对DNA片段进行标记的单分子标签的制作方法

本申请是申请日为2018年06月20日、申请号为201810638123.6、发明名称为一种单分子标签及其应用的专利申请的分案申请。本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种对dna片段进行标记的单分子标签。
背景技术：
：dna测序作为一种非常重要的实验技术，在生物学研究领域中有着广泛应用，特别是在基因检测行业。从最初的末端终止法，到目前比较成熟的第二代测序技术(next-generationsequencing)。目前的二代测序较一代测序而言，费用更低，通量更高，速度更快。illumina测序的基本原理是边合成边测序。在文库构建过程中，需要将基因组dna随机片段化，并在片段化后的基因组两端添加特定测序接头(adaptor)，然后进行文库pcr扩增。由于最后的pcr扩增和片段化的随机性，使得最终文库测序的每个读长存在一个问题，即不确定所得读长最初是由哪个模版扩增而来。cn106834503a提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离dna扩增癌症基因的引物组、引物标签设计方法及应用，该发明通过给每个起始样品dna分子模板两边加标签的方式，给模板中的每个dna分子都贴上分子标签，在经过pcr和测序以后，可以通过分子标签将样本中原始的dna分子都鉴别分类，进而可以通过标签去除或降低ngs测序中pcr扩增以及测序阶段引入的系统误差。cn107254514a公开了一种检测异源cfdna的snp分子标记，基于snp分子标记设计的检测探针和芯片，以及异源cfdna的检测装置、试剂盒和检测方法；snp分子标记中包括药物代谢基因的snp位点，为肾移植排斥患者提供用药基因的突变信息，实现个体化用药；该发明还提供了一种单分子标记接头，单分子标记接头用于构建测序文库有效去除重复数据和测序、pcr过程中随机引入的错误，降低测序背景噪音，提高了检测的准确性。但上述现有技术均无法对测序读长进行有效溯源的目标，且操作步骤复杂，对设备要求高，难以应用推广。综上，研发一种单分子标签及其应用，对每条最初的dna片段进行标记，从而在最终测序结果中呈现每条读长的具体来源，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种单分子标签及其应用，通过设计特异性的标签，并选择与标签相适配的引入方法，在构建文库前期对dna样品进行处理，以实现对每条最初的dna片段进行标记，从而在最终测序结果中呈现每条读长的具体来源，为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种单分子标签，所述标签为一条oligo退火形成的茎环结构、两条oligo退火形成两端互补配对的结构或两条oligo退火形成一端互补配对的结构中的任意一种，其中，所述标签的3’端突出，5’端磷酸化，在未互补配对的环状结构上，有尿嘧啶修饰。优选地，所述标签的尿嘧啶修饰的个数为至少1个。优选地，所述标签的3’端突出为悬突胸腺嘧啶。在本发明中，发明人在深入研究dna测序技术的基础上，分析illumina测序的优缺点，发现由于pcr扩增和片段化的随机性，导致无法得知最终测序文库的所得读长的来源模板，因此，为实现对测序样本的单分子编码测序，发明人通过大量实验并结合创造性思路，研发了一种特异性标签，最终实现对每条dna片段进行标记，从而在最终的dna文库测序结果中呈现出每条读长的具体来源。本发明中，所述标签存在三种情况，当一条链退火形成茎环结构；第二种情况：当两条链发生两端互补配对时形成结构；第三种情况：当两条链发生一端互补配对形成结构，三种情况示意图如图1。第二方面，本发明提供一种标签引入方法，包括如下步骤：(1)将第一方面所述标签连接至dna样本上；(2)将步骤(1)得到的产物进行处理形成5’端突出的结构；(3)将步骤(2)得到的产物的dna末端去磷酸化，形成末端羟基的结构；(4)将步骤(3)得到的产物进行延伸反应形成两端为平末端且带标签的dna片段。在本发明中，若步骤(1)所述dna样本为gdna，所述方法还包括首先对dna样品进行片段化处理的步骤，若被处理样本为cfdna，可以直接用于后续实验过程。优选地，所述片段化的步骤如下：(1’)采用片段化酶将gdna进行片段化处理；(2’)对步骤(1’)的产物进行筛选。优选地，所述筛选的方法包括磁珠双筛或切胶。优选地，所述筛选的片段长度为100-250bp。优选地，步骤(1)所述dna样品在连接标签前需要进行末端修复和3’端加腺嘌呤的处理。优选地，步骤(2)所述处理采用的酶包括尿嘧啶-特异性切除酶，优选为user酶(nebm5505v/s/l)。优选地，步骤(3)所述去磷酸化的酶包括磷酸酶，优选为重组虾碱性磷酸酶(rsapnebm0371v/s/l)。优选地，所述方法还包括将步骤(4)得到的平末端且带标签的dna片段进行dna末端修复，3’末端加a的处理，为后续接头连接做准备。。第三方面，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的标签。第四方面，本发明还提供一种如第一方面所述标签和/或第三方面所述试剂盒用于构建基因测序文库、用于dna双端单分子编码标记或用于定位测序读长的有效来源，后续用于测序结果的分析解读。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明提供的标签构思巧妙，结构精简，功能显著，通过选择特定结构和修饰后的标签，实现对dna双端单分子编码标记，更为有效的定位测序读长的最初来源，解决了现有技术由于pcr扩增和片段化的随机性，无法确定所得读长最初是由哪个模板扩增而来的问题。(2)本发明提供的标签引入方法简洁高效，与特定标签相适配，便于操作，辅助发挥并实现了标签的标记功能，节省人力物力，具有推广应用的前景和价值。附图说明图1为本发明的标签的三种情况示意图；图2为本发明的随机标签(barcode)引入dna片段两端的示意图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例中，相关术语解释：(1)甲基化修饰引物：引物序列中，胞嘧啶(c)被甲基化处理为5-甲基胞嘧啶(5-mdc)。