草欧菌素A在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用的制作方法

草欧菌素a在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及农药科学技术领域，尤其涉及草欧菌素a在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用。


背景技术：

2.小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的重要病原菌之一，其侵染性、繁殖力及适应性均很强，严重威胁小麦生产。在自然界，f.graminearum常分布于大田中、植物残体中，在植物残体中会以子囊壳的形式越冬，在来年春天，子囊壳作为初侵染源，在适宜的条件下萌发，侵染开花期的小麦穗部，完成再侵染循环。被侵染的小麦在前期并无明显症状，随着病情的扩展，禾谷镰刀菌会在小麦穗部形成粉红色霉层。
3.该病害首次于20世纪90年代在美国中西部被发现报道，目前已在中国多个小麦主产区发生较为严重，并伴有扩散趋势。由于中国小麦产区的开花扬花期多为高温高湿的气候条件，这为小麦赤霉病菌(f.graminearum)的生长、繁殖和扩散创造了有利的条件。
4.目前，市场上防治小麦赤霉病病害的农药主要有三唑类(sbi)、苯并咪唑和2
‑
氰烯丙烯酸酯等，例如：戊唑醇，多菌灵和氰烯菌酯等。但是随着药物抗性的出现，需要新型药物对对抗病原真菌出现的药物抗性。
5.因此，有必要对该小麦赤霉病的拮抗药物做进一步研究，并对草欧菌素的抗菌谱进行了鉴定。


