一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法与流程

1.本发明涉及动物组织培养技术领域，具体来说是一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法。


背景技术：

2.麝香是传统中药的重要成分。《中国药典》2020年版记载，麝香具有开窍醒神，活血通经，消肿止痛的功效。现代药学著作均视麝香为药材之珍品。在中成药及成药的实际应用中，麝香常居牛黄、犀角、熊胆等名贵动物药材之首。《全国中成药处方集》收载的2621个处方中，含麝香的处方就有295个。由于天然麝香的产量极低，每头雄性林麝每年只能产15克左右，因此麝香就显得极其珍贵，市场价格在黄金的3倍以上，香腺上皮细胞是香腺中起分泌作用的功能细胞，每年5月下旬前后，林麝香腺开始肿大，香腺细胞分泌的初香液顺着导管流入香囊中。这些研究结果使人们对林麝香腺的宏观解剖结构与超微结构有了较为全面的了解。
3.为了满足市场对麝香的需求，近年来，科研人员正积极寻求通过细胞生物学体外培养的方法获取麝香。前人也为此进行了尝试，但无法克服林麝香腺组织采集困难、香腺上皮细胞培养时生长缓慢、林麝香腺上皮细胞凋亡的问题。
4.本申请人发现现有技术至少存在以下技术问题：
5.1、由于目前无有效安全的林麝麻醉方法，因此现有麻醉林麝采集香腺组织的方法对林麝造成伤害，且细胞量不足；
6.2、现有技术中在对林麝香腺细胞培养时，上皮细胞生长缓慢；
7.3、现有技术中在林麝香腺细胞培养时，在上皮细胞培养到第5代以后就凋亡了，无法满足体外细胞培养生产麝香的要求。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，以解决现有技术中林麝香腺细胞培养时，在上皮细胞培养到第5代以后就凋亡的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
9.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
10.本发明提供的一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，包括下述步骤：
11.(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；
12.(2)将步骤(1)采集的林麝香腺组织的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；
13.(3)将步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；
14.(4)将步骤(3)中得到的转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；
15.(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞。
16.进一步的，所述步骤(1)中，所述林麝香腺组织采集后立即转移至含有青链霉素的pbs中。
17.进一步的，所述青链霉素为100u/ml。
18.进一步的，所述步骤(2)中，林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化的方法包括下述步骤：
19.①
将步骤(1)采集的林麝香腺组织剪碎至1
‑
2mm3；然后在0.05
‑
0.3％的iv型胶原酶36
‑
38℃消化3
‑
5小时；然后用完全培养基重悬浮洗涤2
‑
4次；1300
‑
2000r/m离心2
‑
3min，收集上清液；
20.②
将步骤
①
收集的上清液接种于完全培养基中，所述完全培养基中血清的含量为10％；在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养，每24h
‑
36h换液1次；
21.③
培养3
‑
5天后，待成纤维细胞贴壁，而上皮细胞未贴壁时，吸取上清液，接种于另一个细胞瓶中；
22.④
继续培养2
‑
3天后，上皮细胞开始贴壁生长，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为2
‑
5％；如还有成纤维细胞贴壁，则采用无菌接种环刮除成纤维细胞团块；
23.⑤
继续培养7
‑
10天后，单层上皮细胞加速生长时，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为8
‑
10％，继续进行培养；培养后得到纯化后的林麝香腺上皮细胞。
24.进一步的，所述步骤
①
和步骤
②
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml；
25.所述步骤
③
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为2
‑
5％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml；
26.所述步骤
⑤
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为8
‑
10％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml；
27.进一步的，所述步骤
⑤
中，当单层细胞开始汇合时，采用0.25
‑
0.50mg/ml胰蛋白酶消化。
28.进一步的，所述步骤(3)中，所述慢病毒转染为sv40病毒转染、eb病毒转染或人乳头瘤病毒转染。
29.进一步的，所述步骤(3)中，所述慢病毒转染为sv40病毒转染，具体为：为步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
×
105个；第二天，待细胞贴壁后，换液，加入1ml完全培养基，再加20μl sv40过表达慢病毒，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，当细胞长满板底后，传代至t25培养瓶中，培养后获得永生化林麝香腺上皮细胞。
30.进一步的，所述步骤(3)中，所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml。
31.进一步的，所述步骤(4)中，将转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞的具体步骤为：
32.①
确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d；
33.②
通过步骤
①
确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞。
34.进一步的，所述步骤
①
中，确定嘌呤霉素的使用浓度和作用时间的具体步骤为：
35.a、将未转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％；
36.b、24
‑
26h后，除去步骤a中24孔板中的培养基；
37.c、将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml和7ug/ml；培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％；
38.d、最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1
‑
4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d。