(2)barcode：随机标签。(3)纯化：如无特殊标注，实施例中的“纯化”指的是磁珠纯化。(4)退火：两条或一条全部或部分反向互补的dnaoligo在一定反应条件下，结合为双链dna。(5)p5/p7：illumina二代文库构建过程终文库扩增的通用引物。(6)加a：在dna片段3’末端加上一个腺嘌呤碱基(a)。实施例1(1)一种标签，所述标签的核苷酸序列如seqidno.1所示：seqidno.1即oligo：-catag/du/nnnnnnnnctatgt3’oligo的5’端磷酸化修饰(，且5’端五个碱基与3’端反向互补，退火后形成茎环结构，且3’端悬突胸腺嘧啶的标签barcode(即随机序列polydntp)，在形成的茎环结构中，靠近5’端的第一个不配对的碱基为尿嘧啶(u)。(2)样本处理：若被处理样本为gdna，利用neb公司的片段化酶将2μg样本gdna片段化处理，通过磁珠双筛或者切胶的方法选择100-250bp的dna片段，片段化酶处理条件：37℃，43min，将片段选择后的dna用30μl去离子水溶解；若被处理样本为cfdna，可以直接用于后续实验过程。(3)片段化dna末端修复，3’端加a：利用试剂盒nebnextultraiidnalibraryprepkitforillumina进行dna末端修复，3’端加a。(4)标签barcode连接：上述产物不需经过纯化，按表1所示体系进行反应，随机标签(barcode)引入dna片段两端的示意图如图2所示：表1组分体积μl上一步处理后的dna60barcode2.5ultra连接iimastermix30连接提高剂1共计93.5(5)在上述产物中加入3μl的user酶和3μl的重组虾碱性磷酸酶(rsap)，37℃反应30min，见表2；表2组分体积μl上一步处理后的dna39rsap2user酶4cutsmart5共计50(6)标签延伸：将上述产物纯化后按表3所示体系进行反应：表3组分体积μlbarcode连接的dna30dntp(mdctpinsteadofdctp)(10mm)15×epimark热启动taq反应缓冲液10epimark热启动taq(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件如表4所示：表4(7)对上述产物进行纯化，利用试剂盒nebnextultraiidnalibraryprepkitforillumina进行dna末端修复，3’端加a，接头连接，纯化。(8)终文库扩增：将上述纯化产物进行如表5所示反应：表5组分体积μl接头连接的dna30p72.5p52.5dntp(10mm)15×epimark热启动taq反应缓冲液10epimarkh热启动taq(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件如表6所示：表6(11)对上述产物进行纯化，-20℃保存。实施例2(1)一种标签，所述标签的核苷酸序列如seqidno.1所示：seqidno.1即oligo：-catag/du/nnnnnnnnctatgt3’oligo的5’端磷酸化修饰(，且5’端五个碱基与3’端反向互补，退火后形成茎环结构，且3’端悬突胸腺嘧啶的标签barcode，在形成的茎环结构中，靠近5’端的第一个不配对的碱基为尿嘧啶(u)。(2)样本处理：若被处理样本为gdna，利用neb公司的片段化酶将2μg样本gdna片段化处理，通过磁珠双筛或者切胶的方法选择100-250bp的dna片段，片段化酶处理条件：37℃，43min，将片段选择后的dna用30μl去离子水溶解；若被处理样本为cfdna，可以直接用于后续实验过程。(3)片段化dna末端修复，3’端加a：利用试剂盒nebnextultraiidnalibraryprepkitforillumina进行dna末端修复，3’端加a。(4)标签barcode连接：上述产物不需经过纯化，按表7所示体系进行反应：表7(5)在上述产物中加入3μl的user酶和3μl的重组虾碱性磷酸酶(rsap)，37℃反应30min，见表8；表8组分体积μl上一步处理后的dna39rsap2user酶4cutsmart5共计50(6)标签延伸：将上述产物纯化后按表9所示体系进行反应：表9pcr循环条件如表10所示：表10温度/℃时间9545s6130s685min4保持(8)对上述产物进行纯化，利用试剂盒nebnextultraiidnalibraryprepkitforillumina进行dna末端修复，3’端加a，甲基化接头连接。(9)对上述产物进行纯化，纯化后按照zymoezdnamethylationgoldkit进行重亚硫酸盐处理、柱子纯化。(10)终文库扩增加index：将上述纯化产物进行如表11所示反应：表11组分体系μl修改后dna30nebnext通用pcr引物2.5nebnext索引(x)引物2.5dntp(10mm)15×epimark热启动taq反应缓冲液10epimark热启动taq(2units/μl)0.25ddh2o加至50pcr循环条件如表12所示：表12(10)对上述产物进行纯化，-20℃保存。综上所述，本发明提供一种标签及其应用，通过选择特定结构和修饰后的标签，实现对dna双端单分子编码标记，更为有效的定位测序读长的最初来源，解决了现有技术由于pcr扩增和片段化的随机性，无法确定所得读长最初是由哪个模板扩增而来的问题；提供的标签引入方法简洁高效，与特定标签相适配，便于操作，辅助发挥并实现了标签的标记功能，节省人力物力，具有推广应用的前景和价值。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>深圳海普洛斯医学检验实验室<120>一种对dna片段进行标记的单分子标签<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(7)..(14)<223>nisa,c,g,ort<400>1catagdunnnnnnnnctatgt21当前第1页12