癌症治疗靶点及其用途的制作方法

1.本发明属于癌症治疗领域，涉及癌症治疗靶点及其用途，具体涉及一种治疗b细胞急性淋巴细胞白血病演变与化疗耐药的新方法。


背景技术：

2.b细胞急性淋巴细胞白血病(b
‑
all)是一种严重的恶性造血系统疾病，可引起造血干/祖细胞的克隆性扩增，常见于儿童/青少年。有几种治疗方案在治疗b
‑
all中取得效果，包括化疗、骨髓移植、car
‑
t疗法。然而，在car
‑
t治疗的情况下，目前策略的有效性受到耐药性、缺乏mhc匹配供体hsc来源、患者无反应性或诱导毒性的阻碍。尽管化疗被认为是治疗b
‑
all最有效的方法之一，但20％的患者在使用阿糖胞苷(ara
‑
c)、蒽环类抗生素或其他化疗药物治疗后复发。越来越多的证据表明，一小部分白血病细胞，称为白血病起始细胞(lics)，可能导致耐药性或白血病复发。例如，免疫表型cd34 cd19 lics可能与人类b
‑
all的白血病进展和耐药性密切相关。然而，导致化疗耐药性的机制仍不清楚。
3.近年来发现，代谢在许多不同类型癌症的发生发展中起着关键作用，包括血液肿瘤和实体癌。例如，异柠檬酸脱氢酶1/2(idh1/2)的突变可有效引发多种癌症，如急性髓细胞白血病、胶质母细胞瘤和结肠癌。急性/慢性髓系白血病主要利用糖酵解作为能量来源；果糖代谢增强ph
‑
b
‑
all细胞的增殖；禁食可有效诱导疾病早期和晚期的b
‑
all分化。然而，b
‑
all中细胞代谢是否与耐药性形成尚不清楚。
4.目前，b
‑
all细胞的耐药性被认为是由许多内源性因子(如转录因子或表观遗传修饰)和外源性因子(如组织微环境)的改变引起的。例如，转录因子ikzf1的突变导致b
‑
all细胞对酪氨酸抑制剂治疗的敏感性显著降低；twist2的下调也导致对化疗药物足叶乙甙、柔红霉素和地塞米松的耐药性。此外，骨髓(bm)微环境已被发现在白血病的发展和化疗抵抗中起关键作用。重塑的白血病微环境可能包含不同类型的细胞(如内皮细胞、成骨细胞和间充质干细胞)及其分泌的蛋白质/细胞因子/生长因子(如sdf1、il3、il6和透明质酸)，它们可能不同于那些在生理条件下分泌的蛋白，以增强白血病细胞的扩张或化疗抵抗。尽管最近的大多数研究都集中在急性髓细胞白血病(aml)发展和耐药性过程中的微环境成分上，但一些证据表明，微环境因子也支持b
‑
all的启动和耐药性。例如，nestin 细胞分泌的gdf15在ara
‑
c治疗后重塑bm微环境并导致化疗抵抗。然而，哪些特异的细胞代谢途径导致b
‑
all细胞的耐药性有待进一步研究。
5.本领域仍需找到ara
‑
c耐药性的机制和治疗靶点，以及高效筛选治疗靶点药物的方法。


技术实现要素：

6.本发明第一方面提供线粒体代谢抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途。
7.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)增强的癌症。
8.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中pdhx和/或creb的表达或活性增加的癌症。
9.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
10.在一个或多个实施方案中，所述癌症是b细胞急性淋巴细胞白血病，优选为其中pdhx和/或creb的表达或活性增加的b细胞急性淋巴细胞白血病。
11.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂。
12.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂包括下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。
13.在一个或多个实施方案中，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：
14.与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或
15.特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子。
16.在一个或多个实施方案中，所述与pdhx和/或creb特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
17.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标。pdhx基因或其转录本的序列如gene id：8050或27402所示；creb基因或其转录本的序列如gene id：1385或12912所示。
18.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以pdhx和/或creb基因转录本的3'utr或cds区为抑制靶标。
19.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标的shrna或构建物。
20.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除pdhx和/或creb的试剂，例如sgrna。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含cas酶(例如cas9)、其编码序列、和/或表达所述cas酶的核酸构建物。
21.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂还可选自维奈托克(venetoclax)、二甲双胍(metformin)、小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。
22.本发明第一方面中还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括：下调癌细胞的线粒体代谢强度。
23.在一个或多个实施方案中，所述方法包括向需要的患者给予减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂。
24.在一个或多个实施方案中，所述方法包括向需要的患者给予下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。
25.在一个或多个实施方案中，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂是：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子。
26.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂选自维奈托克(venetoclax)、二甲双胍(metformin)和小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。
27.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中pdhx和/或creb的表达或活性增加的癌症。
28.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
29.在一个或多个实施方案中，所述癌症是b细胞急性淋巴细胞白血病，优选为其中pdhx和/或creb的表达或活性增加的b细胞急性淋巴细胞白血病。
30.在一个或多个实施方案中，所述方法的其他特征如本文第一方面中任一实施方案所述。
31.本发明第一方面中还提供降低pdhx和/或creb的表达或活性的物质，所述物质含有式i所示的结构：
32.seq
正向
‑
x
‑
seq
反向
式i，
33.式i中，seq
正向
为识别pdhx和/或creb编码序列的多核苷酸，seq
反向
为与seq
正向
反向互补的多核苷酸；
34.x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq
正向
和seq
反向
不互补。
35.在一个或多个实施方案中，seq
正向
长度为5
‑
20bp，优选8
‑
15bp。
36.在一个或多个实施方案中，seq
正向
包含seq id no:1
‑
9中任一所示序列。
37.在一个或多个实施方案中，x包含seq id no:16。
38.本发明第一方面中还提供药物组合物，包含本文第一方面中任一实施方案所述的线粒体代谢抑制剂和药学上可接受的辅料。
39.在一个或多个实施方案中，所述线粒体代谢抑制剂是本文任一实施方案中所述的降低pdhx和/或creb的表达或活性的物质。
40.本发明第二方面提供检测线粒体代谢强度的试剂在制备癌症诊断试剂盒或癌症细胞代谢和功能亚群鉴定试剂盒中的用途。
41.在一个或多个实施方案中，检测线粒体代谢的试剂包括检测三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度的试剂。
42.在一个或多个实施方案中，检测线粒体代谢的试剂包括检测pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。包括：(1)靶向pdhx和/或creb或其转录本的引物或探针，或(2)特异性结合pdhx和/或creb的抗体或配体。
43.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含rt
‑
pcr所需试剂，例如反转录酶、rna提取试剂、核酸聚合酶，dntp，pcr缓冲液等。
44.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含northern所需试剂，例如rna提取试剂、核糖核酸酶抑制剂、northern缓冲液等。
45.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含western所需试剂，例如蛋白提取试剂、丙烯酰胺、异硫氰酸胍、tris、sds、temed等。
46.在一个或多个实施方案中，pdhx基因或其转录本的序列如gene id：8050或27402
所示。
47.在一个或多个实施方案中，pdhx蛋白的序列如蛋白id：np_003468或aah61231所示。
48.在一个或多个实施方案中，creb基因或其转录本的序列如gene id：1385或12912所示。
49.在一个或多个实施方案中，creb蛋白的序列如蛋白id：aaq24858.1或aab64015.1所示。
50.本发明第三方面提供阿糖胞苷与线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂在制备治疗癌症的药物中的用途。
51.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)增强的癌症。
52.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的癌症。