39.进一步的，所述步骤
②
中，筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞的具体步骤为：
40.a、将步骤(1)中转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％；
41.b、24
‑
26h后，除去a步骤中24孔板中的培养基，
42.c、加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％，加入的嘌呤霉素浓度为2ug/ml；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；
43.d、在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的林麝香腺上皮细胞。
44.基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
45.本发明提供的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，采集泌香期因患病死亡林麝的大块香腺组织，保证了足够的细胞量的同时对活体林麝不造成伤害；在细胞培养时，采用差速贴壁法和物理刮除法将成纤维细胞和上皮细胞进行分离纯化，降低了成纤维细胞对上皮细胞的影响，保证了上皮细胞的生长速度，在细胞纯化后，采用慢病毒转染的方式永生化香腺上皮细胞，培养12代以后完全能保持上皮细胞的特性，克服了上皮细胞凋亡的缺点。
附图说明
46.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
47.图1是本发明实施例1中林麝香腺原代细胞培养图(铺路石状细胞为上皮细胞，荧光倒置显微镜200倍)；
48.图2是本发明实施例1中林麝香腺原代细胞培养图(铺路石状细胞为上皮细胞，荧光倒置显微镜400倍)
49.图3是本发明实施例1中林麝香腺p2细胞培养图(纯化后，铺路石状细胞为上皮细胞，荧光倒置显微镜400倍)
50.图4是本发明实施例1中林麝香腺细胞永生化前培养图(铺路石状细胞为上皮细胞，荧光倒置显微镜400倍)
51.图5是本发明实施例1中林麝香腺细胞永生化转染后培养图(铺路石状细胞为上皮细胞，荧光倒置显微镜800倍)
52.图6是本发明实施例1中林麝香腺细胞永生化(扩增培养p12)(铺路石状细胞为上皮细胞，荧光倒置显微镜400倍)；
53.图7是本发明实施例1中获得的永生化林麝香腺上皮细胞的细胞免疫荧光鉴定照片(100x)；
54.图8是本发明实施例1中获得的永生化林麝香腺上皮细胞的细胞免疫荧光鉴定照片(200x)；
55.图9为本发明实施例中使用的sv40过表达慢病毒载体图谱。
具体实施方式
56.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
57.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
58.下述实施例1
‑
3中：
59.所使用的上皮细胞完全培养基为primed
‑
icell
‑
001赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；
60.所使用的sv40过表达慢病毒(如图9所示)购买于汉尹生物；
61.载体目的序列信息如下：
62.gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattc(atggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatga
ttttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaa)tctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc；括号内为目的序列区。
63.一、实施例
64.实施例1：
65.一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，包括下述步骤：
66.(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；采集后立即转移至含有青链霉素的pbs中，所述青链霉素为100u/ml；
67.(2)将步骤(1)采集的林麝香腺组织(如图1和图2所示)的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；具体包括下述步骤：
68.①
将步骤(1)采集的林麝香腺组织剪碎至1
‑
2mm3；然后在0.2％的iv型胶原酶37℃消化4小时；然后用完全培养基重悬浮洗涤3次；1600r/m离心2.5min，收集上清液；
69.②
将步骤
①
收集的上清液接种于完全培养基中，所述完全培养基中血清的含量为10％；在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养，每30h换液1次；所述步骤
①
和步骤
②
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为13ng/ml；
70.③
培养5天后，待成纤维细胞贴壁，而上皮细胞未贴壁时，吸取上清液，接种于另一个细胞瓶中；
71.④
继续培养2天后，上皮细胞开始贴壁生长，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为3.5％；如还有成纤维细胞贴壁，则采用无菌接种环刮除成纤维细胞团块；所述步骤
④
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为3.5％，所述epc因子的含量为13ng/ml；
72.⑤
继续培养9天后，单层上皮细胞加速生长时，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为9％，继续进行培养；培养后得到纯化后的林麝香腺上皮细胞(如图3所示)；所述步骤
⑤
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为9％，所述epc因子的含量为13ng/ml；
73.(3)将步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；
74.所述慢病毒转染为sv40病毒转染，具体为：为步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
×
105个；第二天，待细胞贴壁后，换液，加入1ml完全培养基，再加20μl sv40过表达慢病毒，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，当细胞长满板底后，传代至t25培养瓶中，培养后获得获得转染的林麝香腺上皮细胞；所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为12.5ng/ml；
75.(4)将步骤(3)中得到的转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞(如图4所示)；具体步骤为：
76.①
确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d；
77.a、将未转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为3.5％；
78.b、24h后，除去a步骤中24孔板中旧的培养基；