技术实现要素：

6.本发明提供了草欧菌素a在防治小麦赤霉病、水稻稻瘟病、番茄灰霉病等植物病原真菌以及白色念珠菌(candida albicans)和烟曲霉(aspergillus fumigatus)等人体致病菌的新用途，具有较好的广谱性，防治效果好，拓宽了草欧菌素a的应用范围。
7.具体技术方案如下：
8.本发明提供了草欧菌素a在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：
[0009][0010]
进一步地，所述小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)引起。
[0011]
本发明还提供了草欧菌素a在制备防治水稻稻瘟病药剂中的应用，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：
[0012][0013]
进一步地，所述水稻稻瘟病主要由稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)引起。
[0014]
本发明还提供了草欧菌素a在制备防治番茄灰霉病药剂中的应用，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：
[0015][0016]
进一步地，所述番茄灰霉病主要由灰霉病菌(botrytis cinerea)引起。
[0017]
本发明还提供了草欧菌素a在抑制禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、白色念珠菌(candida albicans)和/或烟曲霉(aspergillus fumigatus)中的应用；所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：
[0018][0019]
草欧菌素a为脂肽类化合物，有苏氨酸，d
‑
苏氨酸，d
‑
亮氨酸，谷氨酸，d
‑
谷氨酰胺，谷氨酸，l
‑
甲基化亮氨酸，精氨酸，形成环肽，再和c14的长链脂肪酸相连，外加一份子葡萄糖与脂肪酸相连。
[0020]
本发明发现了草欧菌素a对于不同植物病原真菌的半最大效应浓度，测定了不同植物病原真菌对于草欧菌素a的敏感性的差异。此外，草欧菌素a的物理性质是两亲类化合物，存在的多元环肽和葡萄糖分子具有亲水性特质，而局部的长链脂肪酸则具有亲脂性质，因此两者结合在一起，草欧菌素a具有两亲特质。当草欧菌素化合物的浓度为5μm时，菌丝的
生长抑制能达到85％以上；当处理浓度升至10μm时，菌丝基本不生长。因此，草欧菌素化合物可以用来防治小麦赤霉病，抑制病菌的生长。并且该化合物，具有良好的广谱性，对于多种病菌都有较好的防治效果。
[0021]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022]
本发明不仅发现了草欧菌素a在防治禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病的用途外，还发现了草欧菌素a在防治水稻稻瘟病、番茄灰霉病等植物病原真菌以及白色念珠菌(candida albicans)和烟曲霉(aspergillus fumigatus)等人体致病菌的新用途，表明草欧菌素a作为防治药剂具有良好的广谱性，对于多种病菌都有较好的防治效果，具有很好的药物潜力。
附图说明
[0023]
图1为草欧菌素a对于禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的抑制效果；
[0024]
其中，a为草欧菌素a对于禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)在pda(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)的抑菌效果；b为草欧菌素a对于禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)在yepd(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)液体培养基中的抑菌效果。
[0025]
图2为草欧菌素a对于不同植物真菌的ec
50
值；
[0026]
其中，a.a表示alternaria alternata,(链格孢菌)a.f表示aspergillus flavus(黄曲霉,b.c表示botrytis cinerea(灰霉病菌),c.g表示colletotichum gloeospori(茶炭疽病菌),m.o表示magnaporthe oryzae(稻瘟病菌),s.s表示sclerotinia sclerotiorum(核盘病菌)。
[0027]
图3为草欧菌素a对灰葡萄孢(botrytis cinerea)番茄果实的防效实验；
[0028]
其中，图a是botrytis cinereal侵染果实的原始图；图b是草欧菌素a抑制botrytis cinereal在番茄果实上的侵染面积的统计图；图中显示的浓度是对应草欧菌素(ha)的浓度；dmso被作为阴性对照。
[0029]
图4为草欧菌素a对灰葡萄孢(botrytis cinerea)草莓叶的防效实验；
[0030]
其中，图a是botrytis cinerea侵染草莓叶子的原始图；图b是草欧菌素a抑制botrytis cinereal在草莓叶子上的侵染面积的统计图；图中显示的浓度是对应草欧菌素(ha)的浓度；dmso被作为阴性对照。
[0031]
图5为草欧菌素a对灰葡萄孢(botrytis cinerea)孢子抑制效果实验；
[0032]
图中显示的浓度是对应草欧菌素(ha)的浓度。dmso被作为阴性对照。图a为dmso阴性对照；图b为2μg/ml ha。
[0033]
图6为草欧菌素a对大麦叶稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)的防效实验；
[0034]
其中，图a是magnaporthe oryzae侵染大麦叶子的原始图；图b是草欧菌素a抑制magnaporthe oryzae在草莓叶子上的侵染的统计图；图中显示的浓度是对应草欧菌素(ha)的浓度；dmso被作为阴性对照。
[0035]
图7为草欧菌素a对大麦叶稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)附着胞形成的抑制效果实验。图a为dmso阴性对照；图b为5μg/ml草欧菌素a ha。
[0036]
图8为草欧菌素a，两性霉素，氟康唑对aspergillus fumigatus的浓度—抑制曲线对比。草欧菌素(ha)，两性霉素(amp b)，氟康唑(flu)。曲线纵坐标代表抑制比例，横坐标表
示着浓度。
[0037]
图9为草欧菌素a，两性霉素，氟康唑对candida albicans的od
600
生长曲线对比。草欧菌素(ha)，两性霉素(amp b)，氟康唑(flu)。曲线纵坐标代表od
600
数值，横坐标表示时间。
[0038]
图10为禾谷镰刀菌的抗性菌株对于草欧菌素a的敏感性检测；
[0039]
其中，pda表示马铃薯葡萄糖琼脂培养基；carb表示马铃薯葡萄糖琼脂培养基添加了5μg/ml多菌灵；flud表示马铃薯葡萄糖琼脂培养基添加了5μg/ml咯菌腈；phen表示马铃薯葡萄糖琼脂培养基添加了5μg/ml氰烯菌酯；ha表示马铃薯葡萄糖琼脂培养基添加了5μg/ml草欧菌素a(ha)；ph
‑
1表示禾谷镰刀菌野生型；carb
‑
rs表示禾谷镰刀菌的多菌灵抗性菌株；flu
‑
rs表示禾谷镰刀菌的咯菌腈抗性菌株；js
‑
rs表示禾谷镰刀菌的氰烯菌酯抗性菌株。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
[0041]