53.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中cda的表达或活性增加的癌症。
54.在一个或多个实施方案中，所述癌症是对阿糖胞苷有耐药性的癌症。
55.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
56.在一个或多个实施方案中，所述癌症是b细胞急性淋巴细胞白血病，优选为其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的b细胞急性淋巴细胞白血病。
57.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂。
58.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂包括下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。
59.在一个或多个实施方案中，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子。
60.在一个或多个实施方案中，所述与pdhx和/或creb特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
61.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标。pdhx基因或其转录本的序列如gene id：8050或27402所示；creb基因或其转录本的序列如gene id：1385或12912所示。
62.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子以pdhx和/或creb基因转录本的3'utr或cds区为抑制靶标。
63.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标的shrna或构建物。
64.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除pdhx和/或creb的试剂，例如
sgrna。
65.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂选自维奈托克(venetoclax)、二甲双胍(metformin)和小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。
66.在一个或多个实施方案中，下调cda的表达或活性的试剂包括：与cda特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子。
67.在一个或多个实施方案中，所述与cda特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
68.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子以cda基因或其转录本作为抑制靶标。cda基因或其转录本的序列如gene id：978或72269所示。
69.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子以cda基因转录本的3'utr或cds区为抑制靶标。
70.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以cda基因或其转录本作为抑制靶标的shrna或构建物。
71.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除cda的试剂，例如sgrna。
72.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子(包括特异性干扰pdhx、creb、或cda基因转录和/或表达的抑制分子)是shrna或其核酸构建物，所述构建物含有式i所示的结构：
73.seq
正向
‑
x
‑
seq
反向
ꢀꢀꢀꢀꢀ
式i，
74.式i中，seq
正向
为识别pdhx、creb、或cda基因或其转录本的多核苷酸，seq
反向
为与seq
正向
反向互补的多核苷酸；
75.x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq
正向
和seq
反向
不互补。
76.在一个或多个实施方案中，seq
正向
长度为5
‑
20bp，优选8
‑
15bp。
77.在一个或多个实施方案中，seq
正向
包含seq id no:1
‑
15中任一所示序列。
78.在一个或多个实施方案中，x包含seq id no:16。
79.本发明第三方面中还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向需要的患者给予阿糖胞苷、和线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂。
80.在一个或多个实施方案中，所述线粒体代谢抑制剂是减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂。
81.在一个或多个实施方案中，所述线粒体代谢抑制剂是下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。
82.在一个或多个实施方案中，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂是：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子。
83.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂选自维奈托克(venetoclax)、二甲
双胍(metformin)和小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。
84.在一个或多个实施方案中，下调cda的表达或活性的试剂包括：与cda特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子。
85.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)增强的癌症。
86.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的癌症。
87.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中cda的表达或活性增加的癌症。
88.在一个或多个实施方案中，所述癌症是对阿糖胞苷有耐药性的癌症。
89.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
90.在一个或多个实施方案中，所述癌症是b细胞急性淋巴细胞白血病，优选为其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的b细胞急性淋巴细胞白血病。
91.在一个或多个实施方案中，所述方法的其他特征如本文第三方面中任一实施方案所述。
92.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子(包括特异性干扰pdhx、creb、或cda基因转录和/或表达的抑制分子)是shrna或其核酸构建物，所述构建物含有式i所示的结构：
93.seq
正向
‑
x
‑
seq
反向
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式i，
94.式i中，seq
正向
为识别pdhx、creb、或cda基因或其转录本的多核苷酸，seq
反向
为与seq
正向
反向互补的多核苷酸；
95.x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq
正向
和seq
反向
不互补。
96.在一个或多个实施方案中，seq
正向
长度为5
‑
20bp，优选8
‑
15bp。
97.在一个或多个实施方案中，seq
正向
包含seq id no:1
‑
15中任一所示序列。
98.在一个或多个实施方案中，x包含seq id no:16。
99.本发明第三方面中还提供降低cda的表达或活性的物质，所述物质含有式i所示的结构：
100.seq正向
‑
x
‑
seq反向
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式i，
101.式i中，seq正向为识别cda编码序列的多核苷酸，seq反向为与seq正向反向互补的多核苷酸；
102.x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补。
103.在一个或多个实施方案中，seq正向长度为5
‑
20bp，优选8
‑
15bp。
104.在一个或多个实施方案中，seq正向包含seq id no:10
‑
15中任一所示序列。
105.在一个或多个实施方案中，x包含seq id no:16。
106.本发明第三方面中还提供一种药物组合物，包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料。
107.在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。所述癌症是其中三羧
酸循环(tca)或电子传递链(etc)增强的癌症。
108.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的癌症。
109.在一个或多个实施方案中，所述癌症是其中cda的表达或活性增加的癌症。
110.在一个或多个实施方案中，所述癌症是对阿糖胞苷有耐药性的癌症。
111.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
112.在一个或多个实施方案中，所述癌症是b细胞急性淋巴细胞白血病，优选为其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的b细胞急性淋巴细胞白血病。
113.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂。
114.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂包括下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。
115.在一个或多个实施方案中，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子。
116.在一个或多个实施方案中，所述与pdhx和/或creb特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