79.c、将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml和7ug/ml；培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为3.5％；
80.d、最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1
‑
4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d。
81.②
通过步骤
①
确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；具体步骤为：
82.a、将步骤(1)中转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为3.5％；
83.b、24h后，除去a步骤中24孔板中的培养基，
84.c、加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为3.5％，加入的嘌呤霉素浓度为2ug/ml；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；
85.d、在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的林麝香腺上皮细胞；
86.(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞(如图5和图6所示)。
87.实施例2：
88.一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，包括下述步骤：
89.(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；采集后立即转移至含有青链霉素的pbs中，所述青链霉素为100u/ml；
90.(2)将步骤(1)采集的林麝香腺组织的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；具体包括下述步骤：
91.①
将步骤(1)采集的林麝香腺组织剪碎至1
‑
2mm3；然后在0.3％的iv型胶原酶37℃消化5小时；然后用完全培养基重悬浮洗涤2次；1300r/m离心3min，收集上清液；
92.②
将步骤
①
收集的上清液接种于完全培养基中，所述完全培养基中血清的含量为10％；在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养，每24h换液1次；所述步骤
①
和步骤
②
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为15ng/ml；
93.③
培养3天后，待成纤维细胞贴壁，而上皮细胞未贴壁时，吸取上清液，接种于另一个细胞瓶中；
94.④
继续培养3天后，上皮细胞开始贴壁生长，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为2％；如还有成纤维细胞贴壁，则采用无菌接种环刮除成纤维细胞团块；所述步骤
④
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为2％，所述epc因子的含量为15ng/ml；
95.⑤
继续培养8天后，单层上皮细胞加速生长时，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为10％，继续进行培养；培养后得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；所述步骤
⑤
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为15ng/ml；
96.(3)将步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；
97.所述慢病毒转染为sv40病毒转染，具体为：为步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
×
105个；第二天，待细胞贴壁后，换液，加入1ml完全培养基，再加20μl sv40过表达慢病毒，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，当细胞长满板底后，传代至t25培养瓶中，培养后获得获得转染的林麝香腺上皮细胞；所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为15ng/ml；
98.(4)将步骤(3)中得到的转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；具体步骤为：
99.①
确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d；
100.a、将未转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为5％；
101.b、24h后，除去步骤a中24孔板中的培养基；
102.c、将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml和7ug/ml；培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为5％；
103.d、最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1
‑
4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d。
104.②
通过步骤
①
确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的林麝香腺
上皮细胞；具体步骤为：
105.a、将步骤(1)中转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为5％；
106.b、24h后，除去步骤a中24孔板中的培养基，
107.c、加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为5％，加入的嘌呤霉素浓度为2ug/ml；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；
108.d、在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的林麝香腺上皮细胞；
109.(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞。
110.实施例3：
111.一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，包括下述步骤：
112.(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；采集后立即转移至含有青链霉素的pbs中，所述青链霉素为100u/ml；
113.(2)将步骤(1)采集的林麝香腺组织的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；具体包括下述步骤：
114.①
将步骤(1)采集的林麝香腺组织剪碎至1
‑
2mm3；然后在0.05％的iv型胶原酶38℃消化3小时；然后用完全培养基重悬浮洗涤4次；2000r/m离心2min，收集上清液；
115.②
将步骤
①