实施例1草欧菌素a化合物对禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的抑制作用
[0042]
将fusarium graminearum接种到pda培养基上，在25c培养3天。挑取fusarium graminearum带菌丝的菌块，接种到含不同浓度草欧菌素a的pda平板，在25℃培养3天之后测量菌丝长度。
[0043]
将带gfp标记的fusarium graminearum接种到yepd培养基上，在25℃培养3天，180rpm。再在yepd培养基加入不同浓度的ha处理相应时间之后，使用活死染色试剂盒进行计数。绿色为活细胞，红色或者黄色为死细胞。之后统计对应的活细胞比例。
[0044]
结果如图1所示，在平板上草欧菌素a(ha)的ec
50
＝1.72μg/ml。而在液体中，草欧菌素a(ha)的抑制效果更加显著，在1μg/ml的浓度处理1小时之后，能有效的抑制禾谷镰刀菌的生长。
[0045]
实施例2草欧菌素a对于不同植物病原菌的半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect)的检测
[0046]
将不同的植物病原真菌接种到pda固体培养基中，25℃培养3天之后，将带菌丝的植物病原真菌接种到含有不同浓度草欧菌素a的pda平板中，因为不同菌在pda上的生长速度不一致，根据未加药的平板的野生型长满平板为准，进行实验结果的记录。
[0047]
如图2所示，草欧菌素a对于多种植物病原真菌有拮抗效果，并且其中对于灰霉和黄曲霉的抑制效果比较好，其他的植物病原菌的抑制效果相差不大。
[0048]
实施例3草欧菌素a对于灰葡萄孢(botrytis cinerea)的抑制作用
[0049]
1、草欧菌素a对botrytis cinerea于番茄果实的防效实验
[0050]
将b.cinerea接种到pda培养基上，在25℃培养3天，12h光照，12h黑暗。70％的无水乙醇对番茄果实进行简单的消毒之后，草欧菌素a处理番茄果实的表面1h之后，去除多余的水分，使用无菌牙签在番茄上表层形成小伤口，然后挑取带b.cinerea的菌丝的菌块接种于伤口上。用保鲜膜进行密封保湿处理，底部用滤纸进行保湿，在25℃培养3天后，看接种部分的发病情况。
[0051]
如图3所示，草欧菌素a能明显抑制botrytis cinerea于番茄果实的侵染。在2μg/
ml草欧菌a抑制效果超过80％。
[0052]
2、草欧菌素a对botrytis cinerea草莓叶的防效实验
[0053]
将b.cinereal接种到pda培养基上，在25℃培养5天，12h光照，12h黑暗。之后用无菌水将培养基上botrytis cinerea的孢子洗脱下来，然后用三层滤纸过滤，5000rpm离心之后，用无菌水重新悬浮，终浓度是1
×
105cfu/ml。70％的无水乙醇对草莓叶子进行简单的消毒之后，草欧菌素和灰霉孢子充分混合之后，接种于草莓叶上。用保鲜膜进行密封保湿处理，底部用滤纸进行保湿，在25℃培养3天后，看接种部分的发病情况。
[0054]
如图4所示，草欧菌素a能明显抑制botrytis cinerea于草莓叶片的侵染。这与番茄果实的结果相似。
[0055]
3、草欧菌素a对botrytis cinerea孢子萌发实验
[0056]
将b.cinerea接种到pda培养基上，在25℃培养5天，12h光照，12h黑暗。之后用无菌水将培养基上botrytis cinerea的孢子洗脱下来，然后用三层滤纸过滤，5000rpm离心之后，用无菌水重新悬浮，终浓度是3
×
105cfu/ml。70％的无水乙醇对草莓叶子进行简单的消毒之后，草欧菌素a和灰霉孢子充分混合之后，接种于草莓叶上。用保鲜膜进行密封保湿处理，底部用滤纸进行保湿，在25℃培养3天后，看接种部分的发病情况。
[0057]
如图5所示，草欧菌素a能明显抑制botrytis cinerea孢子的萌发，在5μg/ml草欧菌a处理之后，孢子基本不萌发。
[0058]
实施例4草欧菌素a对稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)的防效试验
[0059]
1、草欧菌素a对于magnaporthe oryzae的大麦叶片防效实验
[0060]
将magnaporthe oryzae接种到cmc培养基上，在25℃培养9天，12h光照，12h黑暗。之后用无菌水将培养基上botrytis cinerea的孢子洗脱下来，然后用三层滤纸过滤，5000rpm离心之后，用无菌水重新悬浮，终浓度是1x 105cfu/ml。选取长势和长度相似的大麦叶片，至于底部具有润湿的滤纸的容器中，将不同浓度的草欧菌素a和稻瘟孢子充分混匀，之后又选取20μl的孢子滴到大麦叶子上。在25℃光照培养箱中12h光照，12h黑暗，培养4天之后，观察接种位点的侵染状况。每个叶子有三个重复，每个要浓度进行至少5个叶片的重复。
[0061]
如图6所示，草欧菌素a能明显抑制magnaporthe oryzae于大麦叶片上的侵染。在5μg/ml草欧菌a处理之后，magnaporthe oryzae的侵染能力显著下降。
[0062]
2、草欧菌素a对magnaporthe oryzae附着胞形成实验
[0063]
magnaporthe oryzae接种到pda培养基上，在25c培养5天，12h光照，12h黑暗。之后用无菌水将培养基上magnaporthe oryzae的孢子洗脱下来，然后用三层滤纸过滤，5000rpm离心之后，用无菌水清洗2遍之后，再用无菌水重新悬浮，终浓度是3x 105cfu/ml。取40μl孢子滴到塑料载玻片上，或者是疏水聚碳酸酯膜上。之后放置于湿盒中，并于25℃黑暗条件下培养12h。最后在显微镜下观察附着胞的形态和是否形成附着胞。
[0064]
如图7所示，草欧菌素a能明显抑制magnaporthe oryzae附着胞的形成。在5μg/ml草欧菌a处理之后，magnaporthe oryzae不再产生附着胞结构。
[0065]
实施例5草欧菌素a，两性霉素，氟康唑对烟曲霉(aspergillus fumigatus)的抑制试验
[0066]
将aspergillus fumigatus接种到yes培养基上，在25c培养6天，12h光照，12h黑
暗。之后将不同浓度的草欧菌a加入到新的yes琼脂培养基中，将带菌丝和孢子的烟曲霉琼脂块接种到含有草欧菌素a的yes培养基中，在25c培养6天，12h光照，12h黑暗。6天之后统计菌丝的生长大小。
[0067]
如图8所示，相对于两性霉素，氟康唑，草欧菌素a对于aspergillus fumigatus具有更加好的抑制效果。
[0068]
实施例6草欧菌素a，两性霉素，氟康唑对于白色念珠菌(candida albicans)的抑制实验
[0069]
candida albicans白色念珠菌接种到ypda培养基上，在25c培养2天。之后使用无菌牙签蘸取菌体之后，接种到ypda液体培养基中进行过夜培养。在第二天，按照1:1000的接种比例，接种到含有不同浓度草欧菌素a，氟康唑，两性霉素的ypda培养基中，充分混匀之后，吸取1ml的培养基到无菌的48孔板中。然后，用biotek cytation 5进行真菌的培养和不间断的od值的测量。培养条件为30℃，16h。
[0070]
如图9所示，相对于两性霉素，氟康唑，草欧菌素a对于candida albicans具有更加好的抑制效果。
[0071]
实施例7草欧菌素a对于禾谷镰刀菌的其他药物抗性菌株的药物抗性检测
[0072]
将禾谷镰刀菌的不同药物抗性菌株接种在pda培养基上，25℃培养3天之后。这里使用到了4种药物的抗性菌株，包括氰烯菌酯，多菌灵和咯菌腈的抗性菌株。之后将带菌丝的琼脂块接种到5种pda药物平板上和未加药的对照pda平板上，5种药物分别是氰烯菌酯，多菌灵，咯菌腈，草欧菌素a。接种之后的平板在25℃培养3天之后，进行实验拍照和记录。
[0073]
如图10所示，在禾谷镰刀菌中，草欧菌素a与其他药物不存在交叉抗性。