117.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标。pdhx基因或其转录本的序列如gene id：8050或27402所示；creb基因或其转录本的序列如gene id：1385或12912所示。
118.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子以pdhx和/或creb基因转录本的3'utr或cds区为抑制靶标。
119.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。
120.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除pdhx和/或creb的试剂，例如sgrna。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含cas酶(例如cas9)、其编码序列、和/或表达所述cas酶的核酸构建物。
121.在一个或多个实施方案中，线粒体代谢抑制剂维奈托克(venetoclax)、二甲双胍(metformin)和小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。
122.在一个或多个实施方案中，下调cda的表达或活性的试剂包括：与cda特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子。
123.在一个或多个实施方案中，所述与cda特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
124.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子以cda基因或其转录本作为抑制靶标。cda基因或其转录本的序列如gene id：978或72269所
示。
125.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子以cda基因转录本的3'utr或cds区为抑制靶标。
126.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以cda基因或其转录本作为抑制靶标的shrna或构建物。
127.在一个或多个实施方案中，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除cda的试剂，例如sgrna。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含cas酶(例如cas9)、其编码序列、和/或表达所述cas酶的核酸构建物。
128.在一个或多个实施方案中，所述抑制分子(包括特异性干扰pdhx、creb、或cda基因转录和/或表达的抑制分子)是shrna或其核酸构建物，所述构建物含有式i所示的结构：
129.seq
正向
‑
x
‑
seq
反向
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式i，
130.式i中，seq
正向
为识别pdhx、creb、或cda基因或其转录本的多核苷酸，seq
反向
为与seq
正向
反向互补的多核苷酸；
131.x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq
正向
和seq
反向
不互补。
132.在一个或多个实施方案中，seq
正向
长度为5
‑
20bp，优选8
‑
15bp。
133.在一个或多个实施方案中，seq
正向
包含seq id no:1
‑
15中任一所示序列。
134.在一个或多个实施方案中，x包含seq id no:16。
135.本发明第四方面提供seq id no:23
‑
28中任一条所示的探针在制备区分癌症细胞代谢和功能亚群的试剂盒中的用途。
136.在一个或多个实施方案中，所述探针用于引入癌细胞或在其中表达，并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率。
137.在一个或多个实施方案中，受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
138.在一个或多个实施方案中，受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
139.在一个或多个实施方案中，所述探针优选如seq id no:27所示。
140.在一个或多个实施方案中，荧光强度的比率越小，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢越强、成瘤能力越强、患者生存期越短。
141.在一个或多个实施方案中，荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢强、成瘤能力强、患者生存期短；荧光强度的比率大于或等于约1.0(例如大于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢弱、成瘤能力弱、患者生存期长。
142.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓
细胞白血病、混合细胞白血病，优选b细胞急性淋巴细胞白血病。
143.本发明第四方面中还提供一种区分癌症细胞代谢和功能亚群的方法，包括在癌细胞中引入或表达seq id no:23
‑
28中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率。
144.在一个或多个实施方案中，受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
145.在一个或多个实施方案中，受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
146.在一个或多个实施方案中，所述探针优选如seq id no:27所示。
147.在一个或多个实施方案中，荧光强度的比率越小，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢越强、成瘤能力越强、患者生存期越短。
148.在一个或多个实施方案中，荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢强、成瘤能力强、患者生存期短；荧光强度的比率大于或等于约1.0(例如大于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢弱、成瘤能力弱、患者生存期长。
149.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病，优选b细胞急性淋巴细胞白血病。
150.本发明第四方面中还提供一种选择治疗方案的方法，包括：
151.(1)在癌细胞中引入或表达seq id no:23
‑
28中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率，
152.(2)荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，选择本文所述的包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料的药物组合物。
153.在一个或多个实施方案中，受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
154.在一个或多个实施方案中，受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
155.在一个或多个实施方案中，所述探针优选如seq id no:27所示。
156.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病，优选b细胞急性淋巴细胞白血病。
157.在一个或多个实施方案中，所述药物组合物如本文第三方面中任一实施方案所述。
158.本发明第四方面中还提供一种选择治疗方案的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：
159.(1)在癌细胞中引入或表达seq id no:23
‑
28中任一条所示的探针并检测探针的
荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率，
160.(2)荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，选择本文所述的药物组合物，包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料。
161.在一个或多个实施方案中，所述探针优选如seq id no:27所示。
162.在一个或多个实施方案中，受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
163.在一个或多个实施方案中，受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光是受405nm
‑
420nm激发于528nm处产生的荧光。
164.在一个或多个实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病，优选b细胞急性淋巴细胞白血病。
165.在一个或多个实施方案中，所述药物组合物如本文第三方面中任一实施方案所述。
附图说明
166.图1：sonar探针区分急性b淋巴细胞白血病细胞代谢和功能亚群。(a)204个小鼠sonar b
‑
all细胞的sonar比率(f405/f488 nm)的统计。(b)通过流式细胞分析技术对sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的sonar比率进行评估。(c)用生物发光法测定sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的atp水平。(d)sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的平均荧光强度(mfi)的量化。(e)sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的ocrs。(f)sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞在ocr(ocr
bas
、ocr
atp
和max resp)中的基础呼吸、atp周转、最大呼吸。(g)在sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞中检测线粒体dna(mtdna)拷贝数目。(h)sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的胞外酸化率(ecar)。(i)sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞在ecar中的糖酵解和糖酵解能力。(j)sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的胞外乳酸水平。(k)在体外用