收集的上清液接种于完全培养基中，所述完全培养基中血清的含量为10％；在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养，每36h换液1次；所述步骤
①
和步骤
②
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为10ng/ml；
116.③
培养4天后，待成纤维细胞贴壁，而上皮细胞未贴壁时，吸取上清液，接种于另一个细胞瓶中；
117.④
继续培养3天后，上皮细胞开始贴壁生长，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为5％；如还有成纤维细胞贴壁，则采用无菌接种环刮除成纤维细胞团块；所述步骤
④
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为5％，所述epc因子的含量为10ng/ml；
118.⑤
继续培养8天后，单层上皮细胞加速生长时，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为8
‑
10％，继续进行培养；培养后得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；所述步骤
⑤
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为8％，所述epc因子的含量为10ng/ml；
119.(3)将步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；
120.所述慢病毒转染为sv40病毒转染，具体为：为步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
×
105个；第二天，待细胞贴壁后，换液，加入1ml完全培养基，再加20μl sv40过表达慢病毒，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，当细胞长满板底后，传代至t25培养瓶中，培养后获得获得转染的林麝香腺上皮细胞；所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗
的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为10ng/ml；
121.(4)将步骤(3)中得到的转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；具体步骤为：
122.①
确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d；
123.a、将未转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2％；
124.b、26h后，除去步骤a中24孔板中的培养基；
125.c、将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml和7ug/ml；培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2％；
126.d、最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1
‑
4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d。
127.②
通过步骤
①
确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；具体步骤为：
128.a、将步骤(1)中转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2％；
129.b、26h后，除去步骤a中24孔板中的培养基，
130.c、加入，孵育，筛选培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2％，加入的嘌呤霉素浓度为2ug/ml；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；
131.d、在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的林麝香腺上皮细胞；
132.(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞。
133.二、实验例：
134.将实施例1获得的永生化林麝香腺上皮细胞进行细胞免疫荧光鉴定：
135.1、试验所需仪器设备及试剂
136.(1)仪器，如表1所示：
137.表1仪器
138.仪器名称规格型号厂家生物安全柜bsc
‑
1500ⅱa2
‑
x济南鑫贝西生物技术有限公司co2细胞培养箱bc
‑
j160s上海博迅实业有限公司荧光倒置显微镜ds
‑
ri2nikon高速冷冻离心机multifuge x1rthermo fisher电热恒温鼓风干燥箱dhg
‑
9123a上海精宏实验设备有限公司
139.(2)试剂耗材，如表2所示：
140.表2试剂耗材
[0141][0142][0143]
2、实验步骤：
[0144]
(1)细胞爬片
[0145]
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1ml，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
[0146]
(2)固定
[0147]
细胞爬片后，吸出培养基，用pbs洗1遍，加入4％pfa于4℃固定30min。用pbs洗3
×
5min/次。也可最后一次不吸出pbs，放4℃过夜。
[0148]
(3)破膜封闭
[0149]
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
[0150]
玻璃片封闭液配置：0.5％trition x
‑
100与pbs 1:1混合，再加10％血清，取50ul破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
[0151]
(4)一抗孵育
[0152]
一抗配制：抗体与pbs 1:100(200)稀释
[0153]
破膜封闭后，取50ul一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)
[0154]
(5)二抗孵育
[0155]
室温避光孵育二抗(二抗:pbs＝1:500)2h后，pbs洗3
×
5min/次，染dapi(dapi:pbs＝1:1000)5min，pbs洗3
×
5min/次。
[0156]
(6)包埋
[0157]
玻片上各滴1滴fluoromount
‑
g，将有细胞的一面盖上。
[0158]
3、实验结果：经免疫荧光鉴定，该细胞cd18阳性率可达到90％以上，鉴定结果如图7和图8所示。