技术特征：
1.草欧菌素a在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用，其特征在于，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：2.如权利要求1所述的草欧菌素a在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用，其特征在于，所述小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)引起。3.草欧菌素a在制备防治水稻稻瘟病药剂中的应用，其特征在于，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：4.如权利要求3所述的草欧菌素a在制备防治水稻稻瘟病药剂中的应用，其特征在于，所述水稻稻瘟病主要由稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)引起。5.草欧菌素a在制备防治番茄灰霉病药剂中的应用，其特征在于，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：
6.如权利要求5所述的草欧菌素a在制备防治番茄灰霉病药剂中的应用，其特征在于，所述番茄灰霉病主要由灰霉病菌(botrytis cinerea)引起。7.草欧菌素a在抑制禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、白色念珠菌(candida albicans)和/或烟曲霉(aspergillus fumigatus)中的应用，其特征在于，所述草欧菌素a的化学结构式如式(i)所示：
技术总结
本发明公开了草欧菌素A在制备防治小麦赤霉病药剂中的应用。本发明不仅发现了草欧菌素A在防治禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病的用途外，还发现了草欧菌素A在防治水稻稻瘟病、番茄灰霉病等植物病原真菌以及白色念珠菌(Candida albicans)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等人体致病菌的新用途，表明草欧菌素A作为防治药剂具有良好的广谱性，对于多种病菌都有较好的防治效果，具有很好的药物潜力。很好的药物潜力。很好的药物潜力。


技术研发人员：陈云 马忠华 徐孙德 胡晋
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2021.03.29
技术公布日：2021/6/24