13
c标记葡萄糖后，测定sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞的糖酵解和三羧酸循环产生的中间代谢产物。(l)使用
13
c标记的葡萄糖对sonar
‑
b
‑
all细胞进行体内标记，然后在sonar
‑
高和sonar
‑
低的白血病细胞中测定糖酵解和三羧酸循环产生的中间代谢物。(m)测定移植sonar
‑
高、sonar
‑
中、sonar
‑
低的受体小鼠的总存活率。(n)采用l
‑
calc软件极限稀释法测定原代b
‑
all细胞的功能性lic频率。(o
‑
q)移植人原代sonar
‑
高/sonar
‑
低的b
‑
all细胞的非肥胖糖尿病
‑
严重联合免疫缺陷(nod
‑
scid)小鼠(aml#1到aml#3)的总存活率。数据用平均值
±
sem表示。采用双尾未配对t检验进行统计学意义比较，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
167.图2：sonar
‑
低细胞亚群中pdhx等基因表达上调促进线粒体代谢。(a)通过微阵列数据，kegg分析了sonar
‑
低的b
‑
all细胞上调的通路，其中氧化磷酸化的候选途径用方框标出。(b)定量rt
‑
pcr分析糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸氧化和谷氨酰胺分解相关基因在sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞中的表达水平。(c)pdhx混合和pdhx敲除(shpdhx#2)b
‑
all细胞中的相对mrna表达。(d)在l1210细胞(小鼠b
‑
all细胞系)中，检测shnras基因敲除pdhx后(shpdhx#1
‑
#3)的pdhx的相对mrna表达水平。(e)使用免疫印迹法检测(c)中混合的
(#1
‑
#3)和pdhx敲低的小鼠原代b
‑
all细胞(#1
‑
#3)的pdhx蛋白水平，对pdhx/actin的比例进行定量，并与混合的#1进行归一化处理。(f
‑
g)使用seahorse xf96分析仪测定混合和pdhx敲除b
‑
all细胞的氧消耗速率水平(ocr，f)和细胞外酸化速率水平(ecar,g)。(h)接受混合或pdhx
‑
敲除(shpdhx#2)的b
‑
all细胞的受体小鼠的总存活率。(i)测定移植了混合和pdhx
‑
敲除的nalm6细胞的受体小鼠的总存活率。数据用平均值
±
sem表示。采用双尾未配对t检验进行统计学意义比较，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
168.图3：sonar
‑
低细胞亚群中cda基因介导了对急性b淋巴细胞白血病的治疗药物阿糖胞苷ara
‑
c的耐药性。(a)计数50个b
‑
all细胞的sonar比率。(b)在指定的时间点用ara
‑
c处理后，用小鼠sonar
‑
高和sonar
‑
低的b
‑
all细胞评估细胞数量。(c)定量rt
‑
pcr分析候选基因中ara
‑
c转运(slc29a1)和分解代谢(cda，dck，dctd和cmpk1)在sonar高和低的b
‑
all细胞中的表达水平。(d)在移植有/无ara
‑
c的加扰和cda抑制的tib205细胞的受体小鼠中确定总体存活率。(e)通过定量rt
‑
pcr确定扰乱的和cda敲低的tib205细胞中cda的相对表达水平。(f)通过定量rt
‑
pcr测量shrna(shpdhx#1
‑
#3)在tib205细胞中cda的敲低效率。(g)通过免疫印迹法测定了shrna(shcda#1
‑
#3)对nalm6细胞中cda的敲低效率。数据用平均值
±
sem表示。采用双尾未配对t检验进行统计学意义比较，**p<0.01；***p<0.001。
169.图4：creb磷酸化增强sonar
‑
低细胞亚群中pdhx的转录。(a)通过蛋白质印迹法测量sonar高和低b
‑
all细胞中的creb和p
‑
creb水平。(b)通过蛋白质印迹法测量了(d)中被扰乱的(#1
‑
#3)和creb敲低的b
‑
all细胞(#1
‑
#3)的creb蛋白水平。(c)移植后3周，通过流式细胞术分析确定了小鼠外周血中含mcherry gfp 的和creb
‑
knockdown的b
‑
all细胞的百分比。(d)在移植了加扰的cda基因敲低的b
‑
all细胞的受体小鼠的存活率。数据用平均值
±
sem表示。采用双尾未配对t检验进行统计学意义比较，***p<0.001。
170.图5：线粒体代谢抑制药物或creb抑制剂与阿糖胞苷ara
‑
c联合用药增强急性b淋巴细胞性白血病的治疗效果。(a
‑
b)在使用ara
‑
c、creb抑制剂(666
‑
15)和ara
‑
c与creb抑制剂进行治疗后，对nalm6细胞(a)和ara
‑
c耐药nalm6细胞(b)的增殖率进行评估。(c)用氧化磷酸化抑制药物venetoclax处理后，评估抗ara
‑
c的nalm6细胞的增殖速率。(d)pbs，ara
‑
c，venetoclax和venetoclax联合ara
‑
c处理后白血病小鼠外周血b
‑
all细胞生存比率的定量数据(移植后3周)。(e
‑
f)用线粒体代谢靶向药物(metformin和berberine)处理后，评估抗ara
‑
c的nalm6细胞的增殖速率。(g)分别用pbs,ara
‑
c,metformin,berberine,metformin ara
‑
c和berberine ara
‑
c处理后的白血病小鼠外周血b
‑
all细胞生存比率的定量数据(移植后3周)。(h)pbs，ara
‑
c，venetoclax和venetoclax联合ara
‑
c处理后白血病小鼠外周血b
‑
all细胞生存比率的定量数据(移植后3周)。(i)分别用pbs，ara
‑
c，metformin，berberine，metformin ara
‑
c和berberine ara
‑
c处理后的白血病小鼠外周血b
‑
all细胞生存比率的定量数据(移植后3周)。在(g)中确定了移植有b
‑
all细胞的受体小鼠的总体存活率(每组n＝5只小鼠，对数秩检验)。
具体实施方式
171.发明人通过sonar荧光探针特异监测细胞内nadh/nad 水平，发现b细胞急性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞具有不同的线粒体代谢活性，在线粒体代谢活性较强的细胞中，丙酮酸脱氢酶复合物成员基因pdhx基因显著上调。同时，发明人首次发现，阿糖胞苷(cas#
147
‑
94
‑
4)的耐药性与肿瘤细胞的线粒体代谢活性相关，线粒体代谢活性越强，对阿糖胞苷的耐药性越强。通过敲低cda基因的表达，发明人证实在线粒体代谢活性较强的细胞中cda基因介导了对阿糖胞苷的耐药性。免疫印迹实验和表达敲低实验表明，转录增强因子creb磷酸化增强pdhx和cda基因的转录。由此，发明人筛选了线粒体代谢抑制剂，发现线粒体代谢抑制剂可以显著降低肿瘤细胞对阿糖胞苷的耐药性。
172.本文所述“sonar荧光探针”是专利cn104403003a中所述的融合荧光探针，该专利申请通过引用全文纳入本文。该探针是一种固有的比率传感器，具有两个激发波长(405
‑
420nm和485
‑
488nm，取决于不同仪器，波长会有些许差异)，它对nadh和nad 的响应与荧光比率相反。特别地，本文所述seq id no:23
‑
28对应于该专利中的seq id no:144
‑
149。
173.基因及其抑制剂
174.如本文所用，pdhx基因或其转录本的序列如gene id(entrez id)：8050或27402所示，pdhx蛋白的序列如蛋白id(genbank id)：np_003468或aah61231.1所示；creb基因或其转录本的序列如gene id(entrez id)：1385或12912所示，creb蛋白的序列如蛋白id(genbank id)aaq24858.1或aab64015.1所示；cda基因或其转录本的序列如gene id(entrez id)：978或72269所示，cda蛋白的序列如蛋白id(genbank id)：np_001776.1或np_082452.1所示。
175.在本发明中，术语“pdhx”、“creb”和“cda”还包括具有与各所示蛋白相同功能的、各所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1
‑
50个，优选地1
‑
30个、1
‑
20个、1
‑
10个、1
‑
8个、1
‑
5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，优选地为10个以内，更优选地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乳酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β
‑
分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。
176.多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。任何与所述pdhx、creb或cda同源性高(比如与所示序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有相似或相同功能的多肽也包括在本发明内。本发明的多肽片段、衍生物或类似物还可以是：(i)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(ii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
177.本发明还涉及pdhx、creb或cda的抑制剂及其用途。任何可降低pdhx、creb或cda的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、降低其与关联蛋白之间的相互作用、或降低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为pdhx、creb或cda的下调剂、拮抗剂或抑制剂。示例性的抑制剂包括与pdhx、creb或cda特异性结合的抗体或配体；特异性干扰pdhx、creb或cda基因转录和/或表达的抑制分子(如可形成shrna的干扰分子)；或抑制pdhx、creb或cda活性的小分子化合物。