[0159]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；(2)将步骤(1)采集的林麝香腺组织的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；(3)将步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；(4)将步骤(3)中得到的转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞。2.根据权利要求1所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述林麝香腺组织采集后立即转移至含有青链霉素的pbs中。3.根据权利要求2所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述青链霉素为100u/ml。4.根据权利要求1所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中，林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化的方法包括下述步骤：
①
将步骤(1)采集的林麝香腺组织剪碎至1
‑
2mm3；然后在0.05
‑
0.3％的iv型胶原酶36
‑
38℃消化3
‑
5小时；然后用完全培养基重悬浮洗涤2
‑
4次；1300
‑
2000r/m离心2
‑
3min，收集上清液；
②
将步骤
①
收集的上清液接种于完全培养基中，所述完全培养基中血清的含量为10％；在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养，每24h
‑
36h换液1次；
③
培养3
‑
5天后，待成纤维细胞贴壁，而上皮细胞未贴壁时，吸取上清液，接种于另一个细胞瓶中；
④
继续培养2
‑
3天后，上皮细胞开始贴壁生长，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为2
‑
5％；如还有成纤维细胞贴壁，则采用无菌接种环刮除成纤维细胞团块；
⑤
继续培养7
‑
10天后，单层上皮细胞加速生长时，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为8
‑
10％，继续进行培养；培养后得到纯化后的林麝香腺上皮细胞。5.根据权利要求4所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤
①
和步骤
②
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml；所述步骤
③
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为2
‑
5％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml；所述步骤
⑤
中所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为8
‑
10％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml；当单层细胞开始汇合时，采用0.25
‑
0.50mg/ml胰蛋白酶消化。6.根据权利要求1所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述慢病毒转染为sv40病毒转染，具体为：为步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
×
105个；第二天，待细胞贴壁后，换液，加入1ml完全培养基，再加20μl sv40过表达慢病毒，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜的
完全培养基，当细胞长满板底后，传代至t25培养瓶中，培养后获得永生化林麝香腺上皮细胞。7.根据权利要求6所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所使用的完全培养基是以dmem为基础培养基，并添加有双抗、血清和epc因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述epc因子的含量为10
‑
15ng/ml。8.根据权利要求1所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞的具体步骤为：
①
确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d；
②
通过步骤
①
确定的嘌呤霉素使用浓度和作用时间筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞。9.根据权利要求8所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤
①
中，确定嘌呤霉素的使用浓度和作用时间的具体步骤为：a、将未转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％；b、24
‑
26h后，除去步骤a中24孔板中的培养基；c、将含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基分别加入已铺有细胞的24孔板，48h对应更换一次新鲜培养基，并每天观察细胞的存活比例；所述嘌呤霉素的浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml和7ug/ml；培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％；d、最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1
‑
4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度；结果确定嘌呤霉素的使用浓度为2ug/ml，作用时间为2d。10.根据权利要求8所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤
②
中，筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞的具体步骤为：a、将步骤(1)中转染的林麝香腺上皮细胞按每孔0.05million铺入24孔板进行孵育，培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％；b、24
‑
26h后，除去步骤a中24孔板中的培养基，c、加入筛选培养基，孵育，筛选培养基为上皮细胞完全培养基，血清浓度为2
‑
5％，加入的嘌呤霉素浓度为2ug/ml；48h更换一次新鲜的筛选培养基，并每天观察细胞的存活比例；d、在同一时间点存活的细胞，即为转染成功的林麝香腺上皮细胞。
技术总结
本发明提供了一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法。它包括下述步骤：(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；(2)将林麝香腺组织的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；(3)将纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；(4)将转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞。本发明提供的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，采用慢病毒转染的方式永生化香腺上皮细胞，培养12代以后完全能保持上皮细胞的特性，克服了上皮细胞凋亡的缺点。缺点。缺点。


技术研发人员：竭航 郑程莉 赵春容 张明 任妍
受保护的技术使用者：四川养麝研究所
技术研发日：2021.01.12
技术公布日：2021/6/24