡,其包含不由天然肾脏中的肾细胞产生的化合物。124.权利要求123的囊泡,其中所述化合物是蛋白质、小分子或多核苷酸。125.权利要求123或124的囊泡,其中所述化合物不由在缺乏所述化合物的情况下培养的原代肾细胞表达或产生。126.权利要求125的囊泡,其中所述化合物是人工化合物。127.权利要求123

126中任一项的囊泡,所述化合物是用于治疗肾脏疾病的化合物。128.权利要求123

127中任一项的囊泡,其为微囊泡。129.权利要求128的囊泡,其为外泌体。130.权利要求123

129中任一项的囊泡,其处于包含产生所述囊泡的细胞的组合物中。131.权利要求123

129中任一项的囊泡,其已从产生它的所述细胞中分离出来。132.权利要求123

131中任一项的囊泡,其为肾囊泡。133.权利要求123

132中任一项的囊泡,其已由生物活性的肾细胞产生。134.组合物,其包含权利要求123

133中任一项的囊泡和药学上可接受的载体。135.组合物,其包含肾细胞囊泡和非肾细胞囊泡。136.权利要求135的组合物,其中所述肾细胞囊泡已由生物活性的肾细胞分泌。137.权利要求135或136的组合物,其中所述非肾细胞囊泡已由非肾内皮祖细胞、非肾间充质干细胞或非肾脂肪来源的祖细胞分泌。138.组合物,其包含由原代肾细胞产生的囊泡和由所选择的肾细胞产生的囊泡。139.治疗受试者中肾脏疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要
求134

138中任一项的所述组合物。140.从细胞产生外泌体的方法,其中所述外泌体包含不由所述细胞产生的化合物,所述方法包括从细胞培养上清液中分离所述外泌体,其中所述细胞培养上清液来自于与所述化合物接触的细胞培养物。141.产生肾脏外泌体的方法,其中所述外泌体包含不由天然肾脏中肾细胞产生的化合物,所述方法包括从肾细胞培养上清液分离囊泡,其中所述肾细胞培养上清液来自肾细胞培养物,所述肾细胞培养物包含已与所述化合物接触过的生物活性的肾细胞群体。142.权利要求140或141的方法,其中所述化合物是人工化合物。
技术总结
本文尤其提供了由肾细胞(诸如生物活性的肾细胞,例如,所选择的肾细胞)产生的细胞外产物(例如,囊泡诸如微囊泡(microvesicle),例如,外泌体(exosome)。还包括改变由细胞产生的囊泡的组分(诸如miRNA或蛋白质)的方法,以及产生包含各种化合物的囊泡的方法。还提供了诊断和治疗方法。断和治疗方法。断和治疗方法。


技术研发人员:蒂莫西.伯特伦 迪帕克.简
受保护的技术使用者:迪帕克.简
技术研发日:2019.08.28
技术公布日:2021/6/29

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