178.本领域已知的任何特异性结合pdhx、creb或cda的抗体或配体均可以用于本发明。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用fbxw2蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠，骆驼等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达fbxw2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术或者单细胞筛选来制备。此外，在知晓了抗体的序列后，可以将抗体的编码序列装载入表达载体中，从而将抗体基因与启动子、终止子等可操作地连接，并在宿主细胞中表达，从而生产抗体。表达载体所需的其他组件，例如启动子、终止子、表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
179.在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。作为本发明的一种优选方式，所述的pdhx、creb或cda的抑制剂是一种pdhx、creb或cda特异性的shrna或其构建物，其中shrna特异识别pdhx、creb或cda基因或其转录本。本文中，“转录本”包含utr区域(例如3’utr)和cds区。示例性的针对pdhx的shrna具有如下结构：(seq id no:1
‑
6中任一)
‑
(seq id no:16)
‑
(seq id no:1
‑
6中任一的反向互补)；示例性的针对creb的shrna具有如下结构：(seq id no:7
‑
9中任一)
‑
(seq id no:16)
‑
(seq id no:7
‑
9中任一的反向互补)；示例性的针对cda的shrna具有如下结构：(seq id no:10
‑
15中任一)
‑
(seq id no:16)
‑
(seq id no:10
‑
15中任一的反向互补)。
180.此外，为了下调pdhx、creb或cda基因表达或活性，可在细胞中转入基因敲除载体，和/或采用基因编辑技术如zfn、talen或crispr/cas9等编辑该基因。适用于本发明的zfn、talen和crispr/cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过dna识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除。
181.pdhx、creb或cda的下调剂或抑制剂还可以是抑制pdhx、creb或cda活性的小分子化合物，例如creb抑制剂666
‑
15(cas#1433286
‑
70
‑
4)。
182.线粒体代谢抑制剂
183.线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂，例如维奈托克(venetoclax，cas#1257044
‑
40
‑
8)、二甲双胍(metformin，cas#657
‑
24
‑
9)、小檗碱(berberine，cas#633
‑
65
‑
8)或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。
184.在本发明中，“化合物”(包括阿糖胞苷、维奈托克、二甲双胍、小檗碱、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药)可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如95％，98％，99％)的化合物。
185.本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知
的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如微生物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。此外，化合物还可以是商品化的药物，因此其成品是本领域技术人员易于获得的。
186.在本发明中，还包括化合物的药学上可接受的盐，其也保留有各化合物的化学活性。本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。所述的“药学上可接受的盐”可以是所指化合物的酸式盐和碱式盐。
[0187]“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4
‑
乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2
‑
乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fumaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2
‑
氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘
‑
1,5
‑
二磺酸、2
‑
萘磺酸、1
‑
萘酚
‑2‑
甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4
‑
氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。
[0188]“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2
‑
二甲氨基乙醇、2
‑
二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、n,n'
‑
双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、n
‑
乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
[0189]
通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶剂化物”是指一种包含了一种或多种本专利公开的化合物分子与一种或多种溶剂分子的聚合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂还可能是有机溶剂。因此，本专利公开的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明公开的化合物也可以是仅保有一部分水，或者是保有水与一些溶剂的混合物。
[0190]
在本发明中，还包括化合物(包括阿糖胞苷、维奈托克、二甲双胍、小檗碱、creb抑制剂666
‑
15)的前药，所述的“前药”指当用适当的方法服用后，该化合物的前药在病人体内进行代谢或化学反应而转变成该化合物的一种化合物。
[0191]
本文所述化合物(阿糖胞苷、维奈托克、二甲双胍、小檗碱、creb抑制剂666
‑
15)还
包括本领域已知的具有该化合物至少50％(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％)效力的类似物。确定化合物和类似物效力的方法本领域周知，例如基于溶液体系、亚细胞体系、细胞体系或体内体系的实验。
[0192]
线粒体代谢抑制剂还包括抑制相关基因表达或活性的抗体、核酸和小分子化合物。因此，线粒体代谢抑制剂包括上诉任意下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂。
[0193]
药物组合物
[0194]
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001
‑
50wt％；较佳的0.00001
‑
20wt％；更佳的，0.0001
‑
10wt％)的阿糖胞苷和所述线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂(cda抑制剂)，以及药学上可接受的辅料。所述组合物可用于防治癌症。任何前述的线粒体代谢抑制剂均可用于组合物的制备。
[0195]
本文所述癌症包括任何其中三羧酸循环或电子传递链增强的癌症，例如其中pdhx和/或creb的表达或活性增加的癌症。在优选实施方案中，所述癌症是白血病，包括但不限于淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病，例如b细胞急性淋巴细胞白血病。在一个或多个实施方案中，所述癌症是对阿糖胞苷有耐药性的癌症。
[0196]
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
[0197]
在得知了阿糖胞苷和所述抑制剂(线粒体代谢抑制剂和/或cda抑制剂)的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将阿糖胞苷和所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
[0198]
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将线粒体代谢抑制剂和/或cda抑制剂与阿糖胞苷通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带线粒体代谢抑制剂和/或cda抑制剂与阿糖胞苷的表达单位(比如抗体表达载体或病毒等，或shrna构建物)递送到靶点(例如肿瘤细胞)上，并使之表达活性的抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。阿糖胞苷和抑制剂的给予可以同时或顺序给予，例如间隔至少1小时、至少半天、至少3天、至少1周。
[0199]
本发明所述的阿糖胞苷和抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的阿糖胞苷和抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的阿糖胞苷或抑制剂每天各以约0.00001mg
‑
50mg/kg动物体重(例如0.0001mg
‑
10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0200]
药物筛选
[0201]
在得知了线粒体代谢和cda与阿糖胞苷的密切相关性后，可以基于该特征来筛选
抑制能降低阿糖胞苷耐药性的物质。可从所述的物质中找到对于与阿糖胞苷联用以预防或治疗癌症(对阿糖胞苷有耐药性的癌症)的药物。
[0202]
因此，本发明提供一种筛选预防或治疗对阿糖胞苷有耐药性的癌症的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理检测线粒体代谢的体系；和检测所述体系中线粒体代谢的强弱。若所述候选物质抑制高线粒体代谢，则表明该候选物质是降低阿糖胞苷耐药性的潜在物质。例如，所述检测线粒体代谢的体系可以是表达sonar探针的体系，例如细胞或细胞培养物。所述的细胞可以是内源性表达sonar探针的细胞；或可以是重组表达sonar探针的细胞。所述的表达sonar的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。表达sonar探针的体系的检测方法如专利cn104403003a中所述(该专利通过引用全文纳入本文)，例如检测探针受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率。
[0203]
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达sonar探针的体系。
[0204]
诊断和试剂盒
[0205]
基于线粒体代谢相关基因(例如pdhx和/或creb)的表达或活性与癌症、癌症细胞代谢的关系，本发明还提供一种诊断癌症或鉴定癌症细胞代谢和功能亚群的方法，所述方法包括检测对象中线粒体代谢相关基因(例如pdhx和/或creb)的表达。所述方法包括：(1)获取对象的样品，(2)检测对象样品中三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度，和(3)将对象的三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度与健康对照比较，若对象的三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度提高，则诊断对象具有癌症，尤其是其中三羧酸循环或电子传递链增强的癌症。检测三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度的试剂本领域周知。例如检测三羧酸循环或电子传递链相关酶基因的表达或活性。
[0206]
具体地，所述方法包括：(1)获取对象的样品，(2)检测对象样品中线粒体代谢相关基因表达或活性，和(3)将对象的线粒体代谢相关基因表达或活性与健康对照的线粒体代谢相关基因表达或活性比较，若对象的线粒体代谢相关基因表达或活性提高，则诊断对象具有癌症，尤其是其中三羧酸循环或电子传递链增强的癌症。
[0207]
通常，检测线粒体代谢相关基因(例如pdhx和/或creb)表达或活性所使用的试剂包括：(1)靶向所述基因或其转录本的引物或探针，或(2)特异性结合所述基因的抗体或配体。引物、探针、抗体和配体如本文他处所述。
[0208]
本发明提供用于进行上述诊断或鉴定的试剂盒，包含检测代谢相关基因(例如pdhx和/或creb)表达或活性的试剂。此外，所述试剂盒还可包含rt
‑
pcr所需试剂，例如反转录酶、rna提取试剂、核酸聚合酶，dntp，pcr缓冲液等；或者，所述试剂盒还可包含northern所需试剂，例如rna提取试剂、核糖核酸酶抑制剂、northern缓冲液等；或者，所述试剂盒还包含western所需试剂，例如蛋白提取试剂、丙烯酰胺、异硫氰酸胍、tris、sds、temed等。
[0209]
此外，本发明还揭示了存储计算机程序的计算机可读存储介质，存储介质上所存储的计算机程序运行后执行本文所述的鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的方法。结合本文中公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可直接在硬件中、在由处理器执行的软件模块中、或在这两者的组合中体现。如果在软件中实现为
计算机程序产品，则各功能可以作为一条或更多条指令或代码存储在计算机可读介质上或藉其进行传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，其包括促成计算机程序从一地向另一地转移的任何介质。存储介质可以是能被计算机访问的任何可用介质。作为示例而非限定，这样的计算机可读介质可包括ram、rom、eeprom、cd
‑
rom或其它光盘存储、磁盘存储或其它磁存储设备、或能被用来携带或存储指令或数据结构形式的合意程序代码且能被计算机访问的任何其它介质。示例性存储介质耦合到处理器以使得该处理器能从/向该存储介质读取和写入信息。在替换方案中，存储介质可以被整合到处理器。处理器和存储介质可驻留在asic中。asic可驻留在用户终端中。在替换方案中，处理器和存储介质可作为分立组件驻留在用户终端中。
[0210]
癌症细胞代谢鉴定方法
[0211]
本发明开发了用sonar探针鉴定癌症细胞代谢和功能亚群的方法。包括在癌细胞中引入或表达seq id no:23
‑
28(例如seq id no:27)中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率。荧光强度的比率越小，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢越强、成瘤能力越强、患者生存期越短。例如，荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢强、成瘤能力强、患者生存期短；荧光强度的比率大于或等于约1.0(例如大于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢弱、成瘤能力弱、患者生存期长。
[0212]
选择治疗方案的方法及其装置
[0213]
本发明还提供一种选择治疗方案的方法，包括：(1)在癌细胞中引入或表达seq id no:23
‑
28中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率，(2)根据荧光强度或荧光强度比率确定治疗方案。例如，荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，选择本文所述的包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料的药物组合物。
[0214]
此外，本发明还揭示了存储计算机程序的计算机可读存储介质，存储介质上所存储的计算机程序运行后执行本文所述的鉴定癌症细胞代谢和功能亚群的方法或者选择治疗方案的方法。结合本文中公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可直接在硬件中、在由处理器执行的软件模块中、或在这两者的组合中体现。如果在软件中实现为计算机程序产品，则各功能可以作为一条或更多条指令或代码存储在计算机可读介质上或藉其进行传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，其包括促成计算机程序从一地向另一地转移的任何介质。存储介质可以是能被计算机访问的任何可用介质。作为示例而非限定，这样的计算机可读介质可包括ram、rom、eeprom、cd
‑
rom或其它光盘存储、磁盘存储或其它磁存储设备、或能被用来携带或存储指令或数据结构形式的合意程序代码且能被计算机访问的任何其它介质。示例性存储介质耦合到处理器以使得该处理器能从/向该存储介质读取和写入信息。在替换方案中，存储介质可以被整合到处理器。处理器和存储介质可驻留在asic中。asic可驻留在用户终端中。在替换方案中，处理器和存储介质可作为分立组件驻留在用户终端中。
[0215]
因此，上述选择治疗方案的方法可通过装置实现，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：(1)在癌细胞中引入或表达seq id no:23
‑
28中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
‑
488nm激发所产生的荧光强度的比率，(2)荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，选择本文所述的药物组合物，包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料。
[0216]
发明人利用遗传编码nadh/nad 探针sonar的转基因工具鼠，发现急性淋巴细胞白血病b
‑
all细胞主要以氧化磷酸化作为其主要能源。sonar低的b
‑
all细胞具有增强的线粒体呼吸能力，倾向于驻留在血管壁中，并且比sonar高的细胞中的功能性白血病起始细胞(b
‑
all干细胞)富集更多。sonar低的细胞比sonar高的细胞对急性白血病一线用药ara
‑
c具有抵抗力。进一步研究显示，sonar低的人原代b
‑
all细胞也偏爱氧化磷酸化，并且对ara
‑
c处理有抵抗力。用药物抑制氧化磷酸化作用，无论在体内还是体外，都能很好减弱ara
‑
c诱导的耐药性。本发明为理解代谢特性与b
‑
all细胞的命运决定之间的潜在联系以及开发针对癌症耐药性的治疗策略提供了有效的工具。
[0217]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室指南(newyork：coldspringharbor laboratorypress，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0218]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0219]
实施例
[0220]
i.实验材料和试剂
[0221]
实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简
·
罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；费雷谢尼等的《动物细胞培养:基本技术指南》(第五版)，章静波，徐存拴等译；j.s.博尼费斯农，m.达索等的《精编细胞生物学实验指南》，章静波等译。
[0222]
所有用于pcr的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的taq dna聚合酶购自东盛生物，pfu dna聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，primestar dna聚合酶购自takara公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dntp。限制性内切酶、t4连接酶、t4磷酸化酶(t4 pnk)购自fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。转染试剂lip2000 kit购于invitrogen公司。除非特别声明，无机盐类等化学试剂均购自sigma
‑
aldrich公司。hepes盐，氨苄青霉素(amp)和嘌呤霉素购自ameresco公司。96孔检测黑板、384孔荧光检测黑板购自grenier公
司。实施例中所用的dna纯化试剂盒购自bbi公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株mach1购自invitrogen公司。镍柱亲和层析柱和脱盐柱填料均来自ge healthcare公司。
[0223]
实施例中用到的主要仪器包括：bd aria2流式细胞分选仪、biotek synergy 2多功能酶标仪(美国bio
‑
tek公司)，pcr扩增仪(德国biometra公司)，超声破碎仪(宁波新芝公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)。
[0224]
抗体：抗磷酸creb抗体(abway)，抗creb抗体(abway)，抗cda抗体(abclonal)，抗pdhx抗体(abclonal)，抗β
‑
actin抗体(mbl)。
[0225]
引物和shrna：根据各蛋白的基因序列以常规方法设计引物和shrna。
[0226]
示例性的引物包括sonar
‑
f：seq id no:17，sonar
‑
r：seq id no:18，pdhx
‑
f：seq id no:19，pdhx
‑
r：seq id no:20，cda
‑
f：seq id no:21，cda
‑
r：seq id no:22。
[0227]
shrna序列靶向序列如下表所示：
[0228]
shrna靶序列mouse shpdhx#1seq id no:1mouse shpdhx#2seq id no:2mouse shpdhx#3seq id no:3human shpdhx#1seq id no:4human shpdhx#2seq id no:5human shpdhx#3seq id no:6mouse shcreb#1seq id no:7mouse shcreb#2seq id no:8mouse shcreb#3seq id no:9mouse shcda#1seq id no:10mouse shcda#2seq id no:11mouse shcda#3seq id no:12human shcda#1seq id no:13human shcda#2seq id no:14human shcda#3seq id no:15
[0229]
ii.分子生物学方法和细胞实验方法
[0230]
聚合酶链式反应(pcr)、核酸内切酶酶切反应、目的片段和载体的连接反应等常规操作遵照《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)。dna核酸抽取按照试剂盒说明，rna抽提采用trizol试剂。反转录反应使用6核苷酸随机引物，qpcr使用sybr green染料，反应40个循环，并进行溶解曲线测试产物单一性。免疫印迹根据蛋白分子量大小使用6
‑
15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电流法把蛋白转移到pvdf膜。5％脱脂奶粉封闭，按一定比例稀释抗体后显色。
[0231]
所有白血病细胞在gibco公司imdm培养液中，2％胎牛血清，置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。慢病毒或者逆转录病毒感染细胞时800g离心1小时，然后在37℃孵育。细胞增殖实验使用thermo
‑
fisher细胞计数仪进行计数。流式细胞分析抗体在4℃孵育15分钟到60分钟。
[0232]
iii.动物实验方法
[0233]
sonar转基因动物
[0234]
pcr扩增sonar探针(seq id no:27)的dna编码序列，插入pcag载体。线性化打靶载体纯化后微注射到fvb品系囊胚。sonar dna随机整合到基因组，pcr方法鉴定基因型，通过荧光显微镜或者流式细胞仪检测sonar蛋白在各组织的的表达。fvb小鼠与c57bl/6品系小鼠回交，杂合子小鼠用于本实验。基因型鉴定采取外周血细胞dna，引物为seq id no:17
‑
18。免疫缺陷小鼠和c57bl/6小鼠从斯莱克动物中心购买。所有动物实验遵循华东理工大学和上海交通大学实验动物伦理要求。
[0235]
建立和分析急性b淋巴细胞白血病小鼠模型
[0236]
逆转录病毒载体mscv
–
n
‑
myc
–
ires
‑
mcherry或者mscv
–
bcr
‑
abl
–
p190
‑
ires
‑
mcherry用于包装逆转录病毒，然后感染小鼠胎儿肝脏sonar阳性的细胞，20万个感染细胞注射到通过辐照杀灭淋巴细胞的c57bl/6受体小鼠。通过检测外周血mcherry阳性细胞的数量监测白血病的发展。sonar
‑
低和sonar
‑
高的白血病细胞或者b220与cd43阳性同时igm与igd阴性的白血病起始细胞用于代谢和移植分析。采用有限稀释方法确定白血病起始细胞频率，其中骨髓来源的sonar
‑
低和sonar
‑
高的白血病细胞与20万个竞争细胞共移植到淋巴细胞辐照灭活小鼠。药物抵抗实验中，1微摩尔浓度的ara
‑
c药物处理移植用的细胞24小时。移植到受体小鼠后记录白血病小鼠的总存活率，然后才有stemcell技术公司的l
‑
calc软件技术白血病起始细胞频率。使用慢病毒介导表达双链干扰rna，用来敲低pdhx，cda或者creb基因，感染的靶细胞包括小鼠n
‑
myc
–
mcherry阳性的白血病细胞、小鼠急性b淋巴细胞白血病细胞系tib205、人类急性b淋巴细胞白血病细胞系nalm6 cells/sup
‑
b15cells/reh cells、或者人类原代急性b淋巴细胞白血病细胞。移植实验使用1万个小鼠骨髓来源白血病细胞、500万个tib205细胞、200万个nalm6细胞、或者500万个人类原代急性b淋巴细胞白血病细胞。
[0237]
实施例1：sonar探针区分急性b淋巴细胞白血病细胞代谢和功能亚群
[0238]
sonar探针在小鼠急性b淋巴细胞性白血病中表达后，根据探针荧光比率f405/f488，细胞可分成sonar
‑
高、sonar
‑
中、sonar
‑
低三个亚群(图1，a)。相比于sonar
‑
sonar
‑
高的细胞(图1，b)，sonar
‑
低的细胞亚群具有较高的atp水平(图1，c)、线粒体膜电势(图1，d)、氧气消耗率(图1，e，f)，线粒体dna拷贝数较高(图1，g)，同时糖酵解与乳酸分泌水平没有统计显著性的差别(图1，h,i,j)。使用
13
c标记的葡萄糖培养sonar
‑
高和sonar
‑
低的细胞亚群，并高效液相色谱
‑
质谱联用测定细胞的代谢物，结果表明sonar
‑
低的细胞中，13c标记的三羧酸循环中间代谢物包括柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸等均比sonar
‑
高细胞群的要多数十倍到数百倍，而糖酵解中间产物包括6
‑
磷酸葡萄糖、丙酮酸、乳酸等没有差别(图1，k,l)，说明sonar
‑
低细胞摄取外源葡萄糖后的代谢产物进入线粒体，显著增强三羧酸循环和氧化磷酸化途径的代谢。
[0239]
与sonar
‑
高的细胞相比，sonar
‑
低的细胞具有明显不同的成瘤能力。把两种细胞亚群接种免疫缺陷小鼠后，接种sonar
‑
低细胞的小鼠生存期显著缩短(图1，m)。给每只实验小鼠接种100
‑
1000个细胞后，接种sonar
‑
低细胞的小鼠发生肿瘤细胞克隆增殖的比例更高，表明sonar
‑
低细胞亚群中白血病起始细胞占比1/306，而在sonar
‑
高细胞亚群中只占比1/1393(图1，n)。从急性b淋巴细胞性白血病患者中获取白血病细胞样本，体外培养时表达
sonar探针并接种免疫缺陷小鼠，同样发现sonar
‑
低的细胞使荷瘤小鼠生存周期更短(图1，o，p，q)。因此利用sonar探针可以指示急性b淋巴细胞性白血病代谢状态和病理功能。
[0240]
实施例2：sonar
‑
低细胞亚群中pdhx等基因表达上调促进线粒体代谢
[0241]
微芯片检测急性b淋巴细胞性白血病的转录组，sonar
‑
低的细胞亚群中表达上调的基因在氧化磷酸化代谢途径中富集(图2，a)。定量pcr检测线粒体内丙酮酸脱羧、三羧酸循环和氧化磷酸化代谢相关基因的表达，显示这三个代谢途径的基因都表达上调，其中丙酮酸脱氢酶复合物成员基因pdhx表达升高最显著(图2，b)。使用shrna可以在急性b淋巴细胞性白血病细胞中沉默敲低pdhx基因(图2，c，d，e)，敲低pdhx基因降低线粒体耗氧量(图2，f)，增加乳酸分泌量(图2，g)。敲低pdhx基因的b
‑
all细胞或对照细胞接种免疫缺陷小鼠后，pdhx敲低小鼠组比对照组生存期显著延长(图2，h，i)。
[0242]
实施例3：sonar
‑
低细胞亚群中cda基因介导了对急性b淋巴细胞白血病的治疗药物阿糖胞苷ara
‑
c的耐药性
[0243]
使用治疗急性b淋巴细胞白血病的药物阿糖胞苷ara
‑
c处理sonar
‑
低的肿瘤细胞，使得sonar荧光比率下降(图3，a)。sonar
‑
低的急性b淋巴细胞白血病细胞亚群比sonar
‑
高的细胞亚群对ara
‑
c的药物抵抗增强(图3，b)。检测参与ara
‑
c的药物运输和分解代谢基因的表达，显示sonar
‑
低的细胞亚群比sonar
‑
高的亚群cda基因表达更高(图3，c)。使用shrna敲低cda基因的表达，然后把细胞接种到免疫缺陷小鼠，发现对于ara
‑
c的治疗，cda敲低组比对照组小鼠生存期明显延长(图3，d
‑
g)。
[0244]
实施例4：creb磷酸化增强sonar
‑
低细胞亚群中pdhx的转录
[0245]
免疫印迹实验表明sonar
‑
低的急性b淋巴细胞白血病细胞亚群的转录增强因子creb磷酸化比sonar
‑
高的细胞亚群更高(图4，a)。使用shrna敲低creb的表达，pdhx和cda基因的表达明显下降(图4，b，c)，而creb敲低的白血病细胞的荷瘤小鼠比对照组小鼠的生存期显著延长(图4，d)。
[0246]
实施例5：线粒体代谢抑制药物或creb抑制剂与阿糖胞苷ara
‑
c联合用药增强急性b淋巴细胞性白血病的治疗效果
[0247]
转录增强因子creb的抑制剂666
‑
15可以增强阿糖胞苷ara
‑
c抑制人急性b淋巴细胞白血病细胞增殖的效果(图5，a)。即使对阿糖胞苷ara
‑
c耐药的人急性b淋巴细胞白血病细胞系，666
‑
15同样可以增强肿瘤细胞抑制作用(图5，b)。阿糖胞苷ara
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c和白血病治疗药物维奈托克venetoclax联用可剂量依赖性地增强ara
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c的细胞增殖抑制效果(图5，c，d)。而且，糖尿病治疗药物二甲双胍metformin或者小檗碱berberine也可剂量依赖性地增强ara
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c的细胞增殖抑制效果(图5，e，f，g)。维奈托克、二甲双胍、小檗碱三种药物之中的任何一种与ara
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c联用，都比单独使用ara
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c治疗急性b淋巴细胞白血病荷瘤小鼠效果更好，生存期延长(图5，h，i)。

技术特征：
1.线粒体代谢抑制剂在制备治疗癌症的药物中的用途，所述线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂，所述癌症是其中三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)增强的癌症，优选地，所述用途还具有选自以下的一项或多项特征：所述癌症是其中pdhx和/或creb的表达或活性增加的癌症，所述癌症是白血病，线粒体代谢抑制剂包括下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子，所述与pdhx和/或creb特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，所述抑制分子以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物，所述抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除pdhx和/或creb的试剂，例如sgrna，线粒体代谢抑制剂还可选自维奈托克、二甲双胍、小檗碱、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药。2.一种降低pdhx和/或creb的表达或活性的物质，所述物质含有式i所示的结构：seq
正向
‑
x
‑
seq
反向
ꢀꢀꢀ
式i，式i中，seq
正向
为识别pdhx和/或creb编码序列的多核苷酸，seq
反向
为与seq
正向
反向互补的多核苷酸；x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq
正向
和seq
反向
不互补，优选地，seq
正向
包含seq id no:1
‑
9中任一所示序列。3.一种药物组合物，包含权利要求2中所述的降低pdhx和/或creb的表达或活性的物质和药学上可接受的辅料。4.检测线粒体代谢强度的试剂在制备癌症诊断试剂盒或癌症细胞代谢和功能亚群鉴定试剂盒中的用途，所述检测线粒体代谢强度的试剂包括检测三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度的试剂，优选地，检测线粒体代谢的试剂包括检测pdhx和/或creb的表达或活性的试剂，更优选地，检测pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：(1)靶向pdhx和/或creb或其转录本的引物或探针，或(2)特异性结合pdhx和/或creb的抗体或配体。5.癌症诊断试剂盒或癌症细胞代谢和功能亚群鉴定试剂盒，包含检测线粒体代谢强度的试剂，所述检测线粒体代谢强度的试剂包括检测三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)强度的试剂，优选地，所述试剂盒还具有选自以下的一项或多项特征：检测线粒体代谢的试剂包括检测pdhx和/或creb的表达或活性的试剂，检测pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：(1)靶向pdhx和/或creb或其转录本的引物或探针，或(2)特异性结合pdhx和/或creb的抗体或配体，
所述试剂盒还包含rt
‑
pcr所需试剂，例如反转录酶、rna提取试剂、核酸聚合酶，dntp，pcr缓冲液等，所述试剂盒还包含northern所需试剂，例如rna提取试剂、核糖核酸酶抑制剂、northern缓冲液等，所述试剂盒还包含western所需试剂，例如蛋白提取试剂、丙烯酰胺、异硫氰酸胍、tris、sds、temed等。6.阿糖胞苷与线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症是其中三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)增强的癌症，优选地，所述用途还具有选自以下的一项或多项特征：所述癌症是其中pdhx和/或creb和/或cda的表达或活性增加的癌症，所述癌症是其中cda的表达或活性增加的癌症，所述癌症是对阿糖胞苷有耐药性的癌症，所述癌症是白血病，线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂，线粒体代谢抑制剂包括下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子，所述与pdhx和/或creb特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除pdhx和/或creb的试剂，例如sgrna，线粒体代谢抑制剂选自维奈托克(venetoclax)、二甲双胍(metformin)和小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药，下调cda的表达或活性的试剂包括：与cda特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子，所述与cda特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子以cda基因或其转录本作为抑制靶标，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除cda的试剂，例如sgrna。7.降低cda的表达或活性的物质，所述物质含有式i所示的结构：
seq正向
‑
x
‑
seq反向式i，式i中，seq正向为识别cda编码序列的多核苷酸，seq反向为与seq正向反向互补的多核苷酸；x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补，优选地，seq正向包含seq id no:10
‑
15中任一所示序列。8.一种药物组合物，包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料，优选地，所述药物组合物还具有选自以下的一项或多项特征：线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂，线粒体代谢抑制剂包括减弱三羧酸循环(tca)或电子传递链(etc)的试剂，线粒体代谢抑制剂包括下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂，下调pdhx和/或creb的表达或活性的试剂包括：与pdhx和/或creb特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子，所述与pdhx和/或creb特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子以pdhx和/或creb基因或其转录本作为抑制靶标，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物，所述特异性干扰pdhx和/或creb基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除pdhx和/或creb的试剂，例如sgrna，线粒体代谢抑制剂选自维奈托克(venetoclax)、二甲双胍(metformin)和小檗碱(berberine)、creb抑制剂666
‑
15或其药学上可接受的盐、异构体、外消旋物、溶剂合物或前药，下调cda的表达或活性的试剂包括：与cda特异性结合的抗体或配体；或特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子，所述与cda特异性结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子以cda基因或其转录本作为抑制靶标，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、rnai、dsrna、sgrna或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物，所述特异性干扰cda基因转录和/或表达的抑制分子是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲低或敲除cda的试剂，例如sgrna，特异性干扰pdhx、creb、或cda基因转录和/或表达的抑制分子是shrna或其核酸构建物，所述构建物含有式i所示的结构：seq
正向
‑
x
‑
seq
反向
ꢀꢀꢀ
式i，式i中，seq
正向
为识别pdhx、creb、或cda基因或其转录本的多核苷酸，seq
反向
为与seq
正向
反
向互补的多核苷酸；x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq
正向
和seq
反向
不互补，seq
正向
包含seq id no:1
‑
15中任一所示序列。9.一种区分癌症细胞代谢和功能亚群的方法，包括在癌细胞中引入或表达seq id no:23
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28中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
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420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
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488nm激发所产生的荧光强度的比率，优选地，所述方法还具有选自以下的一项或多项特征：荧光强度的比率越小，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢越强、成瘤能力越强、患者生存期越短，荧光强度的比率小于或等于约1.0时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢强、成瘤能力强、患者生存期短；荧光强度的比率大于或等于约1.0时，所述癌症细胞的三羧酸循环和/或氧化磷酸化途径的代谢弱、成瘤能力弱、患者生存期长，所述癌症是白血病。10.一种选择治疗方案的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：(1)在癌细胞中引入或表达seq id no:23
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28中任一条所示的探针并检测探针的荧光强度或荧光强度比率，特别是受405nm
‑
420nm激发所产生的荧光强度与受485nm
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488nm激发所产生的荧光强度的比率，(2)荧光强度的比率小于或等于约1.0(例如小于或等于约0.9、0.8、0.7、0.6、0.5)时，选择药物组合物，所述药物组合物包含：(1)阿糖胞苷，(2)线粒体代谢抑制剂和/或下调cda的表达或活性的试剂，和(3)药学上可接受的辅料，优选地，所述装置还具有选自以下的一项或多项特征：所述癌症是白血病，所述药物组合物如权利要求8所述。
技术总结
本发明涉及阿糖胞苷、线粒体代谢抑制剂和下调CDA的表达或活性的试剂在治疗癌症中的用途。途。


技术研发人员：赵玉政 郑俊克 杨弋 陈迟琪 李写 李婷 张卓
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2021.03.10
技术公布日：2021/6/24